吳紫云，王海潔，孫嬋嬋，賀紅軍

（煙臺(tái)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東煙臺(tái) 264005）

海帶是世界上養(yǎng)殖最廣和消費(fèi)最多的食用褐藻，素有“海中蔬菜”之稱，含有多糖、肽、ω-3 脂肪酸、酚類物質(zhì)等豐富的生物活性化合物[1]，其營(yíng)養(yǎng)成分多、藥用價(jià)值高，我國(guó)的海帶總產(chǎn)量位居世界第一，海帶的養(yǎng)殖業(yè)是一個(gè)大規(guī)模的產(chǎn)業(yè)，且海帶深受亞洲人民的喜愛(ài)[2]。海帶多糖為一種硫化多糖，存在于褐藻中，研究表明，其具有抗腫瘤[3]、降血脂[4]、抗病毒[5]、免疫調(diào)節(jié)[6]等改善人類健康和賦予各種生理功能的潛力。因此，海帶多糖已成為開(kāi)發(fā)功能性食品和新型醫(yī)藥產(chǎn)品的重要來(lái)源[7]。目前，海帶多糖的提取方法有熱水浸提法[8]、超聲輔助提取法[9]、酶輔助提取法[10]等，但水提法耗能大，且得率低，酶法的生產(chǎn)成本高，酸提法酸度過(guò)高容易造成多糖的破壞。

巨噬細(xì)胞作為人體自身免疫系統(tǒng)中重要的一部分，其可維持組織形態(tài)，且具有監(jiān)視目標(biāo)生物體的破壞和趨化性等功能[11]。這些功能的多樣性取決于其對(duì)炎癥信號(hào)的差異性反應(yīng)，如脂多糖和一些γ 干擾素會(huì)誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞，使其產(chǎn)生M1 型極化，釋放大量的促炎因子[12]，而白細(xì)胞介素刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生M2型極化，使細(xì)胞因子得到釋放，發(fā)生炎癥的拮抗作用[13]。因此，激活巨噬細(xì)胞為抵抗疾病提供了一個(gè)新思路。

以鮮海帶為原料，通過(guò)超聲輔助法對(duì)海帶多糖進(jìn)行提取，再通過(guò)海帶多糖對(duì)巨噬細(xì)胞的黏附試驗(yàn)、細(xì)胞的增殖活力和細(xì)胞內(nèi)NO、ROS 的釋放，研究海帶多糖對(duì)巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

海帶，購(gòu)于煙臺(tái)萊山區(qū)海鮮市場(chǎng)；95%乙醇、無(wú)水乙醇，分析純，煙臺(tái)三和化學(xué)試劑有限公司提供；碳酸氫鈉、鹽酸、氫氧化鈉、氯化鈉，分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供；DMEM 培養(yǎng)基粉末、青霉素-鏈霉素混合溶液（100×雙抗），美國(guó)GIBCO 公司提供；胎牛血清培養(yǎng)基，浙江天杭生物科技有限公司提供；胰蛋白酶粉末、MTT 檢測(cè)試劑盒，北京biodee 公司提供；NO 檢測(cè)試劑盒，上海Beyotime 公司提供；二甲基亞砜、DCFH-DA，美國(guó)Sigma 公司提供。

1.2 儀器與設(shè)備

101-3 型電熱鼓風(fēng)干燥箱，龍口市先科儀器公司產(chǎn)品；JM-05D-40 型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；GTR16-2 型高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)，北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司產(chǎn)品；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司產(chǎn)品；DU800 型可見(jiàn)分光光度計(jì)，美國(guó)Beckman 公司產(chǎn)品；LGJ-10 型冷凍干燥機(jī)，北京松源華興科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品；Olympus IX 50 型倒置相差顯微鏡香港，MOTIC 公司產(chǎn)品；Thermo 3111 型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，日本三洋電器集團(tuán)產(chǎn)品；MS-TS 型電子分析天平，福州華志科技有限公司產(chǎn)品；LS-750 型液氮罐，泰來(lái)華頓公司產(chǎn)品；SW-CJ-1F 型生物超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司產(chǎn)品；MH-2 型微孔板孵育振蕩器，海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司產(chǎn)品；多功能酶標(biāo)儀，Molecular Device 公司產(chǎn)品；流式細(xì)胞儀，杭州艾森公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 超聲輔助法提取海帶粗多糖的單因素試驗(yàn)

稱取2 g 海帶粉末放入錐形瓶中，按照比例加入去離子水，放入超聲波中處理30 min，其中分別以料液比（1∶40～1∶80）、超聲溫度（40～80 ℃）、超聲功率（60～100 W）和提取次數(shù)（1～5 次）為變量。以轉(zhuǎn)速8 000 r/min 離心10 min，分離得到上清液。將海帶殘?jiān)韵嗤牧弦罕壤^續(xù)加入去離子水，重復(fù)以上步驟若干次。將上清液濃縮至一定體積，加入4 倍體積的無(wú)水乙醇。在4 ℃的溫度下醇沉12 h，離心，取其沉淀冷凍干燥，獲得粗多糖。

1.3.2 海帶多糖提取的響應(yīng)面優(yōu)化

以單因素試驗(yàn)的結(jié)果為基礎(chǔ)，選擇料液比、溫度和超聲功率為變量，進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)。

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平設(shè)計(jì)

1.3.3 海帶多糖對(duì)巨噬細(xì)胞的影響

采用邢麗[14]的方法，觀察不同組別不同視野中的細(xì)胞貼壁情況。采用MTT 法[15]測(cè)定海帶多糖對(duì)巨噬細(xì)胞增殖活力的影響。參考張?jiān)瞥热薣16]的方法，建立LPS 脂多糖模型，參考唐赫鵬等人[17]的方法，分別測(cè)定建立和不建立LPS 脂多糖模型細(xì)胞內(nèi)NO 的釋放量。采用DCFH-DA 法[18]測(cè)定海帶多糖對(duì)巨噬細(xì)胞內(nèi)活性氧釋放的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲輔助提取法提取海帶多糖的結(jié)果分析

2.1.1 變量因素對(duì)海帶多糖提取率的影響

變量因素對(duì)海帶多糖提取率的影響見(jiàn)圖1。

由圖1（a）可知，當(dāng)超聲功率為80 W，提取次數(shù)為3 次，料液比為1∶60 時(shí)，隨著提取溫度的升高，海帶多糖的提取率先升高，再緩慢下降。當(dāng)提取溫度為70 ℃時(shí)，海帶多糖的提取率達(dá)到最高。因此，選擇60，70，80 ℃進(jìn)行后續(xù)響應(yīng)面試驗(yàn)。

由圖1（b）可知，當(dāng)溫度為70 ℃，提取次數(shù)為3 次，超聲功率為80 W 時(shí)，隨著料液比的增大，多糖得率先升高再緩慢下降。當(dāng)料液比為1∶60 時(shí)，多糖的提取率達(dá)到最高。因此，選擇料液比為1∶50，1∶60，1∶70 進(jìn)行后續(xù)響應(yīng)面試驗(yàn)。

圖1 變量因素對(duì)海帶多糖提取率的影響

由圖1（c）可知，當(dāng)溫度為70 ℃，提取次數(shù)為3 次，料液比為1∶60 時(shí)，隨著超聲功率的增大，海帶多糖的提取率先升高再下降。當(dāng)超聲功率為90 W時(shí)，多糖的提取率達(dá)到最高。因此，選擇超聲功率80，90，100 W 進(jìn)行后續(xù)響應(yīng)面試驗(yàn)。

由圖1（d）可知，當(dāng)超聲功率為80 W，提取溫度為70 ℃，料液比為1∶60 時(shí)，隨著提取次數(shù)的升高，海帶多糖的提取率隨之升高。當(dāng)提取次數(shù)為3～5 次時(shí)，提取率的增加幅度很小，對(duì)海帶多糖提取率的作用效果不明顯，且提高了成本。因此，選擇提取次數(shù)為3 次。

2.1.2 響應(yīng)面法優(yōu)化海帶多糖的提取工藝

（1）響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果。以料液比、溫度和超聲功率為響應(yīng)變量，海帶多糖得率為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)（見(jiàn)表2），對(duì)表2 數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸擬合，建立工藝參數(shù)回歸模型。該模型的回歸方程為：

Box-behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 Box-behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 為超聲法提取海帶多糖響應(yīng)面模型的方差分析，響應(yīng)面模型中p 值的大小決定了該模型是否顯著，p 值越小，該模型越顯著[19]。由表3 可知，該模型的p 值小于0.001，說(shuō)明該模型達(dá)到極顯著性水平。從一次項(xiàng)的偏回歸系數(shù)可以得出，料液比對(duì)海帶多糖得率達(dá)到極顯著水平，提取溫度和超聲功率對(duì)海帶多糖的得率具有顯著性水平。從交互項(xiàng)可以看出，提取溫度和料液比之間的交互作用對(duì)海帶多糖提取率具有顯著性水平，提取溫度和超聲功率與料液比和超聲功率之間的交互作用對(duì)海帶多糖的得率均不具有顯著性。F 值可以判斷各因素對(duì)海帶多糖提取率的影響[19]。F 值的大小為料液比>超聲功率>提取溫度，即料液比對(duì)海帶多糖得率的影響最大，其次為超聲功率，最后是提取溫度。該模型失擬度的p 值為0.058 1（>0.05），說(shuō)明模型的擬合度比較好，可用于討論多糖的真實(shí)提取率。

回歸模型方差分析見(jiàn)表3，方程相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表4。

表3 回歸模型方差分析

由表4 可知，該模型的決定系數(shù)為0.984 6，模型的校正決定系數(shù)為0.964 8，模型的變異系數(shù)為3.55%，進(jìn)一步說(shuō)明了該模型的可靠性好。綜上得知回歸方程的擬合性比較高，可用于多糖提取率的預(yù)測(cè)。

表4 方程相關(guān)系數(shù)

（2）響應(yīng)面及等高線分析。通過(guò)軟件繪制提取率與試驗(yàn)因素的響應(yīng)面及等高線分析圖，其中響應(yīng)面圖中的縱坐標(biāo)為海帶多糖的提取率，橫坐標(biāo)分別為影響海帶多糖得率的試驗(yàn)因素。

變量因素對(duì)海帶多糖得率交互影響的響應(yīng)面圖見(jiàn)圖2。

圖2 變量因素對(duì)海帶多糖得率交互影響的響應(yīng)面圖

圖2 為兩個(gè)交互因素對(duì)多糖得率的影響，可知交互項(xiàng)對(duì)多糖得率的影響作用大小為AB>AC>BC，與表3 的結(jié)果一致。采用響應(yīng)面軟件對(duì)二次多元回歸方程求解，得知料液比、提取溫度和超聲功率的最適組合為料液比1∶63.72（mg∶mL），提取溫度67.73 ℃，超聲功率88.81 W，此時(shí)海帶多糖得率最高，達(dá)到17.88%。為了驗(yàn)證試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷挠行?，考慮到實(shí)際情況將最佳工藝條件修正為料液比為1∶64（mg∶mL），提取溫度為68 ℃，超聲功率為89 W。在此工藝條件下，進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)海帶多糖的得率為17.73%，與預(yù)測(cè)值無(wú)顯著性差異。以上結(jié)果說(shuō)明，該模型可以較好地預(yù)測(cè)海帶多糖的提取率。

目前，國(guó)內(nèi)外大量學(xué)者對(duì)海帶多糖的提取工藝進(jìn)行了探究。楊曉雪[20]采用復(fù)合酶法與水提法結(jié)合提取褐藻糖膠，通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化可知，當(dāng)復(fù)合酶比例關(guān)系為果膠酶∶α -淀粉酶∶酸性蛋白酶∶纖維素酶∶木聚糖酶的比為11∶1∶5∶18∶11，復(fù)合酶添加量為480 U/g，酶解溫度為59 ℃，pH 值為4.5，提取時(shí)間為10 h，料液比為1∶30（g∶mL）時(shí)，此時(shí)褐藻多糖的得率為12.04%。Lu J H 等人[21]采用檸檬酸法提取多糖，得知最佳條件為pH 值2，溫度120 ℃，時(shí)間3 h，此時(shí)多糖得率為13.31±0.08%。試驗(yàn)采用超聲輔助提取，得率顯著性高于其他提取工藝。

2.2 海帶多糖對(duì)巨噬細(xì)胞的影響

2.2.1 海帶多糖對(duì)RAW264.7 巨噬細(xì)胞貼壁能力的影響

海帶多糖對(duì)RAW264.7 巨噬細(xì)胞的貼壁能力的影響見(jiàn)圖3，不同質(zhì)量濃度海帶多糖對(duì)巨噬細(xì)胞增殖活力的影響見(jiàn)圖4。

圖3 海帶多糖對(duì)RAW264.7 巨噬細(xì)胞的貼壁能力的影響

圖4 不同質(zhì)量濃度海帶多糖對(duì)巨噬細(xì)胞增殖活力的影響

由圖3 可知，RAW264.7 巨噬細(xì)胞經(jīng)不同質(zhì)量濃度的海帶多糖處理后，其黏附作用沒(méi)有很大變化。與對(duì)照組相比，加入海帶多糖后，巨噬細(xì)胞由原來(lái)的圓形或者橢圓形分化為典型的梭狀，并呈現(xiàn)出一定的濃度依賴性。

通過(guò)MTT 法檢測(cè)海帶多糖對(duì)RAW264.7 巨噬細(xì)胞活力的影響。試驗(yàn)中，對(duì)海帶多糖設(shè)置了質(zhì)量濃度梯度，分別為50，100，200，300，400，500 μg/mL，每個(gè)濃度設(shè)置4 個(gè)重復(fù)。藥物質(zhì)量濃度處理細(xì)胞24 h 后，采用酶標(biāo)儀在570 nm 處讀取吸收值。由圖4 可知，海帶多糖對(duì)RAW264.7 巨噬細(xì)胞活力沒(méi)有明顯的抑制作用。Ji Young Lee 等人[22]研究發(fā)現(xiàn)加入海帶多糖之后對(duì)巨噬細(xì)胞的活力沒(méi)有明顯的抑制作用，說(shuō)明海帶多糖對(duì)巨噬細(xì)胞沒(méi)有毒性，與試驗(yàn)結(jié)果一致。

2.2.2 海帶多糖對(duì)RAW264.7 巨噬細(xì)胞NO、ROS釋放量的影響

不同質(zhì)量濃度海帶多糖對(duì)建立LPS 脂多糖模型NO 釋放量和巨噬細(xì)胞NO 和ROS 釋放量的影響見(jiàn)圖5。

由圖5（a）可知，相對(duì)于模型（LPS）組，LPS與海帶多糖復(fù)合組中NO 的釋放量隨著海帶多糖質(zhì)量濃度的升高也升高，且當(dāng)海帶多糖質(zhì)量濃度為500 μg/mL 時(shí)，其NO 的釋放量高于模型組的釋放量。由圖5（b）可知，加入不同濃度的海帶多糖會(huì)導(dǎo)致RAW264.7 巨噬細(xì)胞NO 釋放量呈依賴性增加。對(duì)照組中NO 的釋放量為2.34 μmol/L，當(dāng)海帶多糖質(zhì)量濃度為500 μg/mL 時(shí)，NO 的釋放量達(dá)到16.75 μmol/L，為對(duì)照組的7.16 倍，說(shuō)明海帶多糖可顯著提高巨噬細(xì)胞對(duì)NO 的釋放。

圖5 不同質(zhì)量濃度海帶多糖對(duì)建立LPS 脂多糖模型NO釋放量和巨噬細(xì)胞NO 和ROS 釋放量的影響

NO 是機(jī)體中不可或缺的生物活性分子，是非特異性宿主用來(lái)防御腫瘤和防止微生物入侵的重要活性物質(zhì)[23]。NO 在溶液中極易氧化成NO22-和NO33-，NO33-可通過(guò)鎘被還原為NO22-，在堿性條件下，NO22-和磺胺作用生成重氮鹽，與N-1-奈基乙二胺鹽酸進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)，生成有顏色的化合物，從而可以確定NO 的含量。余玲等人[24]研究發(fā)現(xiàn)，添加雷公藤紅素與吲哚美辛?xí)@著降低LPS 模型中NO 的釋放，說(shuō)明其具有較好的抗炎效果，與試驗(yàn)結(jié)果相反，說(shuō)明海帶多糖對(duì)巨噬細(xì)胞不產(chǎn)生抗炎作用。

由圖5（c）和圖5（d）可知，與對(duì)照組相比，加入不同質(zhì)量濃度的海帶多糖會(huì)導(dǎo)致RAW264.7 巨噬細(xì)胞總ROS 水平濃度依賴性的增加，其中海帶多糖質(zhì)量濃度為500 μg/mL 時(shí)，ROS 釋放量達(dá)到最多。CFH-DA 本身沒(méi)有熒光，是非標(biāo)記性的氧化敏感的熒光探針，其可以自由穿入細(xì)胞膜，當(dāng)DCFH-DA進(jìn)入細(xì)胞后，會(huì)被酯酶進(jìn)行水解，水解成為DCFH，但是DCFH 卻不能穿過(guò)細(xì)胞膜，因此可以把探針裝到細(xì)胞內(nèi)。且細(xì)胞內(nèi)的ROS 可以使不含熒光的DCFH 轉(zhuǎn)化為含有熒光的DCF，從而可以檢測(cè)出ROS 的釋放量。Schepetkin I A 等人[25]的試驗(yàn)表明，植物多糖可增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬、分泌活性，誘導(dǎo)其釋放NO 和ROS 等炎癥因子。Yon-Suk K 等人[23]和Cheng F 等人[26]的研究表明，多糖可促使MAPKs 和NF-κB 通路的相關(guān)蛋白發(fā)生磷酸化，從而活化MAPKs 和NF-κB 的通路，進(jìn)而使細(xì)胞分泌NO。當(dāng)有害物質(zhì)入侵時(shí)，會(huì)激活免疫反應(yīng)，釋放ROS 等炎癥因子[27]。

當(dāng)巨噬細(xì)胞當(dāng)受到外界的一些刺激時(shí)，會(huì)分化為促炎亞型（M1 巨噬細(xì)胞），或抗炎和組織修復(fù)亞型（M2 巨噬細(xì)胞），把這種分化的現(xiàn)象叫交替激活。M1 和M2 細(xì)胞在細(xì)胞表面受體、細(xì)胞和趨化因子的分布不同，并在炎癥反應(yīng)中的效應(yīng)作用相反[28]。當(dāng)細(xì)胞受到一定的刺激時(shí)，M1 巨噬細(xì)胞表現(xiàn)出促炎作用、釋放NO 和ROS 及增強(qiáng)微生物和殺瘤活性。與此相反，M2 巨噬細(xì)胞則表現(xiàn)出免疫抑制活性。在試驗(yàn)中，將海帶多糖作用于細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其可促使細(xì)胞釋放NO 和ROS。這可能是因?yàn)樘砑雍Ф嗵菍?duì)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生一定的刺激，分化為M1 巨噬細(xì)胞，從而使NO、ROS 的釋放量增大。因此，推測(cè)海帶多糖可以活化巨噬細(xì)胞，使其分化為M1 巨噬細(xì)胞，從而產(chǎn)生促炎的作用。

3 結(jié)論

通過(guò)超聲輔助法提取海帶多糖，采用響應(yīng)面試驗(yàn)得到最優(yōu)條件為料液比1∶64（mg∶mL），提取溫度68 ℃，超聲功率89 W，在此工藝條件下，海帶多糖的得率為17.73%。將最優(yōu)條件下提取的海帶多糖用于巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)，結(jié)果表明海帶多糖對(duì)巨噬細(xì)胞無(wú)黏附作用。由原來(lái)的圓形或者橢圓形分化為典型的梭狀，且會(huì)出現(xiàn)一定程度的濃度依賴性。通過(guò)海帶多糖的刺激，可以使巨噬細(xì)胞顯著釋放炎癥因子NO 和ROS。因此，可推測(cè)海帶多糖可以活化巨噬細(xì)胞，使其分化為M1 巨噬細(xì)胞，從而產(chǎn)生促炎的作用。