朱 煒，俞婷婷，陳康康，計(jì)瑋瑋**，黃 玲，吳建明，沈曉利，劉 彬

（1.湖州市生態(tài)林業(yè)保護(hù)研究中心，浙江 湖州 313000；2.湖州市梁希森林公園管理處，浙江 湖州 313000;3.長興縣自然資源和規(guī)劃局，浙江 長興 313199）

竹蓀（Dictyophora indusiata），又名竹笙、竹參，隸屬于鬼筆目（Phallales） 鬼筆科（Phallaceae） 竹蓀屬（Dictyophora），外形優(yōu)美，味道鮮美，營養(yǎng)豐富，在民間有“真菌皇后”之稱[1-2]。竹蓀可補(bǔ)氣養(yǎng)陰、潤肺止咳、清熱利濕。其子實(shí)體中含有21種氨基酸及多種維生素，還富含多糖和多種微量元素，具有提高免疫力、抗衰老、抗腫瘤等作用[3-4]。竹蓀蛋即竹蓀胚體，由近地面或地面的一支或數(shù)支菌索頂端扭結(jié)膨大而生長形成，是竹蓀子實(shí)體的發(fā)育前期，由夢蓀、菌蓋、孢子、外包被等4部分構(gòu)成[5-6]。多酚是一種具有多元酚羥基結(jié)構(gòu)的次級代謝產(chǎn)物，主要經(jīng)過丙二酸和莽草酸的途徑合成[7]。多酚具有抗氧化、抗菌、抗炎、抗腫瘤等多種生物活性，已被廣泛用于開發(fā)預(yù)防口腔感染、降血糖、降血壓、神經(jīng)保護(hù)等產(chǎn)品中[8]。

目前關(guān)于竹蓀蛋中活性成分的研究較少。本試驗(yàn)在單因素試驗(yàn)的結(jié)果討論后，利用超聲提取工藝，應(yīng)用響應(yīng)面法分析竹蓀蛋多酚的提取工藝條件；并測定竹蓀蛋多酚的抗氧化能力，為進(jìn)一步保存和開發(fā)竹蓀蛋資源提供理論支撐。

1 方法

1.1 材料試劑

竹蓀蛋采自浙江省湖州市毛竹林中；沒食子酸對照品，Sigma公司；維生素C，合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），Sigma公司；其他試劑均為分析醇，購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器

超聲波清洗器，購自昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，購自上海申生科技有限公司；UV-2600紫外分光光度計(jì)，購自日本島津公司。DKZ-2型電熱恒溫振蕩水槽，購自上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；PL602-S電子天平，購自梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 竹蓀蛋多酚的提取

將竹蓀蛋采集后真空烘干后粉碎，過40目篩，得到竹蓀蛋粉末。將裝有1 g竹蓀蛋粉末的錐形瓶置于超聲波清洗器中進(jìn)行超聲輔助提取，超聲功率300W，按照料液比1∶25加入不同濃度的乙醇作為提取溶劑，按照不同的乙醇濃度（40%、50%、60%、70%、80%）、超聲時(shí)間（15 min、30 min、45 min、60 min、75 min） 和超聲溫度 （30℃、40℃、50℃、60℃、70℃）進(jìn)行提取，提取完成后提取液在4 000 r·min-1下離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)入50 mL容量瓶定容，得樣品溶液，用于后續(xù)測定含量。

1.3.2 提取條件的單因素試驗(yàn)

稱取適量干燥粉碎后的竹蓀蛋1 g，按照1.3.1中的提取方法，超聲功率300 W，料液比1∶25。固定萃取溫度為50℃條件下超聲提取，分別在40%、50%、60%、70%、80%乙醇濃度條件下超聲萃取30 min，考察乙醇濃度對竹蓀蛋多酚得率的影響。固定乙醇濃度50%，分別在萃取溫度30℃、40℃、50℃、60℃、70℃條件下超聲提取30 min，考察萃取溫度對竹蓀蛋多酚得率的影響。固定乙醇濃度50%，超聲萃取溫度50℃，分別超聲萃取提取15 min、30 min、45 min、60 min、75 min，考察超聲時(shí)間對竹蓀蛋多酚得率的影響，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.3.3 響應(yīng)面法分析試驗(yàn)

選擇超聲時(shí)間、乙醇濃度、萃取溫度3個(gè)因素的最佳水平，運(yùn)用Box-Behnken組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，采用響應(yīng)面設(shè)計(jì)方法，應(yīng)用Design Expert 8.05軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析。試驗(yàn)因素及水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面水平設(shè)計(jì)表Tab.1 Response surface level design table

1.3.4 多酚含量的測定

1）沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

稱取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品100 mg，加蒸餾水溶解后轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶定容，得1.0 mg·mL-1沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。酒石酸亞鐵溶液、pH為7.5的緩沖溶液[9]。

采用酒石酸亞鐵法分別移取0、0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL 的 1.0 mg·mL-1沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于10 mL容量瓶中，補(bǔ)水至1 mL，加入酒石酸亞鐵溶液3.0 mL，搖勻后以pH為7.5的磷酸鹽緩沖溶液定容混勻，于540 nm下測定其吸光度。以濃度C（μg·mL-1）為橫坐標(biāo)、吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[10]。

2）多酚含量的測定

按照1.3.1中竹蓀蛋多酚提取的方法，將樣品溶液稀釋50倍后即得待測液，取1 mL待測液于10 mL容量瓶中，按照上述沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品的方法測定待測液濃度，按照下式計(jì)算竹蓀蛋中多酚得率（Q，mg·g-1）:

式中：ρ為待測液濃度（mg·mL-1）；n為提取液稀釋因子；V為提取液體積（mL）；W為原料質(zhì)量（g）。

1.3.5 竹蓀蛋多酚抗氧化能力測定

各稱取25 mg最優(yōu)條件提取得到的竹蓀蛋多酚及VC，加適量蒸餾水制成1 000 μg·mL-1溶液，并且分別稀釋至 0、0.1 mg·mL-1、0.2 mg·mL-1、0.4 mg·mL-1、0.6 mg·mL-1、0.8 mg·mL-1、1.0 mg·mL-1。

1） 對DPPH·清除能力的測定

參照李亞輝等[11]的方法，精確配制濃度為5 mmol·L-1的DPPH-乙醇溶液，分別精確吸取3 mL不同質(zhì)量濃度的竹蓀蛋多酚樣品溶液，加入5 mLDPPH-乙醇溶液，混勻后在室溫下靜置30 min，以5 mL無水乙醇和3 mL蒸餾水的混合液為參比，測定517 nm波長處的吸光度，以VC為對照。樣品對DPPH自由基清除率（R1，%） 計(jì)算為：

式中：A0表示只加DPPH-乙醇溶液的吸光度；A1表示樣品和DPPH-乙醇溶液的吸光度；A2表示樣品溶液的吸光度。

2）對超氧陰離子自由基（O2-·）清除能力的測定

使用參考文獻(xiàn)[12]的方法測定，4.5 mL pH 8.2 Tris-HCl緩沖液（0.05 mol·L-1）分別與0.5 mL不同質(zhì)量濃度竹蓀蛋多酚樣品混合，于25℃水浴中預(yù)熱20 min，加入0.5 mL 25 mmol·L-1鄰苯三酚溶液?；靹蚝笥?5℃水浴中反應(yīng)5 min后，加1 mL 8 mol·L-1HCl溶液終止反應(yīng)10 min，后于420 nm波長處測定吸光度，以VC作對照。樣品對超氧陰離子自由基清除率（R2，%） 計(jì)算為：

式中：A1為樣品的吸光度；A0為蒸餾水代替樣品的吸光度。

3）羥基自由基清除能力測定

羥自由基清除能力測定采用Fenton反應(yīng)體系[13]。在10 mL試管中加入2 mL FeSO4溶液（6 mmol·L-1）、2 mL H2O2溶液（6 mmol·L-1）、2 mL水楊酸（6 mmol·L-1）和2 mL不同質(zhì)量濃度的竹蓀蛋多酚樣品，在37℃下反應(yīng)1 h，在510 nm波長處測定其吸光度，以VC作對照。樣品對羥自由基清除率（R3，%） 計(jì)算為：

式中：A0表示只加DPPH-乙醇溶液的吸光度；A1表示樣品和DPPH-乙醇溶液的吸光度；A2表示溶液樣品的吸光度。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

使用Design Expert 8.05軟件分析和處理數(shù)據(jù)[14]。

2 結(jié)果

2.1 竹蓀蛋多酚萃取工藝

2.1.1 單因素試驗(yàn)

1）乙醇提取濃度對竹蓀蛋多酚提取含量的影響

乙醇提取濃度對竹蓀蛋多酚提取含量的影響見圖1。

圖1 乙醇提取濃度對竹蓀蛋多酚提取含量的影響結(jié)果統(tǒng)計(jì)Fig.1 The effect of ethanol concentration on the extraction rate of polyphenols in embryo of Dictyophora indusiata

由圖1可知，隨著乙醇濃度的逐漸升高，多酚得率呈上升趨勢，并于60%時(shí)最高，隨著乙醇濃度的增加，得率下降。原因可能是乙醇濃度的增加，脂溶性物質(zhì)等其他雜質(zhì)溶出也隨之增多，從而阻礙了多酚的溶出[12]，因此選擇乙醇濃度50%、60%、70%作為響應(yīng)面分析的3個(gè)水平。

2） 超聲時(shí)間對竹蓀蛋多酚提取的影響

超聲時(shí)間對竹蓀蛋多酚提取含量的影響見圖2。

圖2 超聲時(shí)間對竹蓀蛋多酚提取含量的影響Fig.2 The effect of ultrasound time on the extraction rate of polyphenols in embryo of Dictyophora indusiata

由圖2可知，多酚得率先上升，后下降，45 min超聲時(shí)間竹蓀蛋多酚得率最高。原因可能是超聲時(shí)間的延長，導(dǎo)致多酚類化合物的氧化分解，或多酚在超聲波作用下部分降解損失，從而使多酚得率降低[15]。由此選擇響應(yīng)面分析的超聲提取時(shí)間為30 min、45 min、60 min。

3） 超聲萃取溫度對竹蓀蛋多酚得率的影響

超聲萃取溫度對竹蓀蛋多酚提取含量的影響見圖3。

圖3 超聲萃取溫度對竹蓀蛋多酚提取含量的影響Fig.3 The effect of ultrasound temperature on the extraction rate of polyphenols in embryo of Dictyophora indusiata

由圖3可知，當(dāng)超聲萃取溫度在30℃～60℃，隨著超聲萃取溫度升高，得率逐漸提高，在60℃時(shí)達(dá)到峰值，后隨著超聲萃取溫度升高，得率趨于下降?？赡苁怯捎跍囟冗^高會(huì)導(dǎo)致部分多酚類物質(zhì)結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定、極易分解或揮發(fā)變性，或溶液中雜質(zhì)溶出量增加，而使多酚類物質(zhì)的提取率明顯降低[16]。據(jù)此選擇超聲溫度60℃左右作為響應(yīng)面的分析水平。

2.1.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及分析

1） 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

選擇超聲時(shí)間（A）、乙醇濃度（B）、超聲萃取溫度（C），根據(jù)Box-Behnken組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)響應(yīng)面分析試驗(yàn)。以竹蓀蛋多酚得率作為響應(yīng)值設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Experiment results of response surface analysis

對表2試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析后，獲得了多酚得率對超聲時(shí)間、萃取溫度和乙醇濃度的回歸方程，確定以多酚得率為目標(biāo)函數(shù)的回歸模型為：

對上述方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。

表3 方差分析Tab.3 Analysis of variance

由表3可知，該回歸方程的回歸效果達(dá)到極顯著水平 （P＜0.000 1）；模型的決定系數(shù) R2為 0.985 0，說明模型與實(shí)際擬合較好；模型調(diào)整決定系數(shù)R2adj為0.965 7，說明該模型能解釋96.57%響應(yīng)值的變化；模型的失擬項(xiàng)表示模型預(yù)測值與實(shí)際值不相符的概率，表3中模型失擬項(xiàng)的P值為0.455 7＞0.05，表明模型的失擬項(xiàng)不顯著；根據(jù)表3的顯著性分析結(jié)果，超聲萃取溫度（C）、乙醇濃度（B） 對響應(yīng)值影響顯著 （P＜0.05），AA、BB、CC 以及 AC、BC 的交互項(xiàng)對多酚得率的影響極顯著（P＜0.01）。各因素對多酚得率影響大小順序依次為超聲萃取溫度（C）＞乙醇濃度（B） ＞超聲時(shí)間（A）。

2） 響應(yīng)面分析

根據(jù)回歸方程繪制響應(yīng)曲面圖，并根據(jù)擬合的響應(yīng)曲面形狀，探討超聲時(shí)間、萃取溫度及乙醇濃度對竹蓀蛋多酚得率的影響。將模型中的超聲時(shí)間、超聲萃取溫度及乙醇濃度分別固定在初始水平，得到其他因素的交互影響結(jié)果，響應(yīng)面及其等高線見圖 4～圖 6。

圖4 超聲時(shí)間和乙醇濃度的響應(yīng)面圖Fig.4 Response surface and contour of ultrasonic time and ethanol concentration

圖5 超聲萃取溫度和乙醇濃度的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface and contour of ultrasonic temperature and ethanol concentration

圖6 超聲萃取溫度和超聲時(shí)間的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface and contour of ultrasonic time and ultrasonic temperature

由圖4～圖6可知，影響竹蓀蛋多酚得率的最顯著因素為超聲萃取溫度（C），極值條件在等高線的圓心處，反應(yīng)出其響應(yīng)面變化較大。其次是乙醇濃度（B）。超聲時(shí)間（A） 響應(yīng)面弧度平緩，說明其響應(yīng)值的影響較小。等高線的形狀可反映出交互效應(yīng)的強(qiáng)弱，橢圓形表示二因素交互作用顯著，而圓形則與之相反。因此，超聲時(shí)間（A）與超聲萃取溫度（C） 之間，乙醇濃度（B） 與超聲萃取溫度（C）間對多酚得率有顯著交互影響。

2.1.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)所得的結(jié)果和回歸方程，得到最佳提取條件為：超聲時(shí)間45.4 min，乙醇濃度64.9%，超聲萃取溫度62.3℃，多酚得率理論值可達(dá) 5.87 mg·g-1。

為檢驗(yàn)?zāi)Ｐ皖A(yù)測值與實(shí)際值之間的相關(guān)性，檢驗(yàn)響應(yīng)面優(yōu)化模型的準(zhǔn)確性，試驗(yàn)驗(yàn)證了靈芝子實(shí)體中多酚得率。根據(jù)最佳提取條件進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，測得多酚得率分別為 5.70 mg·g-1、5.74 mg·g-1、5.69 mg·g-1。實(shí)際的多酚平均得率為 5.71 mg·g-1，達(dá)到了回歸模型理論預(yù)測值的97.27%。試驗(yàn)結(jié)果與模型契合良好，說明該模型能較好地預(yù)測和模擬竹蓀蛋多酚得率。

2.2 竹蓀蛋多酚抗氧化結(jié)果

2.2.1 DPPH·清除能力統(tǒng)計(jì)

竹蓀蛋多酚對DPPH自由基清除能力的統(tǒng)計(jì)結(jié)果見圖7。

圖7 竹蓀蛋多酚和VC對DPPH·的清除能力結(jié)果統(tǒng)計(jì)Fig.7 Result statistics of the scavenging effect of polyphenol and vitamin C on DPPH·

DPPH·法是評價(jià)天然化合物抗氧化能力的一種有效而靈敏的方法。由圖7結(jié)果表明，竹蓀蛋多酚的DPPH·清除能力隨其濃度的增加而增強(qiáng)。竹蓀蛋多酚的濃度為0.8 mg·mL-1時(shí)，其DPPH·的清除率為85.73%，超過0.8 mg·mL-1濃度后，清除率未增加。

2.2.2 超氧陰離子自由基（O2-·）清除能力測定

竹蓀蛋多酚對O2-·自由基清除能力的統(tǒng)計(jì)結(jié)果見圖8。

圖8 竹蓀蛋多酚和VC清除超氧陰離子自由基的能力結(jié)果統(tǒng)計(jì)Fig.8 Result statistics of the scavenging effect of polyphenol and vitamin C on Superoxide anion

如圖8所示，在測試濃度范圍內(nèi)，竹蓀蛋多酚表現(xiàn)出很強(qiáng)的清除能力。在0.8 mg·mL-1濃度時(shí)，竹蓀蛋多酚對O2－·生成的抑制率為77.47%，竹蓀蛋多酚具有較強(qiáng)的O2－·清除能力。

2.2.3 羥基自由基（·OH）清除能力統(tǒng)計(jì)

竹蓀蛋多酚對羥基自由基清除能力的統(tǒng)計(jì)結(jié)果見圖9。

圖9 竹蓀蛋多酚清除·OH的能力統(tǒng)計(jì)結(jié)果Fig.9 Result statistics of the scavenging effect of polyphenol on hydroxyl radical

從圖9可以看出，竹蓀蛋多酚對·OH的清除能力均與其濃度的增加呈正相關(guān)。在0.8 mg·mL-1濃度時(shí)，竹蓀蛋多酚對·OH的抑制率為77.26%。

3 結(jié)論

通過響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，利用超聲萃取方法，得到竹蓀蛋多酚的最佳萃取工藝條件為：超聲時(shí)間45.4 min，超聲萃取溫度62.3℃，乙醇濃度64.9%，該條件下的多酚得率為5.71 mg·g-1。體外抗氧化試驗(yàn)表明，竹蓀蛋多酚具有一定的抗氧化能力，當(dāng)竹蓀蛋多酚的濃度達(dá)到0.8 mg·mL-1時(shí)，其對DPPH自由基、羥自由基、超氧陰離子自由基的清除率分別為85.73%、77.26%、77.47%，且其抗氧化能力與多酚濃度存在一定的量效關(guān)系。

食用菌多酚是食用菌中提取的具有兩親結(jié)構(gòu)和諸多衍生化反應(yīng)活性的一類次生代謝產(chǎn)物，據(jù)報(bào)道[17]灰樹花（Polyporus frondosus）、竹蓀（Dictyophora indusiata）、金針菇（Flammulina velutipes） 等食用菌的多酚具有抗病毒、抗氧化等作用。試驗(yàn)結(jié)果表明，竹蓀蛋多酚也具有較強(qiáng)的抗氧化能力，具有很好的開發(fā)前景。