李欣, 周星宇, 張俊, 陳士嶺

南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院婦產科生殖醫(yī)學中心(廣東廣州 510515)

女性生育力與年齡密切相關，35歲之后女性自然受孕能力隨年齡增加開始明顯下降[1]。40歲以上婦女處于生育力末期，即使進行體外授精與胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer,IVF-ET)助孕治療，臨床妊娠率和活產率明顯降低，45歲時妊娠率大幅下降到約為10%，流產率高達90%以上[2]。除個案報道外，46歲以上婦女行IVF助孕未能夠獲得活產。隨著輔助生殖技術(assisted reproductive technology,ART)的不斷發(fā)展和推廣應用，在世界范圍內高齡婦女尋求輔助生殖助孕的人數(shù)也大幅增加。國際輔助生殖技術監(jiān)測委員會2020年最新發(fā)布的報告顯示，2012年40歲以上的婦女中有25.2%接受自卵ART助孕[3]。歐洲人類生殖和胚胎學協(xié)會報告顯示，2014年約有17%的IVF周期和20%的卵母細胞胞漿內單精子注射(introcytoplasmic sperm injection,ICSI)周期在40歲以上的婦女中進行[4]，同時美國的數(shù)據(jù)顯示，2014年有16%的ART周期在41～44歲婦女中進行[5]。2016年隨著我國全面二孩的開放，大量高齡女性加入生育隊伍，2017年國家衛(wèi)健委指出，生育二孩的目標人群中約有4 500萬對夫婦年齡在40歲以上。高齡女性卵巢儲備功能下降，存在卵子質量下降、獲卵數(shù)少、可移植胚胎數(shù)少、胚胎質量下降、臨床妊娠率低、持續(xù)妊娠率與活產率低等問題，如何有效改善高齡女性的助孕結局成為生殖醫(yī)學領域的難點和熱點問題之一。目前國外有較多關于凍存卵子以提高高齡婦女妊娠率的報道，而累積胚胎方面研究較少；國內由于法規(guī)尚無高齡凍存卵子的文獻報道，亦未見高齡累積胚胎后移植的文獻報道。本研究回顧性分析了40歲以上高齡不孕婦女累積胚胎后移植與非累積胚胎進行移植的妊娠結局，以期為改善高齡女性ART治療結局提供臨床依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究為對40歲以上高齡不孕婦女累積胚胎后移植與非累積胚胎移植的妊娠結局進行分析的回顧性臨床研究，總結2016年1月至2020年7月在南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院婦產科生殖醫(yī)學中心行凍融胚胎移植(frozen embryo transfer，F(xiàn)ET)助孕治療患者的妊娠結局。

納入標準：(1)具有IVF-ET助孕指征且無禁忌證；(2)年齡≥40歲；(3)凍胚移植。

排除標準：(1)取卵年齡<40歲；(2)鮮胚移植；(3)患有惡性腫瘤、染色體異常等疾病者；(4)臨床資料欠完整者；(5)接受贈卵者。

本部分研究共納入229例患者，338個移植周期。

1.2 分組標準 按年齡分為4組：40歲組(n=96)、41歲組(n=71)、42歲組(n=69)、≥43歲組(n=102)，其中≥43歲組，平均年齡為(43.85±1.15)歲。各組內按如下標準再分為兩組：(1)累積胚胎組：≥2個連續(xù)取卵周期且每次獲卵數(shù)≥1，每次獲卵后冷凍胚胎數(shù)≥1；或本次移植僅取卵1次且獲卵數(shù)≥1，獲卵后冷凍胚胎數(shù)≥1，但既往周期中剩余可用冷凍胚胎數(shù)≥1；(2)非累積胚胎組：每次移植僅取卵1次且獲卵數(shù)≥1，獲卵后冷凍胚胎數(shù)≥1，且既往周期中無剩余可用冷凍胚胎。

1.3 研究方法

1.3.1 處理方法 根據(jù)患者卵巢儲備功能及基礎疾病情況選擇相應促排卵方案(長方案、短方案、拮抗劑方案等)，利用激素水平及陰道超聲監(jiān)測卵泡，當3個卵泡直徑≥17 mm時肌內注射重組人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，hCG)5 000～10 000 IU進行扳機。采用促排卵方案、激素替代方案或自然周期準備子宮內膜，子宮內膜厚度≥7 mm時進行轉化。

1.3.2 妊娠結局的判斷 移植后12 d檢測血清β-hCG水平，若為陽性則于移植后4周行陰道超聲檢查，見胎心搏動判定為臨床妊娠。妊娠12周內終止妊娠判定為早期流產。臨床妊娠率=臨床妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%；持續(xù)妊娠率=妊娠周期數(shù)大于12周(包括活產)的周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%，早期流產率=12周內終止妊娠的周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%。

2 結果

2.1 各年齡段婦女基本情況及妊娠結局比較 隨著年齡增高，患者基礎卵泡刺激素(follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH)水平升高(P<0.05)，獲卵數(shù)減少(P<0.05)，臨床妊娠率和持續(xù)妊娠率下降(P<0.05)。與40歲組比較，42歲組基礎竇卵泡計數(shù)(antral follicle count，AFC)、獲卵數(shù)及臨床妊娠率下降(P<0.05)，持續(xù)妊娠率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；≥43歲組基礎FSH升高(P<0.05)，基礎AFC、獲卵數(shù)及臨床妊娠率、持續(xù)妊娠率均下降(P<0.05)。與41歲組比較，≥43歲組基礎FSH升高(P<0.05)，臨床妊娠率、持續(xù)妊娠率均下降(P<0.05)。見表1。

表1 不同取卵年齡基礎資料及妊娠結局比較

2.2 累積胚胎移植與非累積胚胎移植患者基本資料及獲卵情況比較 累積胚胎移植組患者共86例，非累積胚胎移植組患者143例。兩組患者取卵年齡、體質指數(shù)、基礎FSH、基礎LH、基礎AFC、基礎子宮內膜厚度差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，基礎E2水平、總取卵周期數(shù)及累積獲卵數(shù)、平均每周期獲卵數(shù)差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 累積胚胎移植與非累積胚胎移植患者基礎資料及取卵情況比較

2.3 累積胚胎移植與非累積胚胎移植患者妊娠結局比較 兩組累積凍胚數(shù)、累積凍胚移植數(shù)、累積凍胚移植周期、累積優(yōu)質胚胎移植數(shù)、臨床妊娠率、持續(xù)妊娠率及早期流產率差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 累積胚胎移植與非累積胚胎移植患者妊娠結局情況比較

2.4 移植各年齡段胚胎時累積胚胎移植與非累積胚胎移植患者妊娠結局比較 移植胚胎年齡為40歲組共96個周期，累積胚胎移植組35個周期，非累積胚胎移植組61個周期，累積胚胎移植組獲卵數(shù)、累積促性腺激素(Gn)用藥天數(shù)及用藥總量均高于非累積胚胎移植組(P<0.05)，且臨床妊娠率和持續(xù)妊娠率均高于非累積胚胎移植組(P<0.05)，而兩組之間的早期流產率差異無統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

移植胚胎年齡為41歲、42歲、≥43歲組，累積胚胎移植組和非累積胚胎移植組的臨床妊娠率、持續(xù)妊娠率及早期流產率差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表4。

表4 移植各年齡段胚胎時累積胚胎移植與非累積胚胎移植患者妊娠結局比較

3 討論

現(xiàn)代女性中將生育年齡推遲至35～40歲以后的比例大大增加[6-7]，這與教育水平的提高、職業(yè)女性的增加、高效的避孕措施、缺乏鼓勵生育的社會政策，以及認為通過ART可以彌補隨年齡增長而下降的妊娠率的錯誤觀念有關[6,8]。然而40歲以上女性的生育力急劇下降是難以改變的自然規(guī)律，Klipstein等[9]報道40歲后開始IVF助孕的女性臨床妊娠率為28%，Hourvitz等[10]報道42、43和44歲的IVF臨床妊娠率分別為7.7%、5.4%和1.9%，≥45歲中無一例成功妊娠。我中心2007—2015年數(shù)據(jù)表明，應用IVF助孕婦女中年齡≥44歲獲臨床妊娠的概率極低[11]。本研究分析了我中心2016—2020年共5年的FET數(shù)據(jù)，結論與上述數(shù)據(jù)相似，提示40、41、42歲女性的臨床妊娠率分別為31.2%、21.1%、20.9%，≥43歲時明顯下降為10.6%。其中，與40歲組比較，42歲組基礎AFC、獲卵數(shù)及臨床妊娠率下降(P<0.05)；≥43歲組基礎FSH升高(P<0.05)，基礎AFC、獲卵數(shù)及臨床妊娠率、持續(xù)妊娠率均下降(P<0.05),提示高齡女性隨年齡增加，通過IVF助孕的臨床妊娠結局明顯下降。

高齡女性生育力明顯下降與卵巢功能減退導致的卵子數(shù)量下降與增齡導致的卵子質量的下降直接相關。卵子數(shù)量下降表現(xiàn)為基礎FSH的升高和基礎AFC的下降[12-13]、抗苗勒管激素降低[14]。本研究數(shù)據(jù)各年齡組基礎FSH水平隨年齡增加而增高(P<0.05)，基礎AFC隨年齡增加而遞減，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，考慮可能原因為行ART助孕時選擇了部分雖存在卵巢儲備功能下降但仍有較少卵泡可促排的女性，同時本研究僅限于達到獲卵周期的高齡婦女。研究表明，隨著年齡增長，卵子質量下降，非整倍體胚胎增加是著床降低和自然流產顯著增加的主要原因，影響了超過50%的植入前胚胎[15-17]。Goldman等[18]發(fā)現(xiàn)整倍體胚胎的百分比隨患者年齡呈線性下降，從≤35歲的57.4%下降到44歲的12.7%。植入前遺傳學診斷(Pre-implantation Genetic Diagnosis，PGD)即2018年世界衛(wèi)生組織命名為植入前非整倍體遺傳學檢測(Preimplantation Genetic Testing for Aneuploidies，PGT-A)，在國外已廣泛應用于高齡女性助孕。Munné等[19]報道使用PGD后40～45歲的臨床妊娠率從10.7%增加到17.8%，自然流產率從23%下降到11%。Ubaldi等[20]認為≥43歲婦女使用PGT-A能有效獲得可移植的整倍體囊胚從而提高妊娠率。相比之下，PGT技術在國內的適用范圍比較受限，實際開展的生殖醫(yī)學中心較少，費用較為昂貴，尚未能在高齡女性中廣泛使用。另外，這些侵入性技術對胚胎有無遠期影響還缺乏大型研究[21]。較多研究表明在高齡女性IVF周期中添加生長激素可以改善子宮內膜血流[22]、增加子宮內膜厚度和獲卵數(shù)[23]、改善胚胎質量[24]，但上述研究中妊娠結局均未能得到改善，Meta分析提示活產率沒有得到提高[25]。同時，有越來越多為改善高齡女性妊娠的新技術出現(xiàn)，如利用卵原干細胞置換卵母細胞中的線粒體[26]、利用基因編輯進行染色體治療[27-28]等，然而這些研究仍存在倫理問題或尚未進入臨床研究階段，因此如何有效改善高齡女性妊娠結局仍亟待解決。

目前國外有較多通過凍存累積卵子以提高妊娠率的研究，Chamayou等[29]通過累積卵子和聯(lián)合使用PGD-A來提高RIF患者的妊娠率，Cobo等[30]和法國Jean-Verdier大學醫(yī)院[31]通過累積卵子來提高卵巢低反應患者的妊娠率，而在累積胚胎方面，較少文獻報道。Klipstein等[9]發(fā)現(xiàn)40歲以上女性在IVF周期中，盡管只有5.7%的女性能得到良好的卵巢反應，但如果有多余胚胎可用于冷凍保存，活產率可以獲得明顯提高(從20.0%～31.6%不等)。我中心數(shù)據(jù)顯示，在40歲女性中，非累積胚胎移植女性臨床妊娠率為24.6%，累積胚胎移植女性的臨床妊娠率增加到42.9%(P=0.029)，且持續(xù)妊娠率從11.5%增加到28.6%(P=0.017)。另外，我中心數(shù)據(jù)顯示40歲女性臨床妊娠率為31.2%，相較于其他研究結果偏高，可能與累積胚胎的實施有關。有文獻報道胚胎的整倍體性與胚胎形態(tài)學參數(shù)之間存在一定關系[32],形態(tài)學分級有助于整倍體囊胚的選擇[33]，可通過卵裂期胚胎的碎片體積比例和囊胚期胚胎的擴張期別判斷整倍體率的高低[34]。因此，在40歲女性中多次取卵增加冷凍胚胎數(shù)，使移植時獲得更多可挑選胚胎，通過胚胎形態(tài)預測整倍體率的高低，增加整倍體胚胎移植率，可改善臨床妊娠率和持續(xù)妊娠率。同時，累積胚胎移植可以減輕高齡女性由于反復移植后妊娠失敗引起的心理負擔，緩解女性焦慮緊張的情緒，這也是提高移植成功率的策略之一[35]。

對于41歲以上女性中，兩組間累積臨床妊娠率和繼續(xù)妊娠率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，考慮可能的原因如下：(1)41歲以上女性本身卵巢儲備功能和卵子質量急劇下降，難以通過累積胚胎獲得優(yōu)質胚胎；(2)在選擇患者時，累積胚胎移植組的女性卵巢功能較差，病史較為復雜，如不孕年限較長或既往有多次流產史導致子宮內膜受損、子宮腺肌癥發(fā)生率增加等，預后較差；(3)本研究中的累積周期數(shù)不足以提高臨床妊娠結局：41、42、≥43歲累積胚胎移植組的累積取卵周期數(shù)分別為2.47±0.65、2.33±0.48、3.39±2.62，獲卵數(shù)分別為16.36±12.15、9.05±4.98、12.33±7.97，由于助孕診治過程的疲勞和缺乏繼續(xù)嘗試的愿望，部分患者拒絕繼續(xù)取卵累積胚胎而要求盡早移植。有研究表明對于>42歲的女性至少需要20個卵母細胞以找到至少一個整倍體胚胎[36]，對于40～41歲、42～43歲、≥44歲女性，4個卵母細胞只能帶來12%、5%、1%的累積活產率[37]，為達到約50%的活產率，41～44歲女性分別需要25、30、50、80個成熟卵子[18]，因此對于41歲以上女性，2～3個取卵周期、9～16個獲卵數(shù)尚不足以累積到可移植的優(yōu)質胚胎?？紤]到本研究是單中心回顧性研究，可能存在系統(tǒng)偏倚，因此對于41歲以上累積胚胎移植是否能有效改善助孕結局仍需要多中心、大樣本、前瞻性的臨床研究。有研究報道，44歲女性為達到43%的活產率需要70個成熟卵子，達到55%的活產率需要100個[18]，實際上對≥44歲女性無論累積多少卵子都無法達到3%的累積活產率[37]。近年來國外文獻報道稱，在35～37歲前凍卵、凍胚進行生育力保存才是解決高齡婦女不孕問題的最有效途徑。美國CDC發(fā)布的2018年ART年度報告顯示，2018年中有103 078個凍卵、凍胚周期是為生育力保存進行的，占全年總周期的33.66%。結合我國國情，建議應對已婚夫婦充分告知高齡妊娠尤其是40歲以上高齡妊娠的各種弊端，建議生育期婦女應該在35～37歲前實施生育計劃，避免40歲以上的高齡生育。同時，亦建議我國在法規(guī)上給在35～37歲前由于各種原因無法進行生育的婦女提供凍存卵子和胚胎進行生育力保存的機會。

綜上所述，40歲以上女性的臨床妊娠率和持續(xù)妊娠率隨年齡增長逐年下降，高齡是不孕的原因之一，對于≥40歲女性即使無其他導致不孕的致病因素也應積極予ART助孕。在國內尚未廣泛實施PGT-A的情況下，對40歲女性可多次取卵累積胚胎后再移植，通過胚胎形態(tài)預測整倍體率高低，盡可能挑選優(yōu)質胚胎，增加整倍體胚胎移植率，從而改善臨床妊娠率和持續(xù)妊娠率，而對41歲以上女性累積胚胎是否能改善助孕結局仍有待進一步研究。