王盛隆 劉海鑫 董愛愛 白 麗 陳慧婷 劉 靈 張亞妮 范嘉琦

（1.山西省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，山西 太原 030013；2.山西中醫(yī)藥大學，山西 晉中 030619）

目前全球約有3.34億支氣管哮喘（簡稱哮喘）患者，預計2025年全球哮喘患者將增至4億［1］。根據(jù)傷殘調(diào)整壽命年，哮喘位于所有疾病第14位［2］。該病已成為全球造成巨大社會經(jīng)濟、醫(yī)療負擔的疾病之一。因此，提高哮喘的診治水平對改善哮喘的整體控制和預后以及降低醫(yī)療成本均有重要意義。

哮喘主要以慢性氣道炎癥及氣道重塑為主要病理特征，反復發(fā)作使炎性細胞及某些結(jié)構(gòu)細胞釋放的炎癥因子及趨化因子使細胞因子網(wǎng)絡(luò)調(diào)控異常，導致“炎癥-上皮細胞損傷-氣道重塑”的惡性循環(huán)過程，而氣道重塑是導致哮喘患者肺功能快速下降及固定性氣流受限的主要原因。因此，哮喘的治療不僅要緩解持續(xù)存在的氣道炎癥，更要預防氣道重塑的發(fā)生。本研究意在探討“補肺益腎、養(yǎng)血祛瘀”法干預支氣管哮喘小鼠NLRP3、白細胞介素-1β（IL-1β）、POSTN、轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）及基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）的表達及BALF中白細胞總數(shù)、EO%及NEU%，闡明該法對哮喘氣道炎癥及氣道重塑的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

BALB/C雌性小鼠40只，SPF級、6～8周齡、體質(zhì)量18～22 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號：SCXK（京）2020-0004。實驗前小鼠適應性飼養(yǎng)1周。本研究經(jīng)山西中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會批準（批準編號：2020DW012），符合倫理委員會相關(guān)動物研究指導原則。

1.2 實驗藥物

“補肺益腎、養(yǎng)血祛瘀”中藥復方（熟地黃20 g，當歸12 g，陳皮 10 g，清半夏9 g，茯苓 16 g，黨參18 g，阿膠10 g，款冬花12 g，川芎8 g，炙甘草6 g），按每日成人口服生藥量水煎濃縮為0.91 g/mL，由山西省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院藥劑科提供。醋酸地塞米松片（遂成藥業(yè)股份有限公司，0.75 mg/片）。

1.3 試劑與儀器

Trizol（Invitrogen）、TIANScript RT KIT（天根生化科技有限公司）、Mouse IL-1β ELISA KIT及Mouse TGF-β1 ELISA KIT（博士德生物工程有限公司）、磷酸鹽緩沖液（PBS，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）、LPS（Sigma Corporation of America）及 OVA（Sigma Corporation of America）。生物分光光度計（Bio Photometer，Eppendorf）、熒光定量 PCR 儀（ABI7500，Applied Biosystems）、壓縮型霧化吸入機（PARI BOY N 085，PARI GmbH）及光學顯微鏡（CX31，Olympus Corporation）。

1.4 模型制備

參考農(nóng)光民等［3-4］造模方法并經(jīng)改良：分別于實驗第0、6、13天將小鼠用乙醚麻醉，迅速以10 μL移液槍吸取5 μL致敏液（50 mL PBS+1 mg LPS+1 g OVA）鼻腔內(nèi)滴入致敏；于實驗第21天開始將小鼠置于自制霧化箱中以1%OVA溶液霧化吸入連續(xù)激發(fā)14 d，每次60 min?？瞻捉M用等量0.9%氯化鈉溶液致敏與激發(fā)。

1.5 分組及給藥

將小鼠隨機分為空白組、模型組、中藥組、西藥組及中西結(jié)合組5組，每組8只。每次激發(fā)前30 min開始給藥。中藥組給予“補肺益腎、養(yǎng)血祛瘀”中藥復方水煎濃縮液，以18.2 g/kg灌胃；西藥組給予醋酸地塞米松片藥液0.4 mg/kg灌胃，中西結(jié)合組給予中西藥物分別灌胃，劑量同中藥組和西藥組；模型組與空白組給予等量0.9%氯化鈉溶液灌胃。各組連續(xù)給藥14 d。

1.6 標本采集與檢測

給藥第14天激發(fā)1 h后從小鼠眼球取血，血液樣本放入1.5 mL離心管中，室溫凝固2 h，3 000 r/min離心10 min，收集血清至新的離心管；然后從小鼠頸部氣管會厭軟骨下方切一倒“T”型切口，將12G幼鼠灌胃針插入氣管，并用手術(shù)線結(jié)扎固定，迅速打開小鼠胸腔，用手術(shù)縫合線迅速結(jié)扎右主支氣管，同時暴露左肺，抽取BALF置于細胞固定液中；取右肺上中葉置于液氮中保存。

1.6.1 BALF中白細胞總數(shù)計數(shù)及嗜酸性粒細胞百分比（EO%）、中性粒細胞百分比（NEU%） 將裝有BALF的細胞固定液充分混勻，用移液管將BALF滴入血球計數(shù)板中，在光學顯微鏡下計白細胞總數(shù)，紅細胞、脫落的上皮細胞、纖毛、雜質(zhì)均不得計入；將剩余BALF重懸浮，取100 μL BALF重懸液在玻片以上700 r/min離心2 min進行甩片，行瑞氏-吉姆薩染色，待干燥后中性樹膠封片，依據(jù)細胞形態(tài)學特點，光學顯微鏡下計算EO%及NEU%。

1.6.2 ELISA法檢測血清中TGF-β1、IL-1β的表達按試劑盒說明書進行操作。

1.6.3 RT-PCR法檢測肺組織中POSTN、NLRP3、MMP-9、MMP-2 mRNA的表達 用Trizol提取組織樣本中總RNA，取5 μL RNA用1%瓊脂糖凝膠進行電泳，以檢測RNA的完整性；用TIANScript RT KIT進行反轉(zhuǎn)錄，實驗操作按產(chǎn)品說明書進行。PCR反應參數(shù)：變性為95℃10 s，退火為58℃30 s，延伸為72℃30 s各1次，進行40個循環(huán)，收集熒光信號，反應結(jié)束；用熒光定量PCR儀采用2-ΔΔCT法進行數(shù)據(jù)的相對定量分析。分別用目的基因引物和內(nèi)參基因引物進行擴增。同時在60～95℃進行溶解曲線分析。

表1 引物序列

1.7 統(tǒng)計學處理

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠BALF中白細胞計數(shù)及分類百分比比較

見表2。與空白組相比，模型組、中藥組小鼠BALF中白細胞總數(shù)、EO%及NEU%明顯升高（P＜0.05），西藥組和中西結(jié)合組則白細胞總數(shù)無明顯升高（P＞0.05），EO%及NEU%顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，中藥組均明顯下降（P＜0.05）；與中藥組相比，西藥組及中西結(jié)合組均顯著下降（P＜0.05）；與西藥組比較，中西結(jié)合組白細胞總數(shù)、EO%及NEU%明顯下降（P＜0.05）。

表2 各組小鼠BALF中白細胞總數(shù)計數(shù)及分類百分比比較（±s）

表2 各組小鼠BALF中白細胞總數(shù)計數(shù)及分類百分比比較（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與中藥組比較，▲P＜0.05；與西藥組比較，△P＜0.05。下同。

組別空白組模型組中藥組西藥組中西結(jié)合組n 8 8 8 8 8白細胞總數(shù)（×104/mL）143.40±42.41 483.80±59.39*331.80±48.87*#201.80±82.26#▲123.80±34.21#▲△EO（%）0.64±0.13 11.10±1.49*8.01±1.19*#5.89±0.62*#▲3.68±0.43*#▲△NEU（%）1.48±0.32 37.50±5.59*20.05±1.62*#15.06±1.21*#▲10.95±1.14*#▲△

2.2 各組小鼠血清中TGF-β1、IL-1β表達水平比較

見表3。與空白組相比，模型組、中藥組、西藥組及中西結(jié)合組小鼠血清中TGF-β1、IL-1β的表達明顯升高（P＜0.05）；與模型組相比，中藥組、西藥組及中西結(jié)合組均顯著下降（P＜0.05）；與中藥組相比，西藥組及中西結(jié)合組顯著下降（P＜0.05）；與西藥組比較，中西結(jié)合組顯著下降（P＜0.05）。

表3 各組小鼠血清中TGF-β1、IL-1β表達水平比較（pg/mL，±s）

表3 各組小鼠血清中TGF-β1、IL-1β表達水平比較（pg/mL，±s）

組別空白組模型組中藥組西藥組中西結(jié)合組n 8 8 8 8 8 TGF-β1 204.10±11.55 967.85±39.96*629.69±26.76*#588.40±17.92*#▲357.91±43.73*#▲△IL-1β 209.41±9.37 511.89±25.66*404.82±15.60*#364.14±15.90*#▲303.69±13.13*#▲△

2.3 各組小鼠肺組織中POSTN、NLRP3、MMP-9、MMP-2 mRNA相對表達比較

見表4。與空白組相比，模型組、中藥組、西藥組及中西結(jié)合組小鼠肺組織中POSTN、NLRP3、MMP-9、MMP-2 mRNA的表達顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，中藥組、西藥組及中西結(jié)合組均顯著下降（P＜0.05）；與中藥組相比，西藥組及中西結(jié)合組顯著下降（P＜0.05）；與西藥組比較，中西結(jié)合組顯著下降（P＜0.05）。

表4 各組小鼠肺組織中POSTN、NLRP3、MMP-9、MMP-2 mRNA相對表達水平比較（±s）

表4 各組小鼠肺組織中POSTN、NLRP3、MMP-9、MMP-2 mRNA相對表達水平比較（±s）

組別空白組模型組中藥組西藥組中西結(jié)合組n 8 8 8 8 8 POSTN 0.74±0.56 6.95±0.82*3.75±0.51*#2.87±0.47*#▲2.02±0.44*#▲△NLRP3 0.99±0.30 10.63±1.15*6.04±0.82*#4.13±0.91*#▲2.47±0.56*#▲△MMP-9 0.92±0.16 9.95±0.61*6.72±0.65*#4.10±0.57*#▲2.25±0.41*#▲△MMP-2 0.83±0.19 9.03±0.24*5.95±0.56*#3.86±0.41*#▲1.93±0.47*#▲△

3 討 論

支氣管哮喘屬于中醫(yī)學“哮病”范疇。哮喘反復發(fā)作，損傷氣道；且久病耗氣傷津，痰濁膠固，壅塞肺絡(luò)，氣血不暢，痰瘀互結(jié)，這種“因虛致瘀、虛實夾雜”的病理特征使病情纏綿難愈，與哮喘氣道易感性增加，黏膜腫脹、充血，炎性分泌物滲出，導致氣道痙攣狹窄，缺血缺氧，黏膜瘀血水腫，破壞氣道的結(jié)構(gòu)及功能，支氣管平滑肌增生，細胞外基質(zhì)沉積，而致氣道重塑的認識有相通之處。國醫(yī)大師洪廣祥提出“痰瘀伏肺為哮證夙根”。張士卿則主張哮喘治療中扶正固本與痰瘀同治是長期控制哮喘的關(guān)鍵。清·沈金鰲《雜病源流犀燭》于治肺病之法提出“血生脾，統(tǒng)于心，藏于肝，宣布于肺，根于腎”，即肺腎兩臟主血也可病血的觀點。蓋以唯有血液充盈敷濡于肺，肅殺金性始得陰配而治節(jié)之令自調(diào)。一旦血虛失養(yǎng)，則既可乏陰津之源，又可澀肺宇之脈，也可血不養(yǎng)金而肺失濡潤或瘀血留客，乃至宣肅違和失節(jié)而哮喘以生。由此可見，久病多虛多瘀，課題組提出“臟虛血弱、痰瘀互結(jié)”為哮喘反復發(fā)作核心病機，治療總以“補肺益腎、養(yǎng)血祛瘀”為主。本研究方藥由“金水六君煎”化裁而來。熟地黃甘溫填精補血、培補下元而定喘。當歸養(yǎng)血和血，理血中氣，合地黃補陰以配陽，使血和氣降；然“當歸補血而主動”，謂其活血化瘀之效，配以阿膠養(yǎng)血滋陰、化痰清肺；川芎活血行氣，化痰、瘀之窠臼，解阿膠之黏膩；黨參補肺益氣健脾，配甘淡滲濕之茯苓更能發(fā)揮補氣健脾之功，可“培土生金”；清半夏燥濕化痰、消痞散結(jié)。痰之結(jié)由于氣機不運，陳皮芳香醒脾，疏利氣機，使脾陽運而濕痰去，氣機暢而凝滯除；款冬花潤肺下氣、化痰止咳；炙甘草和中健脾，調(diào)和諸藥。研究表明，“補肺益腎、養(yǎng)血祛瘀”類中藥可以通過調(diào)節(jié)TNF-α、IL-1β等炎性介質(zhì)阻斷NF-κB信號轉(zhuǎn)導通路［5］。藥理學研究表明，補肺益腎藥不僅具有抗炎、化痰、解痙平喘作用，同時能提高細胞免疫功能，增強機體抗邪能力［6］；養(yǎng)血活血類中藥可以減輕哮喘氣道炎性浸潤，降低TGF-β1及MMP-9的表達［7］。

現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，支氣管哮喘是由多種細胞（嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、巨噬細胞等）及細胞組分參與，多種炎性因子、炎癥通路參與其發(fā)生發(fā)展的過程。在哮喘的發(fā)病過程中以Th2為主的免疫反應占主導地位，POSTN是一種細胞外基質(zhì)蛋白，可以與整合素-αVβ1、αVβ3、αVβ5、α6β4和 αMβ2結(jié)合激活信號通路，而POSTN已被證實在哮喘患者中高表達［8］。當變應原侵入宿主觸發(fā)2型免疫應答，Th2細胞因子IL-13刺激成纖維細胞產(chǎn)生、誘導POSTN高表達［9］，POSTN通過與受體相互作用，激活NF-κB/TGF-β，增加嗜酸性粒細胞的募集，誘導炎性因子產(chǎn)生，加速氣道炎癥的發(fā)生；與此同時，信號通路激活后，通過MMP-2和MMP-9增強了活化的TGF-β的水平并調(diào)節(jié)膠原蛋白合成及其彈性，進而促進細胞外基質(zhì)蛋白沉積和氣道重塑［10］。本研究發(fā)現(xiàn)，“補肺益腎、養(yǎng)血祛瘀”中藥不僅可以降低哮喘小鼠肺組織中POSTN、MMP-9及MMP-2 mRNA的表達，同時可以降低哮喘小鼠血清中TGF-β1的表達，減少BALF中EO%，提示該法可能通過阻斷NF-κB/TGF-β通路而發(fā)揮作用。

與此同時，基于哮喘細胞表型研究，人群歸因危險度分析顯示多達50%以上的哮喘患者為非嗜酸性粒細胞哮喘，其中以中性粒細胞型哮喘最為多見［11］。NLRP3炎癥小體是目前研究較多的炎癥小體，由胞內(nèi)固有免疫受體NLRP3、接頭蛋白ASC和蛋白酶Caspase-1作為核心組成的多蛋白復合物，是氣道中表現(xiàn)出來的最佳特征性亞型，在慢性疾?。ㄈ缦┑陌l(fā)生發(fā)展中起著重要的作用［12-14］。當各種病原微生物、過敏原及損傷因素一旦激活NLRP3炎癥小體，ASC作為“橋接蛋白”將活化后的NLRP3與Caspase-1相結(jié)合使其活化。活化后的Caspase-1將pro-IL-1β裂解、分化，成為成熟的IL-1β。IL-1β可促進Th17細胞分化、維持Th17相關(guān)細胞因子的產(chǎn)生，也可促進嗜酸性粒細胞的產(chǎn)生［15］。Th17及其相關(guān)細胞因子能夠?qū)χ行粤＜毎M行募集、活化并抑制其凋亡［16］，被認為是中性粒細胞哮喘發(fā)病的重要機制之一。本研究結(jié)果表明，“補肺益腎、養(yǎng)血祛瘀”法不僅可以減少哮喘小鼠肺組織中NLRP3的表達，同時可以減少哮喘小鼠BALF中白細胞總數(shù)、NEU%、EO%及血清中IL-1β的表達，提示該法在干預哮喘發(fā)病的混雜因素中發(fā)揮著一定的作用。

氣道炎癥及氣道重塑是支氣管哮喘治療中永恒不變的話題。從機制來看，本研究結(jié)果顯示，“補肺益腎、養(yǎng)血祛瘀”法能夠減少哮喘BALF中白細胞總數(shù)，抑制EO%、NEU%和血清中TGF-β1、IL-1β的表達及肺組織中POSTN、NLRP3、MMP-9、MMP-2 mRNA的表達，由此提示，“補肺益腎、養(yǎng)血祛瘀”法可能通過抑制哮喘炎癥因子釋放、炎癥細胞募集及細胞外基質(zhì)蛋白沉積，從而減輕哮喘氣道炎癥及氣道重塑；從療效來看，中西結(jié)合療效更為顯著。