王 盼 王芝濤

非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma, NHL) 發(fā)病率高, 是最常見的淋巴瘤亞型。近年來，隨著CD20單抗(利妥昔單抗)為基礎(chǔ)的免疫化療方案在臨床的逐漸應(yīng)用，以及造血干細(xì)胞移植技術(shù)的逐漸成熟，極大地延長(zhǎng)了NHL患者的生存期。然而，NHL在臨床上只能緩解，不能根治。尤其是，腫瘤復(fù)發(fā)后，治療效果極差。因此，有必要針對(duì)NHL的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行深入研究。髓系來源抑制性細(xì)胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSC) 是一群未成熟的具有負(fù)向調(diào)節(jié)作用的免疫細(xì)胞亞群。MDSC在炎癥、腫瘤及自身免疫性疾病中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，并通過抑制宿主先天和獲得性免疫功能，造成宿主免疫功能穩(wěn)態(tài)的失衡。然而，關(guān)于M-MDSC在NHL患者中的表達(dá)情況鮮有報(bào)道。本研究擬探討NHL患者外周血中M-MDSC的表達(dá)水平及其在臨床中的應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年9月至2020年1月解放軍第901醫(yī)院和安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院醫(yī)院血液內(nèi)科35例初診NHL患者作為試驗(yàn)組，男性18例，女性17例；平均年齡(53.23±9.46)歲。同期選取健康體檢中心志愿者20例作為對(duì)照組，男性10例，女性10例；平均年齡(51.52±9.28)歲。兩組研究對(duì)象均無自身免疫性疾病、傳染病及其他腫瘤。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象均簽署知情同意書。

1.2 試劑與儀器 CD14-FTTC、HLA-DR-PE和CD45-PC5流式免疫熒光抗體均購于美國Beckman Coulter公司。

1.3 外周血M-MDSC測(cè)定 采集研究對(duì)象靜脈血2 mL。取出100 μL，加入CD14-FTTC、HLA-DR-PE以及CD45-PC5單克隆抗體各5μL，室溫下孵育15 min，采用流式細(xì)胞儀(FC500 MPL, Beckman Coulter公司，USA)收集細(xì)胞。本研究中以CD14HLA-DR作為M-MDSC的免疫表型。

1.4 Arg-1水平檢測(cè) Arg-1 ELISA試劑盒(R&D公司，USA)用于檢測(cè)研究對(duì)象外周血中Arg-1水平。

1.5 RNA抽提及RT-PCR檢測(cè)iNOS mRNA水平 使用Trizol法(Invitrogen公司)提取研究對(duì)象外周血中總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增及檢測(cè)。內(nèi)參基因β-actin序列：上游5’-TGGCACCCAGCACAATGAA-3’，下游：5’-CTAAGTCATAGTCCGCTAGAAGCA-3’。iNOS引物序列：上游5’-CTTTCCAAGACACACTTCACCA-3’，下游：5’-TATCTCCTTTGTTACCGCTT CC-3’。

2 結(jié)果

2.1 兩組研究對(duì)象外周血中M-MDSC表達(dá)水平比較 試驗(yàn)組患者外周血中M-MDSC表達(dá)水平為(32.64±11.23)%，高于對(duì)照組的(12.13±4.72)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

t

=7.372,

P

=0.002)。見圖1。

圖1 兩組研究對(duì)象M-MDSC流式圖(D4象限內(nèi)為M-MDSC)

2.2 不同臨床病理特征NHL患者M(jìn)-MDSC水平比較 Ann Arbor分期Ⅲ～Ⅳ期患者M(jìn)-MDSC水平高于Ⅰ～Ⅱ期患者，LDH升高患者的M-MDSC水平高于LDH正?；颊撸琁PI評(píng)分3～5分患者M(jìn)-MDSC水平高于0～2分患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05)。見表1。

表1 不同臨床病理特征NHL患者M(jìn)-MDSC水平比較

2.3 兩組研究對(duì)象Arg-1、iNOS mRNA水平比較 試驗(yàn)組患者Arg-1和iNOS mRNA水平均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05)。見表2。

表2 兩組研究對(duì)象Arg-1、iNOS mRNA水平比較

3 討論

MDSC具有抑制宿主抗腫瘤免疫反應(yīng),促進(jìn)腫瘤細(xì)胞免疫逃逸的作用，一直是腫瘤免疫研究的熱點(diǎn)。MDSC可分為粒細(xì)胞型MDSC和單核細(xì)胞型MDSC。研究表明，單核細(xì)胞型MDSC相較于粒細(xì)胞型MDSC具有更強(qiáng)的免疫抑制作用。因此，前期多數(shù)研究集中于單核細(xì)胞型MDSC。本研究中，單核細(xì)胞型MDSC表達(dá)水平在初診NHL患者中顯著升高，提示NHL患者存在明顯的免疫穩(wěn)態(tài)失衡。NHL腫瘤細(xì)胞通過分泌G-CSF、GM-CSF及IL-6等多種細(xì)胞因子，誘導(dǎo)髓系前體細(xì)胞進(jìn)入外周血并大量增殖、分化，形成單核細(xì)胞型MDSC。高表達(dá)狀態(tài)的單核細(xì)胞型MDSC通過抑制T、B和NK等細(xì)胞的免疫功能，進(jìn)而減弱了NHL患者的抗腫瘤免疫反應(yīng)能力，促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展，與Lin等研究結(jié)果一致。Khalifa等發(fā)現(xiàn)，MDSC表達(dá)水平在B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤患者中顯著升高，將MDSC移除后，IL-10等細(xì)胞因子水平顯著下降，T細(xì)胞增殖顯著恢復(fù)。表明MDSC對(duì)于促進(jìn)非霍奇金淋巴瘤的發(fā)病具有重要作用。

研究表明，M-MDSC在多種腫瘤患者中表達(dá)水平升高，并且與腫瘤進(jìn)展密切相關(guān)。Tadmor等報(bào)道，MDSC在彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤患者中表達(dá)水平顯著升高，并與腫瘤分期密切相關(guān)。Romano等研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)單核細(xì)胞型MDSC、粒細(xì)胞型MDSC和未分化CD34MDSC在60例初診霍奇金淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma,HL)患者外周血中的表達(dá)水平進(jìn)行了分析。在初診時(shí)，所有MDSC亞群在HL患者中表達(dá)均高于對(duì)照組。尤其是在進(jìn)展期HL患者中，MDSC的表達(dá)水平進(jìn)一步升高。本研究中，單核細(xì)胞型MDSC表達(dá)水平與NHL患者的腫瘤分期、LDH水平及IPI評(píng)分密切相關(guān)。然而，單核細(xì)胞型MDSC與NHL患者性別、年齡及病理分型未見明顯相關(guān)性。腫瘤分期可以反映NHL的腫瘤負(fù)荷，LDH水平和IPI評(píng)分被認(rèn)為是NHL不良預(yù)后的標(biāo)志。表明單核細(xì)胞型MDSC不僅參與了NHL患者腫瘤的發(fā)生，且與腫瘤的進(jìn)展及預(yù)后具有一定相關(guān)性。

單核細(xì)胞型MDSC通過分泌多種細(xì)胞因子發(fā)揮負(fù)向調(diào)節(jié)作用。在多種腫瘤及炎癥性疾病中，均發(fā)現(xiàn)存在高表達(dá)狀態(tài)的Arg-1和iNOS，并且與MDSC的水平密切相關(guān)。Lauretd等認(rèn)為，Arg-1和iNOS是單核細(xì)胞型MDSC發(fā)揮負(fù)向免疫調(diào)控最重要的2個(gè)因子。其通過消耗效應(yīng)T細(xì)胞增殖所必需的精氨酸和半胱氨酸，從而抑制效應(yīng)T細(xì)胞增殖和發(fā)揮抗腫瘤免疫作用。Zhang等研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過Arg-1和iNOS中和試驗(yàn)后，效應(yīng)T細(xì)胞的增殖能力顯著恢復(fù)。本研究中，試驗(yàn)組患者外周血中Arg-1和iNOS mRNA水平相比對(duì)照組顯著升高。表明單核細(xì)胞型MDSC也是通過分泌Arg-1和iNOS抑制NHL患者抗腫瘤免疫反應(yīng)，進(jìn)而促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸。通過靶向去除或者抑制Arg-1和iNOS的活性，可能有助于恢復(fù)NHL患者的抗腫瘤免疫作用。

綜上， NHL患者外周血中單核細(xì)胞型MDSC表達(dá)水平顯著升高，且與疾病進(jìn)展密切相關(guān)。通過調(diào)控單核細(xì)胞型MDSC數(shù)量或功能可能有助于提高宿主抗腫瘤免疫反應(yīng)，為NHL的免疫治療提供新思路。