袁少云 沈 彤 汪 泳 姬可可 周 義 洪 旭 姚著猛

肥胖是機體能量的攝入多于消耗，而多余能量以脂肪形式在體內(nèi)貯存或異位沉積，并導致一系列代謝紊亂癥狀，肥胖是2型糖尿病等代謝綜合征的重要危險因素。隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展，肥胖及相關(guān)代謝綜合征的發(fā)病率和患病率不斷上升，給我國居民帶來巨大的經(jīng)濟負擔和健康威脅，同時也是全球性的重大公共衛(wèi)生問題，但肥胖患者并發(fā)糖尿病的發(fā)生發(fā)展機制目前還未完全闡明。肥胖是一種慢性全身性的低度炎癥狀態(tài)，過多或異位沉積的脂肪可致炎癥介質(zhì)如白介素(interleukin,IL)-1β等的異常分泌，進一步促進胰島素抵抗及2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展，探討肥胖的炎癥機制對相關(guān)代謝綜合征的防治有著重要意義。神經(jīng)酰胺(ceramides，Cer)是重要的鞘脂分解產(chǎn)物，廣泛存在真核細胞膜中，不僅維持細胞結(jié)構(gòu)完整，而且作為第二信使在細胞代謝和信號傳導中發(fā)揮重要作用。體外研究和動物實驗表明肥胖脂肪組織中Cer可激活多種信號通路，上調(diào)炎癥細胞因子表達，從而調(diào)節(jié)胰島素抵抗的發(fā)生發(fā)展。但關(guān)于脂肪組織Cer水平與肥胖并發(fā)糖尿病相關(guān)性的人群研究較少。為此，本研究通過檢測肥胖患者脂肪組織Cer濃度與炎癥細胞因子水平，探討肥胖患者脂肪組織Cer與炎癥及糖尿病間的關(guān)系，為肥胖患者并發(fā)糖尿病的防治提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年1月至2020年10月在安徽醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院胃腸外科進行減重手術(shù)的200例肥胖患者為研究對象，采集空腹靜脈血，收集手術(shù)切除的腹腔脂肪組織、一般情況及實驗室檢查資料。按照空腹血糖濃度≥7.0 mmol/L或口服葡萄糖耐量試驗2小時血糖≥11.1 mmol/L及既往病史，將患者分為肥胖并發(fā)糖尿病(obese diabetic，OD)組(

n

=56)與肥胖非糖尿病(obese non-diabetic，OND)組(

n

=144)。本研究經(jīng)安徽醫(yī)科大學倫理委員會批準，患者均了解調(diào)查內(nèi)容并簽署知情同意書。

1.2 納入與排除標準 納入標準：①身體質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)≥28 kg/m者；②符合減重手術(shù)指征者；③年齡>18歲者。排除標準：①I型糖尿病史者；②炎癥性疾病者；③服用皮質(zhì)類固醇藥物等者；④臨床資料不全者。

1.3 儀器與試劑

1.3.1 儀器 UltiMate 3000超高效液相色譜(美國Thermo Fisher公司)、Q Exactive plus四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜(美國Thermo Fisher公司)、C18色譜柱(日本島津公司)、EnSight酶標儀(美國PerkinElmer公司)。

1.3.2 試劑 Cer(C16/C17/C18/C20/C24/C24:1)標準品(Avanti Polar Lipids公司)、LC-MS級甲醇、乙腈、氯仿(美國Sigma公司)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)(人IL-1β)試劑盒(CK-E10083H，蘇州卡爾文生物公司)、ELISA(人IL-18)試劑盒(CK-E10092H，蘇州卡爾文生物公司)。

1.4 方法

1.4.1 資料收集 收集研究對象的一般情況包括年齡、性別、職業(yè)、BMI、吸煙飲酒史、既往病史、飲食習慣等，實驗室檢查指標包括空腹血糖(fasting plasma glucose，F(xiàn)PG)、空腹胰島素(fasting serum insulin，F(xiàn)INS)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、三酰甘油(triglyceride，TG)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)及低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)。

1.4.2 脂肪組織Cer檢測 稱取100 mg脂肪組織于EP管中，加入1 mL無水乙醇，用磁珠在4℃下充分研磨和勻漿。取100 μL上層勻漿，加入500 μL氯仿和20 μL內(nèi)標(C17，1 μg/mL)，渦旋10 min。取氯仿層加入500 μL超純水渦旋5 min，重復兩次。4℃下12 000 r/min離心10 min，轉(zhuǎn)移下層萃取液至1.5 mL EP管，氮吹萃取液。復溶后，超聲、渦旋和離心，用1 mL注射器吸取復溶液過0.22 μm的有機濾膜，轉(zhuǎn)移到進樣小瓶。C18色譜柱分離神經(jīng)酰胺。流動相A：乙腈/水(6∶4，V/V)+0.1%甲酸+0.1%甲酸銨；流動相B∶乙腈/異丙醇(1∶9，V/V)+0.1%甲酸+0.1%甲酸銨，梯度洗脫程序：0～3 min，50%A；4～12.5 min，30%A；12.5～14 min，50%A。流速0.3 mL/min，進樣體積為5 μL。質(zhì)譜條件：大氣化學離子源；正離子模式；噴射電壓：4 500 V；毛細管溫度：320℃；輔助燃氣加熱器溫度：200℃；氮氣用于噴霧穩(wěn)定和碰撞。所有Cer均采用平行反應監(jiān)測進行定量。使用內(nèi)標法進行數(shù)據(jù)處理，并用脂肪組織10 mg濕重進行校正。

1.4.3 血清和脂肪組織炎性細胞因子檢測 全血離心后分離血清，脂肪組織剪碎加PBS低溫研磨勻漿，吸取中間層勻漿液進行測定。用ELISA試劑盒測定血清和脂肪組織IL-1β、IL-18含量，根據(jù)試劑盒說明操作。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者一般資料比較 共收集行減重手術(shù)的200例肥胖患者為研究對象，其中男性74例，女性126例，年齡18～58歲，平均(32.17±7.79)歲。OD組患者56例，男性26例，女性30例，平均年齡(34.05±8.21)歲， BMI(42.91±8.06)kg/m；OND組144例，男性48例，女性96例，平均年齡(31.43±7.53)歲，BMI(40.17±7.43)kg/m。OD組患者年齡、BMI均高于OND組，差異有統(tǒng)計學意義(

t

=2.157，

P

=0.032；

Z

=-2.375，

P

=0.018)；兩組患者性別構(gòu)成的差異無統(tǒng)計學意義(

χ

=2.966，

P

=0.083)。數(shù)值型變量按四分位數(shù)間距分層，OD組31～58歲患者比例高于OND組，OD組患者的FPG、FINS、HOMA-IR高于OND組，差異均有統(tǒng)計學意義(

P

<0.05)，兩組患者BMI、TC分布進行比較，差異有統(tǒng)計學意義(

P

<0.05)。見表1。

表1 兩組患者一般資料比較

2.2 兩組患者脂肪組織Cer濃度比較 脂肪組織Cer測定結(jié)果顯示，C16-Cer含量最高，其次為C24:1-Cer。OD組患者脂肪組織C16-Cer、C18-Cer、C24:1-Cer、C24-Cer及總Cer高于OND組患者，差異有統(tǒng)計學意義(

P

<0.05)，而C20-Cer的差異無統(tǒng)計學意義(

P

>0.05)。見圖1。

圖1 兩組患者脂肪組織Cer濃度比較(*P<0.05)

2.3 兩組患者炎性細胞因子比較 OD組患者血清與脂肪組織炎性細胞因子IL-1β、IL-18濃度均高于OND組，差異有統(tǒng)計學意義(

P

<0.05)。見圖2。

圖2 兩組患者炎癥因子水平比較(*P<0.05)

2.4 脂肪組織Cer濃度與炎性細胞因子水平的相關(guān)性 Spearman相關(guān)分析顯示，脂肪組織Cer濃度與炎性細胞因子IL-1β、IL-18水平存在正相關(guān)，秩相關(guān)系數(shù)均有統(tǒng)計學意義(

P

<0.05)。見表2。

表2 肥胖患者脂肪組織Cer與炎性細胞因子的相關(guān)性(n=200)

2.5 脂肪組織Cer與肥胖并發(fā)糖尿病關(guān)系的logistic回歸分析 以肥胖患者是否并發(fā)糖尿病作為因變量(非糖尿病=0，并發(fā)糖尿病=1)，將一般資料比較有差異的指標納入到多因素logistic回歸進行分析，賦值方法：年齡分組(18歲～=1，31～58歲=2)；BMI分組(28.12 kg/m～=1，35.41 kg/m～=2，39.68 kg/m～=3，45.28～68.11 kg/m=4)；總Cer分組(66.22 ng/10 mg～=1，111.94 ng/10 mg～=2，134.37 ng/10 mg～=3，156.71～262.18 ng/10 mg=4)；TC分組(2.75 mmol/L～=1，4.12 mmol/L～=2，4.75 mmol/L～=3，5.52～12.39 mmol/L=4)，采用逐步回歸法?；貧w結(jié)果顯示，肥胖患者年齡、BMI、TC以及脂肪組織總Cer是糖尿病發(fā)病的危險因素，見表3。其中以Cer≤111.94 ng/10 mg組為參比，Cer>156.71 ng/10 mg組患者并發(fā)糖尿病的

OR

值(95%CI)為5.995(1.678～21.412)。

表3 肥胖并發(fā)糖尿病危險因素的多因素logistic回歸分析

3 討論

2型糖尿病是指胰島素不能發(fā)揮有效生物學作用，導致機體出現(xiàn)高血糖狀態(tài)。脂肪組織作為重要的胰島素靶組織，在調(diào)節(jié)葡萄糖穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。近年來，減重手術(shù)在代謝綜合征治療中的作用逐漸受到關(guān)注。本研究通過對臨床進行減重手術(shù)的肥胖患者脂肪組織代謝產(chǎn)物Cer及炎性細胞因子進行檢測，探討脂肪組織Cer與肥胖患者脂肪組織炎癥及糖尿病發(fā)病的相關(guān)性，為肥胖并發(fā)糖尿病的防治提供依據(jù)。

本研究發(fā)現(xiàn),OD組患者血清及脂肪組織的炎性因子水平高于OND組，提示糖尿病患者有著更強的炎癥狀態(tài)。肥胖作為一種慢性低度炎癥狀態(tài)，可引起代謝紊亂，是糖尿病的重要危險因素。2型糖尿病與其重要的前驅(qū)癥狀胰島素抵抗均屬于代謝異常狀態(tài)，與炎癥聯(lián)系密切，肥胖相關(guān)炎癥可能通過激活多條信號通路，干擾胰島素作用，導致胰島素抵抗及2型糖尿病。

肥胖人群脂肪組織的功能障礙與代謝穩(wěn)態(tài)破壞、胰島素抵抗及2型糖尿病有關(guān)，而這可能是由Cer的過度積累導致。本研究發(fā)現(xiàn),OD組患者脂肪組織Cer水平高于OND組，與報道顯示的肥胖胰島素抵抗人群骨骼肌Cer含量增加，2型糖尿病患者血漿Cer升高且與胰島素抵抗相關(guān)等結(jié)果相似，提示組織和循環(huán)中的Cer在胰島素抵抗及2型糖尿病發(fā)病中有著重要作用。脂肪組織是重要的胰島素靶部位，脂肪組織Cer的積累，可能激活Nlrp3炎癥小體，增加炎癥因子IL-1β、IL-18等釋放，而釋放的炎癥因子通過抑制蛋白激酶B來干擾胰島素信號轉(zhuǎn)導，進而降低胰島素作用，導致出現(xiàn)胰島素抵抗及2型糖尿病。本研究結(jié)果顯示,脂肪組織Cer含量與炎性細胞因子IL-1β、IL-18水平呈正相關(guān)，表明脂肪組織積累的Cer可能會影響脂肪組織炎性細胞因子分泌，干擾脂肪組織胰島素信號轉(zhuǎn)導，促進胰島素抵抗及2型糖尿病的發(fā)生。

綜上所述，本研究通過對肥胖人群脂肪組織Cer進行檢測，發(fā)現(xiàn)脂肪組織Cer與脂肪炎癥及2型糖尿病發(fā)病具有相關(guān)性，脂肪組織Cer可能通過影響脂肪組織炎癥參與肥胖患者2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展。同時本研究存在一些局限，由于研究對象來源于一家醫(yī)院，樣本量有限，代表性可能不夠，結(jié)果可能存在一定偏倚，需要進一步多中心大樣本研究進行驗證；基于限制，研究無法取得健康人群的脂肪組織作為對照。但本研究以脂肪組織Cer為切入點，為肥胖并發(fā)糖尿病的防治提供了新的思路。