馬曉程 趙亞君 毛世剛△

祛寒逐風(fēng)顆粒主要由黑順片、制川烏、秦艽、威靈仙、細(xì)辛、花椒、麩炒白術(shù)、澤瀉、制龜甲、制鱉甲和川芎組成，具有溫經(jīng)活絡(luò)、除濕消腫、活血止痛和益腎強(qiáng)筋之效[1]。最早是由武威漢代醫(yī)簡“傷寒逐風(fēng)方”結(jié)合基礎(chǔ)臨床應(yīng)用加減形成的藥方，臨床主要用來治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨性關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊椎炎、肩周炎等風(fēng)寒痹癥[2]。但是祛寒逐風(fēng)顆粒對(duì)膝骨性關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制依然不太清晰，因此，本研究探討祛寒逐風(fēng)顆粒對(duì)膝骨性關(guān)節(jié)炎(KOA)大鼠炎癥反應(yīng)和NF-κB介導(dǎo)NLRP3炎性小體活化的作用，為臨床使用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組

SPF級(jí)別SD大鼠48只，雌性，體質(zhì)量200～250 g，購買于山東大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心(許可證號(hào)為SCXK(魯)2019-0001)，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、祛寒逐風(fēng)顆粒3 g/kg(低劑量組)、祛寒逐風(fēng)顆粒6 g/kg(中劑量組)、祛寒逐風(fēng)顆粒9 g/kg(高劑量組)、陽性對(duì)照組(雙氯芬酸鈉腸溶片，4 mg/kg)，各8只。

1.2 主要試劑

雙氯芬酸鈉腸溶片(北京諾華制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H11021640)，IL-1β(貨號(hào)1910122)、TNF-α(貨號(hào)1917202)和IL-6(貨號(hào)1910602)大鼠ELISA試劑盒(達(dá)科為，北京)，p-p65(3033號(hào))、p65(8242號(hào))、p-IκBα(8219號(hào))、NLRP3(15101號(hào))、Caspase-1 p20(4199號(hào))、IL-1β p17(12703號(hào))抗體均購自CST(美國)。

1.3 KOA模型建立

如前所述，采用前交叉韌帶橫斷(ACLT)外科手術(shù)建立大鼠模型[3]。異氟烷-氧氣麻醉大鼠，固定于實(shí)驗(yàn)操作臺(tái)，用電動(dòng)剪刀將左后肢的前部刮毛并用乙醇清洗。沿膝蓋骨內(nèi)側(cè)邊界垂直切開膝蓋骨周圍的皮膚。將膝蓋骨橫向移位，露出前交叉韌帶。隨后，用手術(shù)剪刀將前交叉韌帶切開，不損傷脛骨軟骨。然后將膝蓋骨放回原處，并用縫合線閉合筋膜和皮膚。手術(shù)后肌肉注射4 d氨芐青霉素(4 × 104U/d)，假手術(shù)組在沒有其他任何處理的情況下縫合傷口。

1.4 藥物干預(yù)處理

根據(jù)體表面積法將人體劑量折算為大鼠劑量，同時(shí)根據(jù)之前文獻(xiàn)描述給藥[4]，祛寒逐風(fēng)顆粒3 g/kg(低劑量組)、祛寒逐風(fēng)顆粒6 g/kg(中劑量組)、祛寒逐風(fēng)顆粒9 g/kg(高劑量組)灌胃給予相對(duì)應(yīng)的藥物劑量，陽性藥組給予雙氯芬酸鈉腸溶片4 mg/kg，假手術(shù)組和模型組均給予等體積生理鹽水。

1.5 機(jī)械性痛閾值測量

機(jī)械止痛儀(BME-404，天津)評(píng)估后爪縮回的機(jī)械性異常性疼痛，簡要如下：將大鼠放在金屬網(wǎng)地板的籠子里，通過不銹鋼絲(直徑0.6 mm)線性增加施加力，以機(jī)械刺激后爪，施加50 g質(zhì)量的臨界值以防止組織損傷，重復(fù)3次，取平均值。

1.6 膝關(guān)節(jié)直徑測量

游標(biāo)卡尺用于評(píng)估大鼠膝關(guān)節(jié)直徑，簡要如下：將大鼠固定，使用游標(biāo)卡尺測量大鼠的膝關(guān)節(jié)直徑，連續(xù)測量3次，取平均值。

1.7 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測

大鼠腹主動(dòng)脈取血，收集于1.5 mL EP管，室溫靜置30 min，然后于1 000g離心5 min，收集上清，根據(jù)制造商說明檢測大鼠血清中IL-1β、TNF-α和IL-6含量。

1.8 實(shí)時(shí)PCR檢測

稱取10 mg關(guān)節(jié)軟骨，根據(jù)制造商的說明用總RNA提取試劑(Vazyme，中國)提取組織RNA。使用Gene Quant Prospectrophotometer(Amersham Biosciences，美國)的分光光度法測量RNA的濃度。通過HiScriptTMQ-RT Super Mix(Fcmacs，中國)將RNA(1 μg)反轉(zhuǎn)錄為cDNA。qRT-PCR由SYBRs Green Master Mix (Fcmacs，中國)在iCycleriQTM5多色實(shí)時(shí)PCR檢測系統(tǒng)(Bio-Rad，美國)進(jìn)行，引物序列見表1。

表1 實(shí)時(shí)PCR引物序列

1.9 病理學(xué)檢查

采用蘇木精-伊紅(HE)染色和阿爾新藍(lán)染色檢測軟骨損傷。將大鼠離體的膝蓋關(guān)節(jié)在含福爾馬林的磷酸鹽緩沖液中固定7 d，然后在10%EDTA脫鈣液中脫鈣1周，用自動(dòng)組織處理裝置將組織脫水，染色，顯微鏡拍照觀察。

1.10蛋白免疫印跡法

稱取10 mg關(guān)節(jié)軟骨，采用蛋白提取分離試劑盒提取組織總蛋白，使用BCA試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度。使用SDS PAGE凝膠分離蛋白質(zhì)(上樣量20 μg)，并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素(PVDF)膜。在室溫下，將膜密封在5%脫脂牛奶中2 h，并在4 ℃下與以下一抗孵育過夜：p-p65、p65、p-IκBα、NLRP3、Caspase-1 p20、IL-1β p17和β-actin(稀釋比例1∶1 000)。第2天，將硝酸纖維素膜洗滌3次，并與HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗(稀釋比例1∶200 000)室溫孵育2 h，使用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測蛋白條帶，β-actin作為蛋白內(nèi)參，通過ImageJ Software 7.0進(jìn)行光密度分析。

1.11統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 祛寒逐風(fēng)顆粒對(duì)KOA大鼠機(jī)械性痛閾值和腫脹的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠的機(jī)械性痛閾值明顯減小，祛寒逐風(fēng)顆粒低劑量組、中劑量組、高劑量組和陽性藥組大鼠的機(jī)械性痛閾值較模型組明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖1a)。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠的膝關(guān)節(jié)直徑明顯增加，祛寒逐風(fēng)顆粒低劑量組、中劑量組、高劑量組和陽性藥組大鼠的膝關(guān)節(jié)直徑明顯減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖1b)。

圖1 祛寒逐風(fēng)顆粒對(duì)KOA大鼠機(jī)械性痛閾值和膝關(guān)節(jié)直徑的影響

2.2 祛寒逐風(fēng)顆粒對(duì)KOA大鼠血清中炎癥因子的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清中IL-1β、TNF-α和IL-6含量顯著增加，祛寒逐風(fēng)顆粒低劑量組、中劑量組、高劑量組和陽性藥組較模型組大鼠血清中IL-1β、TNF-α和IL-6含量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2(a，b)。

圖2 祛寒逐風(fēng)顆粒對(duì)KOA大鼠血清中炎癥因子的影響

2.3 祛寒逐風(fēng)顆粒對(duì)KOA大鼠組織中炎癥因子的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠組織中IL-1β、TNF-α和IL-6 mRNA水平顯著上調(diào)，祛寒逐風(fēng)顆粒低劑量組、中劑量組、高劑量組和陽性藥組較模型組大鼠組織中IL-1β、TNF-α和IL-6 mRNA水平顯著下調(diào)(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖3(a，b)。

圖3 祛寒逐風(fēng)顆粒對(duì)KOA大鼠組織中炎癥因子的影響

2.4 祛寒逐風(fēng)顆粒對(duì)KOA大鼠病理學(xué)變化的影響

病理組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)假手術(shù)組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織正常，模型組大鼠膝關(guān)節(jié)出現(xiàn)嚴(yán)重變性，并伴有嚴(yán)重的軟骨損傷和大規(guī)模的軟骨纖維化，祛寒逐風(fēng)顆粒低劑量組、中劑量組、高劑量組和陽性藥組較模型組大鼠的軟骨損傷和軟骨纖維化緩解，見圖4。

圖4 祛寒逐風(fēng)顆粒對(duì)KOA大鼠病理學(xué)變化的影響(黃色三角形表示基質(zhì)損傷；紅色三角形表示軟骨變性)

2.5 祛寒逐風(fēng)顆粒對(duì)KOA大鼠軟骨組織中NLRP3炎性小體活化的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠軟骨組織中Caspase-1 p20、IL-1β p17和NLRP3含量顯著增加，祛寒逐風(fēng)顆粒低劑量組、中劑量組、高劑量組和陽性藥組較模型組大鼠血清中Caspase-1 p20、IL-1β p17和NLRP3含量顯著降低(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖5。

圖5 祛寒逐風(fēng)顆粒對(duì)KOA大鼠軟骨組織中NLRP3炎性小體活化的影響

2.6 祛寒逐風(fēng)顆粒對(duì)KOA大鼠滑膜組織中NF-κB信號(hào)活化的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠軟骨組織中p-p65和p-IκBα含量顯著增加，祛寒逐風(fēng)顆粒低劑量組、中劑量組、高劑量組和陽性藥組較模型組大鼠血清中p-p65和p-IκBα含量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖6。

圖6 祛寒逐風(fēng)顆粒對(duì)KOA大鼠軟骨組織中NF-κB信號(hào)活化的影響

3 討論

骨關(guān)節(jié)炎屬中醫(yī)學(xué)“骨痹”“筋痹”范疇，發(fā)病與腎虛關(guān)系密切，本病病機(jī)為本虛標(biāo)實(shí)，肝腎虧虛為其本，風(fēng)寒濕痹阻經(jīng)脈為其標(biāo)，加之本病遷延難愈，日久成瘀，故中醫(yī)臨床多從補(bǔ)益肝腎、祛風(fēng)除濕、散寒止痛、活血化瘀等方面治療[5]。祛寒逐風(fēng)顆粒以黑順片、制川烏、秦艽、威靈仙、細(xì)辛、花椒、麩炒白術(shù)、澤瀉、制龜甲、制鱉甲和川芎為處方，主要以黑順片和制川烏為君藥，兩藥同用，通十二經(jīng)，走里達(dá)表，黑順片具有逐風(fēng)寒濕邪之功效，制川烏祛風(fēng)除濕，溫經(jīng)止痛，秦艽祛風(fēng)濕，退虛熱，舒筋止疼，威靈仙祛風(fēng)除濕，通絡(luò)止痛，細(xì)辛和花椒祛風(fēng)散寒，麩炒白術(shù)和澤瀉具有除濕之功效，再加具有補(bǔ)腎和化瘀之效的制龜甲、制鱉甲和川芎，故祛寒逐風(fēng)顆粒具有溫經(jīng)活絡(luò)、除濕消腫、活血止痛和益腎強(qiáng)筋之效[6]。本研究發(fā)現(xiàn)祛寒逐風(fēng)顆粒對(duì)骨關(guān)節(jié)炎具有治療作用，并且能夠抑制KOA大鼠的炎癥反應(yīng)和NF-κB介導(dǎo)的NLRP3炎性小體活化。

炎癥反應(yīng)和軟骨損傷是骨關(guān)節(jié)炎的典型病理特征，盡管KOA病因尚不清楚，但炎癥與骨關(guān)節(jié)炎病理發(fā)展密切相關(guān)[7-9]。關(guān)節(jié)發(fā)炎可直接導(dǎo)致KOA疼痛發(fā)作，加劇軟骨損傷，并可能導(dǎo)致持續(xù)的疼痛敏感性，最終演變?yōu)槁蕴弁碵10]。本研究發(fā)現(xiàn)祛寒逐風(fēng)顆粒能夠緩解KOA大鼠的膝關(guān)節(jié)腫脹和疼痛，并且抑制炎癥因子的釋放。中藥黑順片具有抗炎活性，制川烏對(duì)小鼠慢性炎癥性疼痛具有緩解作用，秦艽對(duì)多種動(dòng)物炎癥模型均表現(xiàn)良好的抗炎活性。除此之外，秦艽的主要活性成分龍膽苦苷對(duì)早期炎癥反應(yīng)具有緩解作用，同時(shí)還具有抗炎鎮(zhèn)痛、保肝及抗腫瘤等多種活性，威靈仙所含活性成分齊墩果酸具有抗炎活性，綜合考慮，祛寒逐風(fēng)顆粒處方具有普遍的抗炎和鎮(zhèn)痛活性，最后對(duì)骨關(guān)節(jié)炎起到治療作用[11-13]。

研究人員發(fā)現(xiàn)在KOA的早期階段，靶向炎癥反應(yīng)可以延遲或預(yù)防膝關(guān)節(jié)軟骨損傷和骨贅形成[14]?；そM織中的滑膜成纖維細(xì)胞是滑膜炎的效應(yīng)細(xì)胞，并且是人體組織和器官中的特定駐留細(xì)胞，主要功能是在傷口愈合期間維持細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)并促進(jìn)恢復(fù)和健康[15]。IL-1β是與KOA發(fā)病有關(guān)的關(guān)鍵炎癥因子。關(guān)于IL-1β的抗炎研究非常廣泛，可以獨(dú)立誘導(dǎo)與多種信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制相關(guān)的炎癥反應(yīng)和分解代謝作用，同時(shí)IL-1β與KOA疼痛高度相關(guān)[16]。例如，IL-1β阻止軟骨細(xì)胞合成ECM，并干擾Ⅱ型膠原和蛋白聚糖的合成。IL-1β通過自分泌途徑直接影響關(guān)節(jié)的滑膜細(xì)胞和軟骨細(xì)胞，并增加一系列細(xì)胞因子和酶(例如PGE2和IL-6)的產(chǎn)生[14]。本研究發(fā)現(xiàn)祛寒逐風(fēng)顆粒能夠抑制KOA大鼠炎癥反應(yīng)，降低血清中IL-1β、IL-6和TNF-α含量，病理學(xué)發(fā)現(xiàn)祛寒逐風(fēng)顆粒能夠緩解大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨損傷和纖維化。

近年NLRP3炎性小體在炎癥中的作用引起了人們的關(guān)注，并且對(duì)自身免疫性疾病、神經(jīng)退行性疾病、代謝性疾病進(jìn)行了大量研究[17]。研究證實(shí)NLRP3介導(dǎo)的慢性無菌性炎癥研究正變得越來越普遍，并且KOA中也發(fā)現(xiàn)了NLRP3活化[18]。NLRP3炎性小體與KOA的發(fā)病機(jī)理密切相關(guān)，NLRP3炎性小體對(duì)于IL-1β的調(diào)節(jié)和釋放起著至關(guān)重要的作用，并涉及KOA的軟骨破壞和炎癥反應(yīng)[19]。NLRP3激活的兩個(gè)信號(hào)模型調(diào)控，包括第一步轉(zhuǎn)錄水平的激活信號(hào)和第二步裝配的激活信號(hào)[20]。最終，NLRP3，ASC和Caspase-1結(jié)合形成炎性小體，pro-Caspase-1轉(zhuǎn)換為Caspase-1 p20，后者將pro-IL-1β轉(zhuǎn)換為成熟的活性形式(IL-1β)。在關(guān)節(jié)疾病的研究中發(fā)現(xiàn)，Caspase-1是骨關(guān)節(jié)炎和軟骨加速破壞的危險(xiǎn)因素之一[21]。核因子-κB(NF-κB)信號(hào)是體內(nèi)重要的NLRP3炎性小體激活的調(diào)節(jié)通路，細(xì)胞正常情況下，NF-κB和抑制蛋白IκBα在細(xì)胞質(zhì)中以無活性復(fù)合物的形式存在，外源性刺激、活性氧的積累或有毒代謝產(chǎn)物可促進(jìn)IκBα磷酸化和泛素化，從而導(dǎo)致NF-κB磷酸化并轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核[22]。NF-κB途徑的激活可能觸發(fā)NLRP3的表達(dá)和NLRP3炎性小體的組裝[23]。同時(shí)，NF-κB信號(hào)活化也能夠調(diào)節(jié)促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的釋放，參與KOA的病理形成和發(fā)展[24]。本研究發(fā)現(xiàn)祛寒逐風(fēng)顆粒能夠抑制KOA大鼠軟骨組織中NF-κB信號(hào)通路活化，同時(shí)也能夠抑制NLRP3炎性小體活化。

綜上所述，本研究發(fā)祛寒逐風(fēng)顆?？赡芡ㄟ^抑制NF-κB介導(dǎo)的NLRP3炎性小體活化顯著改善KOA大鼠的炎癥反應(yīng)并緩解疼痛，對(duì)骨關(guān)節(jié)炎發(fā)揮治療作用。但是祛寒逐風(fēng)顆粒含有多種中藥材，其成分復(fù)雜以及靶點(diǎn)較多，仍需進(jìn)一步探索。