羅梅英 凌銘旺 詹洲玲 鄭將鴻 鐘曉彤 歐春秀 梁櫻倩 馮 鑫 王瑞曉 黃得純 張輝華 柒啟恩,2*

(1.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，佛山 528231；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，廣東省動(dòng)物營養(yǎng)調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510642)

細(xì)胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)是細(xì)胞分泌至胞外的膜性囊泡[1]。近年來，關(guān)于它作為細(xì)胞間新“細(xì)胞信使”的研究越來越多，且受到廣泛的重視[2-3]。在各種原核和真核微生物中，許多細(xì)胞因子與EVs有關(guān)，EVs運(yùn)輸是一種普遍現(xiàn)象[3-4]。EVs由真核生物、古細(xì)菌和細(xì)菌產(chǎn)生，由脂質(zhì)雙分子層組成，形成直徑從20～500 nm不等的含腔球體[5]。研究顯示，EVs參與腫瘤進(jìn)展、免疫調(diào)節(jié)、新陳代謝、腸道微生物區(qū)系的塑造等過程[6-10]。細(xì)菌來源的EVs于1965年首次在大腸桿菌中被發(fā)現(xiàn)[11]。細(xì)菌來源的EVs攜帶多種物質(zhì)，包括毒力因子、黏附素、DNA、RNA、毒素、免疫調(diào)節(jié)因子和營養(yǎng)清除因子，與細(xì)胞毒性、宿主細(xì)胞入侵、膜融合、生物膜的產(chǎn)生、病毒入侵、DNA傳遞、受體響應(yīng)和抗生素耐藥蛋白的轉(zhuǎn)移過程相關(guān)[12-13]。

葡萄球菌是一種圓形或卵圓形的革蘭氏陽性球菌，呈葡萄狀，無鞭毛，無莢膜，不產(chǎn)生芽孢[14]。臨床上，葡萄球菌病主要是由金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)引起的。金黃色葡萄球菌是一種常見的人獸共患病原菌，在自然界分布廣泛，可引起人和動(dòng)物感染，也可引起細(xì)菌性食物中毒或飼料中毒[15]，腸毒素是導(dǎo)致金黃色葡萄球菌食物中毒的主要毒力因子[16]。相比金黃色葡萄球菌，關(guān)于溶血性葡萄球菌(Staphylococcushaemolyticus)的研究鮮有報(bào)道。溶血性葡萄球菌是一種凝固酶陰性葡萄球菌，以共生菌的形式存在于皮膚中[17]，是重要的醫(yī)院感染病原菌[18]。酚可溶性調(diào)節(jié)肽(phenol-soluble modulins,PSM)是溶血性葡萄球菌的主要毒力因子，是一類具有廣泛的細(xì)胞溶解活性的兩親性肽毒素，包含一種α型PSM和3種β型PSM，4種PSM均具有較強(qiáng)的促炎活性，可促進(jìn)中性粒細(xì)胞趨化[19]。溶血性葡萄球菌來源的細(xì)胞外囊泡(SH-EVs)是否攜帶PSM，是否通過PSM產(chǎn)生促炎活性尚不明確。本試驗(yàn)擬研究SH-EVs對小鼠生長、免疫功能、腸道結(jié)構(gòu)及微生物區(qū)系的影響，以期為細(xì)菌EVs的深入研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株及其培養(yǎng)

溶血性葡萄球菌為本實(shí)驗(yàn)室保存菌種，由生工生物工程(上海)股份有限公司通過16S rRNA基因測序進(jìn)行菌種鑒定，采用YPD液體培養(yǎng)基(含1.0%酵母提取物、2.0%蛋白胨、2.0%葡萄糖)于30 ℃下在轉(zhuǎn)速為200 r/min的水平搖床上振蕩培養(yǎng)14～16 h至OD600 nm達(dá)到1.0～1.5。

1.2 SH-EVs的分離、純化與鑒定

將保存的溶血性葡萄球菌菌種復(fù)蘇，在新鮮LB液體培養(yǎng)基中于30 ℃下在轉(zhuǎn)速為200 r/min的水平搖床上擴(kuò)大培養(yǎng)，使OD600 nm達(dá)到1.0～1.5；然后將培養(yǎng)物于4 ℃、2 000×g離心10 min；收集上清于4 ℃、10 000×g離心30 min；取上清經(jīng)過超速離心機(jī)于4 ℃、120 000×g離心90 min，得到SH-EVs沉淀，將獲得SH-EVs沉淀經(jīng)過磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸后再一次經(jīng)超速離心機(jī)于4℃、120 000×g離心90 min，富集得到的沉淀即為純化的SH-EVs，純化后的SH-EVs用PBS重懸，放入-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

將10 μL SH-EVs的PBS懸液滴加于銅網(wǎng)上沉淀20 min，用濾紙吸去浮液，接著再用蒸餾水漂洗1～3次。吸取2%的醋酸雙氧鈾10 μL滴加于銅網(wǎng)上沉淀1 min，濾紙吸去浮液后常溫干燥15 min，通過JEM-2000EX透射電子顯微鏡(transmission electron microscopy,TEM)來觀察SH-EVs的外部形態(tài)特征[20]。利用納米顆粒跟蹤分析儀(Zetasizer Nano ZS)來測定EVs的粒徑[21]。利用二奎啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒測定SH-EVs的蛋白質(zhì)濃度。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)動(dòng)物為無特定病原體(SPF)級(jí)的健康雄性C57BL/6小鼠，14～17 g，28～30日齡，購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK(粵)2018-0002。飼養(yǎng)環(huán)境溫度保持在(22±2)℃，相對濕度保持在(50±10)%，光照周期為12 h光照/12 h黑暗。動(dòng)物試驗(yàn)開始前先使小鼠習(xí)慣動(dòng)物設(shè)施1周，動(dòng)物試驗(yàn)按照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》(2017年修訂)執(zhí)行。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取20只小鼠，采用完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)分為2個(gè)組，每組10個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1只小鼠。參照Teng等[9]的方法，每隔1 d給試驗(yàn)組小鼠灌服150 μL SH-EVs懸液(含500 μg SH-EVs)，給對照組小鼠灌服150 μL PBS，共灌服3次。試驗(yàn)期為5 d。試驗(yàn)期內(nèi)自由飲水、自由采食。試驗(yàn)飼糧為購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心的小鼠標(biāo)準(zhǔn)飼糧。

1.5 樣品采集

1.5.1 小鼠生長性能數(shù)據(jù)采集

在試驗(yàn)始末清晨對每只小鼠進(jìn)行空腹稱重，記錄個(gè)體重；試驗(yàn)過程中記錄每只小鼠每天的采食量。

1.5.2 小鼠糞便采集

試驗(yàn)結(jié)束當(dāng)天采集小鼠的新鮮糞樣，置于2 mL無菌PE管中，于-80 ℃條件下儲(chǔ)存待測。

1.5.3 小鼠血液采集

試驗(yàn)結(jié)束后利用蘸有異氟烷的棉球?qū)⑿∈舐樽恚缓髮π∈筮M(jìn)行眼球采血，血液靜置1 h后，3 000 r/min離心20 min，分離血清。小心吸取血清分裝于1.5 mL的試管中，于-80 ℃條件下儲(chǔ)存待測。

1.5.4 小鼠回腸組織采集

采血后，斷頸處死小鼠，剖開腹腔，于回腸中段采集2 cm左右的組織樣品，滅菌生理鹽水沖洗干凈，置于4%甲醛緩沖溶液中固定，以備制作切片。

1.6 檢測指標(biāo)與方法

1.6.1 小鼠生長性能指標(biāo)測定

根據(jù)試驗(yàn)始末小鼠體重計(jì)算平均日增重(ADG)；根據(jù)每只小鼠每日的采食量計(jì)算平均日采食量(ADFI)；根據(jù)平均日增重及平均日采食量計(jì)算料重比(F/G)。

1.6.2 小鼠血清免疫指標(biāo)測定

血清腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細(xì)胞介素-10(interleukin-10,IL-10)、免疫球蛋白A(immunoglobulin A,IgA)、免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG)含量均采用上海酶聯(lián)生物科技有限公司生產(chǎn)的試劑盒測定，測定方法按照說明書進(jìn)行。

1.6.3 小鼠腸道形態(tài)觀察

將固定的回腸標(biāo)本經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋、修塊、切片、展片、常規(guī)蘇木精-伊紅(HE)染色等處理后，制成石蠟切片。之后用顯微鏡在40倍下隨機(jī)選擇多個(gè)非連續(xù)性視野觀察切片，并挑選典型視野拍攝成圖片。

1.6.4 小鼠腸道微生物區(qū)系測定

從小鼠糞便樣本中提取基因組DNA后，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度。用帶有barcode的特異引物擴(kuò)增16S rDNA的V3+V4區(qū)，引物序列為:341F，5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′；806R，5′-GGACTACHVGGGTATCTAAT-3′。然后PCR擴(kuò)增產(chǎn)物切膠回收，用QuantiFluorTM熒光計(jì)進(jìn)行定量。將純化的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行等量混合，連接測序接頭，構(gòu)建測序文庫，使用HiSeq2500的PE250模式上機(jī)測序。

測序得到raw reads之后，對低質(zhì)量reads進(jìn)行過濾，再進(jìn)行序列拼接、序列過濾、序列去嵌合體等處理，得到優(yōu)化序列(tags)。用Uparse軟件以97%的一致性(identity)對所有樣品的優(yōu)化序列聚類成為操作分類單元(OTU)，獲得OTU后，根據(jù)分析流程，使用QIIME(version 1.9.1)依次進(jìn)行OTU分析、Alpha多樣性分析、菌群結(jié)構(gòu)分析[22]。

1.7 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2019初步整理后，采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件的獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)法進(jìn)行組間差異顯著性比較，以P<0.05為差異顯著，0.05≤P<0.10為差異有顯著趨勢，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 SH-EVs的生物學(xué)特性

采用差速離心法從溶血性葡萄球菌培養(yǎng)液上清中得到較多的純化SH-EVs(圖1-a)。對純化SH-EVs進(jìn)行TEM觀察(圖1-b)，發(fā)現(xiàn)SH-EVs大小不一，外形呈現(xiàn)圓形或橢圓形，直徑100 nm左右，在20～500 nm范圍之內(nèi)，符合細(xì)菌EVs顆粒粒徑的要求。隨后采用納米顆粒跟蹤分析儀檢測純化SH-EVs的粒徑分布(圖1-c)，結(jié)果顯示模式曲線線條平緩流暢，說明含有的雜質(zhì)較少，純度較好；檢測得到的粒子分布系數(shù)(PDI)為0.271，介于0.08～0.70，證明體系分散度適中，檢測結(jié)果置信度高；平均粒徑為122.5 nm，粒徑主峰為162.3 nm，粒徑20～200 nm百分比為69.9%，與細(xì)菌EVs的理論顆粒粒徑大小基本吻合。

a：分離純化SH-EVs的主要步驟示意圖；b：TEM觀察SH-EVs的形態(tài)；c：Zetasizer Nano ZS檢測SH-EVs的粒徑分布。

2.2 SH-EVs對小鼠生長性能的影響

由表1可知，與對照組相比，小鼠灌服SH-EVs顯著降低了平均日采食量和平均日增重(P<0.05)，有提高料重比的趨勢(P=0.052)，其中平均日采食量降低了4.80%，平均日增重降低了12.87%，料重比提高了9.20%。

表1 SH-EVs對小鼠生長性能的影響

2.3 SH-EVs對小鼠血清免疫指標(biāo)的影響

由表2可知，與對照組相比，小鼠灌服SH-EVs顯著提高了血清TNF-α和IL-10含量(P<0.05)，顯著降低了血清IgA含量(P<0.05)，有降低血清IgG含量的趨勢(P=0.067)，其中TNF-α和IL-10含量分別提高了16.26%和4.54%，IgA和IgG含量分別降低了9.15%和6.03%。

表2 SH-EVs對小鼠血清免疫指標(biāo)的影響

2.4 SH-EVs對小鼠腸道形態(tài)的影響

由圖2可知，對照組小鼠的回腸絨毛生長狀態(tài)良好，完整性好，數(shù)量較多，密度較大；而試驗(yàn)組小鼠的回腸絨毛密度降低，有一定程度的損傷。

PBS代表對照組，SH-EVs代表試驗(yàn)組。下圖同。PBS represented control group and SH-EVs represented test group.The same as below.

2.5 SH-EVs對小鼠腸道微生物區(qū)系的影響

2.5.1 Alpha多樣性分析

目前，我國科技館建設(shè)還處于發(fā)展階段，屬于一個(gè)發(fā)展壯大且沒有前人可以借鑒的行業(yè)，建立科技館行業(yè)自有的職稱評(píng)聘體系，對科技館行業(yè)是一大幸事，有利于科技館從業(yè)者的職業(yè)規(guī)劃和未來發(fā)展，同時(shí)也能有效刺激科技館專業(yè)技術(shù)人才的素質(zhì)發(fā)展和能力提升。目前科技館的職稱評(píng)定工作還在探索嘗試中，存在許多現(xiàn)實(shí)問題，需要提升和改善的地方還有很多，如何盡快設(shè)立合法、合理、科學(xué)自有職稱序列，我們科技館人任重道遠(yuǎn)。

由表2可知，對照組和試驗(yàn)組檢測到的物種數(shù)量均較高，在1 934～2 010個(gè)；覆蓋度也均在99.6%以上，說明測序結(jié)果已基本覆蓋樣本的多樣性。對照組和試驗(yàn)組的Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)均差異不顯著(P>0.05)。

2.5.2 稀釋曲線

通過繪制稀釋曲線可評(píng)價(jià)測序量是否足夠，并能間接反映樣本中物種的豐富程度。由圖3-a可見，各樣本的稀釋曲線趨于平緩或者達(dá)到平臺(tái)期，可以認(rèn)為繼續(xù)增加測序深度已經(jīng)不影響物種多樣性，說明測序量足夠。

2.5.3 韋恩圖

韋恩圖可用于統(tǒng)計(jì)多個(gè)樣本中所獨(dú)有與共有的OTU數(shù)目，能夠比較直觀地表現(xiàn)樣本的OTU數(shù)目組成相似性及重疊情況。由圖3-b可知，對照組和試驗(yàn)組共有1 740個(gè)OTU，對照組獨(dú)有1 355個(gè)OTU，試驗(yàn)組獨(dú)有1 168個(gè)OTU。

2.5.4 基于OTU的主成分分析(PCA)

通過分析不同樣本OTU(97%相似性)組成能夠反映樣本之間的差異和距離，PCA運(yùn)用方差分解，將多組數(shù)據(jù)的差異反映在二維坐標(biāo)圖上，坐標(biāo)軸取能夠最大反映方差值的2個(gè)特征值。由圖3-c可知，對照組與試驗(yàn)組樣本分散較遠(yuǎn)，相似性有較大差異。

表3 Alpha多樣性指數(shù)

圖3 稀釋曲線(a)、韋恩圖(b)和PCA圖(c)

2.5.5 小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)

灌服SH-EVs對小鼠腸道菌群門水平相對豐度的影響如圖4所示。從樣本中獲得的主要菌群分別屬于擬桿菌門(Bacteroidetes)和厚壁菌門(Firmicutes)，在對照組中分別占42.84%和13.19%，在試驗(yàn)組中分別占23.56%和16.99%(圖4-a)。與對照組相比，灌服SH-EVs顯著降低了小鼠腸道Bacteroidetes的相對豐度(P<0.05)，顯著提高了酸桿菌門(Acidobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、變形菌門(Proteobacteria)、浮霉菌門(Planctomycetes)的相對豐度(P<0.05)(圖4-b)。

Bacteroidetes：擬桿菌門；Firmicutes：厚壁菌門；Acidobacteria：酸桿菌門；Actinobacteria：放線菌門；Chloroflexi：綠彎菌門；Proteobacteria：變形菌門；Planctomycetes：浮霉菌門；Verrucomicrobia：疣微菌門；Gemmatimonadetes：芽單胞菌門；Other：其他。

灌服SH-EVs對小鼠腸道菌群屬水平相對豐度的影響如圖5所示。從樣本中獲得的主要菌群分別屬于阿里葉柄菌屬(Alistipes)、毛螺菌科NK4A136組(Lachnospiraceae_NK4A136_group)、螺桿菌屬(Helicobacter)，在對照組中分別占4.44%、3.79%、3.07%，在試驗(yàn)組中分別占6.05%、3.48%、3.70%(圖5-a)。與對照組相比，灌服SH-EVs顯著降低了小鼠腸道普雷沃氏菌科UCG-001(Prevotellaceae_UCG-001)、擬桿菌屬(Bacteroides)、擬普雷沃菌屬(Alloprevotella)的相對豐度(P<0.05)(圖5-b)。

Alistipes：阿里葉柄菌屬；Lachnospiraceae_NK4A136_group：毛螺菌科NK4A136組；Helicobacter：螺桿菌屬；Acidothermus：熱酸菌屬；Prevotellaceae_UCG-001：普雷沃氏菌科UCG-001；Bacteroides：擬桿菌屬；Alloprevotella：擬普雷沃菌屬；Odoribacter：臭味桿菌屬；Other：其他。

灌服SH-EVs對小鼠腸道菌群種水平相對豐度的影響如圖6所示。從對照組樣本中獲得的主要菌群為產(chǎn)酸擬桿菌(Bacteroidesacidifaciens)、Helicobactermastomyrinus、馬賽擬桿菌dnLKV3(BacteroidesmassiliensisdnLKV3)，分別占0.85%、0.77%、0.59%；從試驗(yàn)組樣本中獲得的主要菌群為毛螺菌科細(xì)菌28-4(Lachnospiraceae_bacterium_28-4)、BacteroidesmassiliensisdnLKV3、嗜酸細(xì)小鏈孢菌DSM44928(CatenulisporaacidiphilaDSM44928)，分別占0.73%、0.44%、0.43%(圖6-a)。與對照組相比，灌服SH-EVs顯著降低了小鼠腸道Bacteroidesacidifaciens的相對豐度(P<0.05)，顯著提高了毛螺菌科細(xì)菌COE1(Lachnospiraceae_bacterium_COE1)的相對豐度(P<0.05)(圖6-b)。

Bacteroides acidifaciens：產(chǎn)酸擬桿菌；Bacteroides massiliensis dnLKV3：馬賽擬桿菌dnLKV3；Catenulispora acidiphila DSM44928：嗜酸細(xì)小鏈孢菌DSM44928；Lachnospiraceae_bacterium_28-4：毛螺菌科細(xì)菌28-4；Lachnospiraceae_bacterium_COE1：毛螺菌科細(xì)菌COE1；Pseudomonas geniculate：彎曲假單胞菌；Clostridiales_bacterium_CIEAF_020：梭菌目細(xì)菌CIEAF020；Brevibacillus formosus：美麗短芽胞桿菌；Other：其他。

3 討 論

本試驗(yàn)采用TEM和Zetasizer Nano ZS從形態(tài)學(xué)和顆粒大小對SH-EVs進(jìn)行了系統(tǒng)分析。結(jié)果顯示，大部分SH-EVs粒徑在20～500 nm，外形呈現(xiàn)圓形或橢圓形，符合文獻(xiàn)報(bào)道的關(guān)于細(xì)菌EVs的形態(tài)特征[5]。

本試驗(yàn)研究了SH-EVs對小鼠生長性能、血清免疫指標(biāo)的影響，結(jié)果顯示小鼠灌服SH-EVs后平均日采食量和平均日增重以及血清IgA、IgG含量降低，血清TNF-α和IL-10含量升高。血清免疫球蛋白含量是反映動(dòng)物機(jī)體免疫性能的重要指標(biāo)之一，血清中IgA、IgG含量的降低表明動(dòng)物體免疫機(jī)能減弱；TNF-α和IL-10參與炎性反應(yīng)和免疫反應(yīng)，是炎癥因子[23-25]。溶血性葡萄球菌的典型毒力途徑是：形成生物膜[26]，產(chǎn)生PSM[19]，由于大量的插入序列導(dǎo)致頻繁的表型重排[27]。溶血性葡萄球菌感染主要由血液和器械相關(guān)感染引起，對免疫功能低下患者的影響尤為明顯[28]。溶血性葡萄球菌產(chǎn)生的PSM具有較強(qiáng)的促炎活性[29]，引起發(fā)燒、發(fā)冷、心動(dòng)過速和呼吸急促等癥狀。過激的免疫反應(yīng)以敗血癥為特征[19]。溶血性葡萄球菌通過產(chǎn)生抑制劑作用于淋球菌細(xì)胞的生長和休眠[30]。炎癥反應(yīng)導(dǎo)致采食量減少，進(jìn)而影響動(dòng)物的生長[31]。本試驗(yàn)中，試驗(yàn)組小鼠生長性能的下降可能與灌喂SH-EVs引起的炎癥反應(yīng)有關(guān)。由此可見，SH-EVs的作用與其來源菌(溶血性葡萄球菌)較為相似，提示SH-EVs中可能含有來自于溶血性葡萄球菌的毒力因子PSM。

有些腸道炎癥局限于結(jié)腸和直腸，有些則遍布全腸段[32]。小腸是吸收營養(yǎng)物質(zhì)的主要場所[33]，小腸炎癥直接影響到營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用率。因此，本試驗(yàn)選擇回腸作為觀察點(diǎn)，研究SH-EVs對小鼠腸道形態(tài)的影響，結(jié)果顯示，灌服SH-EVs后小鼠的回腸絨毛密度下降，出現(xiàn)一定程度的損傷。研究顯示溶血性葡萄球菌的毒力因子PSM具有廣泛的細(xì)胞溶解活性[19]。上述結(jié)果再次提示，SH-EVs中可能攜帶了來自于溶血性葡萄球菌的毒力因子PSM，PSM感染腸道上皮細(xì)胞，誘發(fā)了炎癥反應(yīng)和細(xì)胞損傷。

哺乳動(dòng)物的腸道中有數(shù)萬億微生物，被視為是一個(gè)額外的器官。腸道微生物在維持腸道環(huán)境穩(wěn)定和宿主健康方面起著重要作用[34-35]。腸道微生物在宿主免疫系統(tǒng)發(fā)育[36]、腸上皮細(xì)胞分化[35]、腸道黏膜屏障維持[37]中發(fā)揮了重要作用。腸道微生物的組成受多種環(huán)境因素的影響，包括抗生素、生活方式、飲食和衛(wèi)生條件[35]。研究顯示，動(dòng)植物來源的EVs可改變動(dòng)物腸道菌群結(jié)構(gòu)[7-9]。本試驗(yàn)研究了SH-EVs對小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果顯示，從樣本中獲得的最主要菌門是Bacteroidetes，與文獻(xiàn)報(bào)道[38]中關(guān)于小鼠腸道菌群的研究結(jié)果一致。在門水平上，灌服SH-EVs顯著降低了小鼠腸道擬桿菌門的相對豐度，下降幅度高達(dá)52.25%，可見灌服SH-EVs對小鼠腸道菌群產(chǎn)生了較大的影響。在屬水平上，灌服SH-EVs顯著降低了小鼠腸道Prevotellaceae_UCG-001、Bacteroides、Alloprevotella的相對豐度，三者均屬于Bacteroidetes，擬桿菌綱(Bacteroidia)，擬桿菌目(Bacteroidales)。發(fā)生這種變化主要可能是基于Bacteroidales的共同特征，而這種共同特征可能是SH-EVs的作用靶點(diǎn)。Bacteroidales的細(xì)菌可能通過攝取SH-EVs而攝入了PSM，進(jìn)而誘發(fā)了細(xì)胞損傷。

SH-EVs含有哪些主要成分？是否攜帶了PSM，本研究沒有直接的證據(jù)。引起小鼠炎癥反應(yīng)、免疫力下降、腸道菌群紊亂的物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制是什么？還需要更為深入地研究。

4 結(jié) 論

① 灌服SH-EVs降低了小鼠的平均日采食量和平均日增重，進(jìn)而降低了小鼠的生長性能。

② 灌服SH-EVs提高了小鼠血清TNF-α和IL-10含量，降低了血清IgA含量，進(jìn)而降低了小鼠的免疫力。

③ 灌服SH-EVs降低了小鼠回腸絨毛密度，損傷了回腸形態(tài)結(jié)構(gòu)。

④ 灌服SH-EVs，在門水平降低了小鼠腸道Bacteroidetes的相對豐度，提高了Acidobacteria、Chloroflexi、Proteobacteria、Planctomycetes的相對豐度；在屬水平降低了小鼠腸道Prevotellaceae_UCG-001、Bacteroides、Alloprevotella的相對豐度；在種水平降低了小鼠腸道Bacteroidesacidifaciens的相對豐度，提高了Lachnospiraceae_bacterium_COE1的相對豐度。