胡 鮮 王晨昱 劉 娣 龍 靜 范文君 何流琴* 李鐵軍 姚繼明*

(1.湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，動(dòng)物腸道功能與調(diào)控湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長沙 410081；2.中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，畜禽養(yǎng)殖污染控制與資源化技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室，動(dòng)物營養(yǎng)生理與代謝過程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長沙 410125；3.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；4.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，哈爾濱 150086；5.廣東旺大集團(tuán)股份有限公司，廣州 510663)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種在全球范圍內(nèi)流行的嚴(yán)重胃腸道疾病，發(fā)病率極高，嚴(yán)重影響國民的生活質(zhì)量和健康水平[1]。結(jié)腸炎的病因普遍認(rèn)為與感染細(xì)菌或病毒、應(yīng)激、免疫系統(tǒng)失常、菌群失調(diào)等有關(guān)，這些因素往往會(huì)引發(fā)腸黏膜壞死、通透性增加以及腸道黏膜屏障功能損傷等，從而影響動(dòng)物的生長發(fā)育和機(jī)體健康[2]。目前在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域治療UC的方法主要集中于使用抗炎類藥物和免疫抑制劑來減輕腸道炎癥反應(yīng)[3]，這將導(dǎo)致抗藥性及其他副作用，而通過食療方法治療UC則成為安全且有效的方法之一。

氨基酸是哺乳動(dòng)物飲食中重要的營養(yǎng)組成成分，其消化吸收代謝不僅關(guān)系著動(dòng)物整體健康和生產(chǎn)水平，也是維護(hù)腸道健康的關(guān)鍵營養(yǎng)物質(zhì)。其中，天冬氨酸(Asp)是機(jī)體必不可少的一種功能性氨基酸，處于多個(gè)重要代謝過程的中間樞紐位置，在維持腸道生長發(fā)育、黏膜完整及其屏障功能中發(fā)揮重要的生物學(xué)作用[4]。但是近年來關(guān)于Asp的功能研究大多針對L-天冬氨酸(L-Asp)進(jìn)行，對于不同旋光度的D-天冬氨酸(D-Asp)的功能研究則甚少。D-Asp是一種存在于脊椎動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物中的內(nèi)源性氨基酸，在動(dòng)物體內(nèi)由L-Asp經(jīng)D-Asp氧化酶和Asp消旋酶轉(zhuǎn)化或者合成形成，具有調(diào)節(jié)動(dòng)物神經(jīng)、調(diào)控激素分泌、改變腸道微生物菌群區(qū)系等生理功能，對維持動(dòng)物正常的生理功能發(fā)揮關(guān)鍵作用。研究表明，飼糧添加適量D-Asp可通過下調(diào)仔豬空腸中Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)和胞漿內(nèi)模式識(shí)別受體1(NOD1)信號(hào)通路的表達(dá)來提高腸道免疫功能[5]。與L-Asp不同，D-Asp很少作為內(nèi)源性蛋白酶的底物，導(dǎo)致D-Asp對相關(guān)蛋白酶的水解具有抗性，故可利用這種立體化學(xué)優(yōu)勢來提高生物活性分子的體內(nèi)蛋白質(zhì)水解穩(wěn)定性，在抗癌物質(zhì)中加入D-Asp可增加抗癌藥物的半衰期[6]。D-Asp經(jīng)D-氨基酸氧化酶(D-amino acid oxidase，DAO)的氧化脫氨作用產(chǎn)生了抗微生物物質(zhì)過氧化氫(H2O2)，參與機(jī)體的先天免疫防御[7]。因此，D-Asp在選擇性抗炎或抗癌治療中具有多種治療潛力。本研究通過葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium，DSS)誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎模型，探討了直腸灌注不同濃度D-Asp對結(jié)腸炎小鼠腸道抗氧化和免疫功能的影響，為治療結(jié)腸炎疾病提供理論依據(jù)和尋找新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.1.1 試驗(yàn)材料

DSS相對分子質(zhì)量為36 000～50 000，購于合肥博美生物科技有限公司。C57BL/6J雄性小鼠購于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。D-Asp(純度≥99.0%)購自張家港市思普生化有限公司。

1.1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取40只體重相近、健康狀況良好的70日齡C57BL/6J雄性小鼠，初始平均體重為20.98 g，經(jīng)過3 d的適應(yīng)期后，隨機(jī)分為5組，即對照組、0 mmol/LD-Asp組、0.15 mmol/LD-Asp組、2.30 mmol/LD-Asp組和7.70 mmol/LD-Asp組，每組8個(gè)重復(fù)，單籠飼養(yǎng)。試驗(yàn)第1～7天，對照組小鼠正常飲用蒸餾水外，其他各組小鼠均飲用含3.5% DSS的蒸餾水，誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎。研究表明，動(dòng)物體內(nèi)99%的D-Asp被小腸消化吸收[8]，而直腸灌注可將D-Asp直接輸送到病變部位，避免胃腸道消化吸收造成D-Asp損失，使D-Asp在結(jié)腸內(nèi)達(dá)到較高濃度，且作用效果更迅速[9]。因此，從試驗(yàn)第8天開始，對照組和0 mmol/LD-Asp組小鼠直腸灌注0.1 mL生理鹽水，其他各組分別直腸灌注0.1 mL濃度為0.15、2.30和7.70 mmol/L的D-Asp溶液，每隔1 d灌注1次，共灌注5次，于第16天灌注后6 h內(nèi)將小鼠致死，并采集相關(guān)樣本。

1.2 樣品采集

試驗(yàn)結(jié)束后，采用眼眶取血的方法，收集小鼠血液樣本，血液樣本在4 ℃和3 500×g條件下離心10 min，分離獲得血清，在-80 ℃保存待測。血液采集完畢后，采用頸椎脫臼的方法將小鼠致死，迅速剪開腹腔，取出整段結(jié)腸，測定長度，并截取相同部位用4%多聚甲醛固定，做病理組織學(xué)分析，采集結(jié)腸食糜，并將剩余腸段液氮速凍，轉(zhuǎn)存-80 ℃冰箱待用。

1.3 測定指標(biāo)與方法

1.3.1 小鼠體重和采食量

整個(gè)試驗(yàn)過程中，每天稱量記錄小鼠體重，并每2 d記錄1次小鼠采食量。

1.3.2 血清髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)、嗜酸性粒細(xì)胞過氧化物酶(eosinophil peroxidase，EPO)活性和炎癥細(xì)胞因子含量

血清MPO和EPO活性采用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒檢測，試劑盒購自江蘇雨桐生物有限公司，具體操作方法根據(jù)說明書進(jìn)行。血清腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)含量采用ELISA試劑盒檢測，試劑盒購自江蘇雨桐生物有限公司，具體操作方法根據(jù)說明書進(jìn)行。

1.3.3 結(jié)腸腸道組織學(xué)觀察

結(jié)腸經(jīng)4%多聚甲醛固定、脫水透明、石蠟包埋后，切片、脫蠟和蘇木精-伊紅(HE)染色，透明并封片，鏡檢觀察。根據(jù)組織學(xué)評分系統(tǒng)進(jìn)行評分[1]。組織學(xué)評分系統(tǒng)見表1。

表1 組織學(xué)評分系統(tǒng)

1.3.4 實(shí)時(shí)熒光定量

使用Trizol試劑從結(jié)腸組織中分離出總RNA。分離的總RNA用Nano Drop 2000c分光光度計(jì)(Thermo公司，美國)測定RNA濃度和穩(wěn)定性。利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo公司，美國)合成第1條cDNA鏈。每個(gè)樣本用SYBR-Green實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)進(jìn)行3次評估。PCR程序如下：95 ℃ 5 min，在95 ℃下擴(kuò)增45個(gè)周期10 s，60 ℃ 10 s，72 ℃ 15 s，擴(kuò)增檢測白細(xì)胞介素-6(IL-6)、銅鋅超氧化物歧化酶(ZnCuSOD)、谷胱甘肽過氧化物酶4(GPX4)、谷胱甘肽過氧化物酶1(GPX1)、乙酰輔酶A羧化酶(ACC)、天冬氨酸/谷氨酸載體1(SLC25A12)、天冬氨酸/谷氨酸載體2(SLC25A13)和內(nèi)參基因磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)的表達(dá)。使用2-ΔΔCt方法計(jì)算相對表達(dá)量。引物序列見表2。

表2 引物序列

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 22.0的一般線性模型(general linear model)分析主效應(yīng)和互作效應(yīng)，再利用ANOVA程序以及Duncan氏法對數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析，組間差異采用Student-t檢驗(yàn)分析。數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，P>0.05為差異不顯著，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 D-Asp對UC小鼠生長狀況的影響

在試驗(yàn)第1～8天，對照組小鼠精神狀況、飲食及活動(dòng)均正常，毛發(fā)光澤，無便血。與對照組相比較，其他各組小鼠在試驗(yàn)第2天開始精神萎靡，活動(dòng)遲緩，且第8天出現(xiàn)便血現(xiàn)象。如表3所示，各組之間小鼠的初始體重?zé)o顯著差異(P>0.05)。與對照組相比較，其他各組小鼠第5～9天體重顯著低于對照組(P<0.05)，第8天體重達(dá)到最低。第12～14天，與0 mmol/LD-Asp組相比，0.15 mmol/LD-Asp組、2.30 mmol/LD-Asp組和7.70 mmol/LD-Asp組的小鼠體重均顯著提高(P<0.05)，其中7.70 mmol/LD-Asp組的小鼠體重最高。第16天時(shí)，由于小鼠自身調(diào)節(jié)恢復(fù)，各組的小鼠體重均有不同程度地增加，且各組之間無顯著差異(P>0.05)。

表3 D-Asp對UC小鼠體重的影響

如圖1所示，與對照組相比，0 mmol/LD-Asp組的小鼠平均日采食量顯著降低(P<0.05)，而0.15 mmol/LD-Asp組、2.30 mmol/LD-Asp組和7.70 mmol/LD-Asp組小鼠的平均日采食量與對照組無顯著差異(P>0.05)。

數(shù)據(jù)柱形標(biāo)注相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同字母表示差異顯著(P<0.05)。圖2同。

2.2 D-Asp對UC小鼠結(jié)腸腸道組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

如圖2-a所示，與對照組相比，0 mmol/LD-Asp組小鼠結(jié)腸變短、變小，并出現(xiàn)浸血現(xiàn)象，而0.15 mmol/LD-Asp組、2.30 mmol/LD-Asp組和7.70 mmol/LD-Asp組小鼠結(jié)腸出血情況消失，其外觀形態(tài)與對照組相似。

如圖2-b示，0 mmol/LD-Asp組組織學(xué)評分顯著高于其他各組(P<0.05)。

如圖2-c示，HE染色結(jié)果顯示，對照組小鼠結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)清楚，各層清晰可見，黏膜層和黏膜上皮細(xì)胞完整，未見脫落，固有層內(nèi)未見炎癥細(xì)胞浸潤，未見潰瘍；0 mmol/LD-Asp組結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)尚存，但固有層內(nèi)可見大量炎癥細(xì)胞浸潤，腺體被破壞；0.15 mmol/LD-Asp組結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)清晰，黏膜層和黏膜上皮細(xì)胞完整，僅見固有層內(nèi)少量炎癥細(xì)胞浸潤；2.30 mmol/LD-Asp組和7.70 mmol/LD-Asp組結(jié)腸組織未見炎癥細(xì)胞浸潤，腺體排列整齊，絨毛和隱窩結(jié)構(gòu)完整。

藍(lán)圈表示出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤。Blue circles indicate inflammatory cell infiltration.

feed intake of UC mice

2.3 D-Asp對UC小鼠血清炎性細(xì)胞因子含量和抗氧化酶活性的影響

如表4所示，與對照組相比，0 mmol/LD-Asp組血清中IL-1β和TNF-α含量顯著升高(P<0.05)，分別提高了40.51%和45.55%。與0 mmol/LD-Asp組相比，0.15 mmol/LD-Asp組、2.30 mmol/LD-Asp組和7.70 mmol/LD-Asp組血清IL-1β和TNF-α含量不同程度地降低，且呈劑量效應(yīng)；其中7.70 mmol/LD-Asp組血清中IL-1β和TNF-α含量顯著降低(P<0.05)，分別下降了43.81%和38.44%，且與對照組無顯著差異(P>0.05)。

表4 D-Asp對UC小鼠血清炎癥細(xì)胞因子含量和抗氧化酶活性的影響

與對照組相比，0 mmol/LD-Asp組血清中MPO活性上升了4.64%(P>0.05)。與0 mmol/LD-Asp組相比，7.70 mmol/LD-Asp組血清MPO活性下降了32.13%(P>0.05)。與對照組相比，0 mmol/LD-Asp組血清EPO活性顯著升高(P<0.05)，提高了61.45%。與0 mmol/LD-Asp組相比，0.15 mmol/LD-Asp組、2.30 mmol/LD-Asp組和7.70 mmol/LD-Asp組血清EPO活性均不同程度地降低，且呈劑量效應(yīng)；其中，7.70 mmol/LD-Asp組血清EPO活性顯著降低了50.00%(P<0.05)，且與對照組無顯著差異(P>0.05)。

2.4 D-Asp對UC小鼠結(jié)腸中抗氧化酶和Asp轉(zhuǎn)運(yùn)載體mRNA相對表達(dá)量的影響

由表5可知，各組結(jié)腸中GPX4、GPX1和ZnCuSOD的mRNA相對表達(dá)量無顯著差異(P>0.05)。0 mmol/LD-Asp組結(jié)腸中ACCmRNA相對表達(dá)量顯著高于其他各組(P<0.05)，而其他各組之間無顯著差異(P>0.05)。與對照組相比，0 mmol/LD-Asp組結(jié)腸中IL-6 mRNA相對表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，提高了55.16%；與0 mmol/LD-Asp組相比，0.15 mmol/LD-Asp組、2.30 mmol/LD-Asp組和7.70 mmol/LD-Asp組結(jié)腸中IL-6 mRNA相對表達(dá)量均不同程度地降低，其中7.70 mmol/LD-Asp組顯著下降了50.22%(P<0.05)，且與對照組無顯著差異(P>0.05)。與對照組相比，0 mmol/LD-Asp組結(jié)腸中SLC25A12 mRNA相對表達(dá)量顯著增加(P<0.05)；與0 mmol/LD-Asp組相比，0.15 mmol/LD-Asp組、2.30 mmol/LD-Asp組和7.70 mmol/LD-Asp組結(jié)腸中SLC25A12 mRNA相對表達(dá)量均不同程度地降低，且與對照組無顯著差異(P>0.05)。與對照組相比，0 mmol/LD-Asp組結(jié)腸中SLC25A13 mRNA相對表達(dá)量無顯著差異(P>0.05)；與0 mmol/LD-Asp組相比，0.15 mmol/LD-Asp組、2.30 mmol/LD-Asp組和7.70 mmol/LD-Asp組結(jié)腸中SLC25A13 mRNA相對表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，且顯著高于對照組(P<0.05)。

表5 D-Asp對UC小鼠結(jié)腸中抗氧化酶和Asp轉(zhuǎn)運(yùn)載體mRNA相對表達(dá)量的影響

3 討 論

3.1 D-Asp改善UC小鼠生長狀況和腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)

D-Asp是神經(jīng)遞質(zhì)/神經(jīng)調(diào)節(jié)劑，可調(diào)節(jié)激素合成和釋放[10]。研究表明，將D-Asp注射到大鼠體內(nèi)會(huì)導(dǎo)致大鼠血清黃體生成素、睪酮、孕酮、生長激素和催乳素含量升高，引起大鼠促性腺激素釋放激素的釋放，從而調(diào)節(jié)大鼠性腺功能發(fā)育及大鼠的生長發(fā)育[11]?？诜﨑-Asp可線性降低雛雞的直腸溫度來緩解熱應(yīng)激，即使在高環(huán)境溫度條件下，口服適量D-Asp也能顯著降低雛雞的體溫[12]。本試驗(yàn)結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)了這一點(diǎn)，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，直腸灌注7.70 mmol/LD-Asp可提高UC小鼠的體重和平均日采食量，恢復(fù)結(jié)腸炎引起的生長受限，加快小鼠的康復(fù)。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，直腸灌注2.30和7.70 mmol/LD-Asp可有效修復(fù)結(jié)腸形態(tài)結(jié)構(gòu)的損傷和改善細(xì)胞的形態(tài)和數(shù)量，從而促進(jìn)小鼠結(jié)腸損傷恢復(fù)。這可能是因?yàn)镈-Asp在機(jī)體代謝中可轉(zhuǎn)化為鳥氨酸和谷氨酰胺，可調(diào)節(jié)腸上皮細(xì)胞的生長和增殖，為腸道正常生理提供充足的能量，從而促進(jìn)動(dòng)物生長發(fā)育和改善動(dòng)物腸道功能[13]。但具體的研究機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

3.2 D-Asp提高UC小鼠腸道免疫功能

炎性細(xì)胞因子(促炎因子和抗炎因子)的異常分泌或表達(dá)被認(rèn)為是導(dǎo)致結(jié)腸炎發(fā)生和發(fā)展的一個(gè)重要發(fā)病機(jī)制[14]。當(dāng)腸道上皮細(xì)胞損傷后，巨噬細(xì)胞會(huì)被激活，巨噬細(xì)胞將釋放出包括IL-1β、IL-6和TNF-α在內(nèi)的大量炎性細(xì)胞因子，引起腸上皮細(xì)胞損傷，長此以往就會(huì)引發(fā)結(jié)腸炎、結(jié)腸癌等腸道疾病[15]。在UC患者的結(jié)腸組織中發(fā)現(xiàn)IL-6和TNF-α的mRNA相對表達(dá)量顯著增加，證明IL-6和TNF-α是介導(dǎo)結(jié)腸炎的關(guān)鍵細(xì)胞因子[16]。TNF-α能夠通過與腫瘤壞死因子受體-1結(jié)合破壞腸道屏障，誘導(dǎo)UC發(fā)生，還能夠誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生IL-6等細(xì)胞因子和趨化因子，誘導(dǎo)免疫細(xì)胞趨化、浸潤至腸道病灶部位，加劇腸道炎癥，促進(jìn)UC發(fā)展[17]。在小鼠自身免疫性腦脊髓炎模型試驗(yàn)中，D-Asp可通過降低血清IL-6含量和提高總抗氧化能力來緩解自身免疫性腦脊髓炎，并減少自身免疫性腦脊髓炎的發(fā)病[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，直腸灌注7.70 mmol/LD-Asp可有效降低UC小鼠血清IL-1β和TNF-α含量以及降低結(jié)腸中IL-6 mRNA相對表達(dá)量，減少中性粒細(xì)胞等免疫細(xì)胞浸潤，抑制炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生，減少結(jié)腸病灶形成，修復(fù)UC小鼠腸道形態(tài)，有效改善結(jié)腸炎癥狀況。在斷奶仔豬飼糧中添加適量D-Asp可降低腸道放線菌和擬桿菌的相對豐度，增加厚壁菌門的相對豐度，同時(shí)調(diào)控腸道Toll樣受體(TLRs)、胞漿內(nèi)模式識(shí)別受體1(NOD1)和髓樣分化因子(MyD88)mRNA的表達(dá)水平，從而改善腸道免疫功能[19]。由此推測，直腸灌注D-Asp或許也可以通過改變小鼠結(jié)腸腸道菌群區(qū)系來促進(jìn)UC小鼠腸道損傷恢復(fù)，但具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

3.3 D-Asp提高UC小鼠抗氧化能力

當(dāng)動(dòng)物機(jī)體受到應(yīng)激時(shí)，機(jī)體會(huì)產(chǎn)生過量的自由基，破壞機(jī)體的抗氧化防御系統(tǒng)，從而引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)致使腸道功能損傷[20]。有研究表明，D-Asp可通過提高公豬血清和睪丸中抗氧化酶的活性及炎性細(xì)胞因子的分泌來緩解公豬生殖器官的損傷[21]。在雞的早期發(fā)育時(shí)期，靜脈注射D-Asp可以劑量依賴性地減少新生雛雞痛苦發(fā)聲的次數(shù)和主動(dòng)清醒的時(shí)間，從而調(diào)節(jié)雞的行為應(yīng)激反應(yīng)[18]。Erwan等[18]研究表明，口服D-Asp可降低三酰甘油和尿酸含量，增加葡萄糖和氯水平并降低雛雞的直腸溫度，從而緩解家禽的熱應(yīng)激。也有研究表明，在公牛精子培養(yǎng)基中添加D-Asp，可保護(hù)精子在體外處理過程中免受氧化應(yīng)激損傷[22]。ACC是脂肪酸合成過程中的限速酶，抑制ACC活性可減少脂肪的生成，有利于脂質(zhì)氧化，從而防止過量脂質(zhì)在肌肉、心臟和肝臟等組織中的積累[23]。ACC還參與調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的分化和增殖，ACC可能通過調(diào)控免疫細(xì)胞的功能而參與哮喘氣道炎癥的發(fā)生[24]。MPO是一種亞鐵血紅素酶，利用過氧化氫和氯離子產(chǎn)生次氯酸和氯離子，次氯酸是一種導(dǎo)致組織氧化損傷的活性氧物質(zhì)，具有強(qiáng)大的殺滅病原微生物、細(xì)胞毒和解毒作用[25]。因此，正常生理情況下，MPO能殺滅入侵體內(nèi)病原微生物，參與機(jī)體先天性免疫反應(yīng)的一部分。但當(dāng)機(jī)體處于氧化應(yīng)激或炎癥狀態(tài)時(shí)，MPO催化產(chǎn)生的氧化物質(zhì)超過機(jī)體抗氧化能力，破壞機(jī)體氧化-抗氧化系統(tǒng)平衡，從而引發(fā)多種病理現(xiàn)象和組織損傷[25]。直腸灌注7.70 mmol/LD-Asp可下調(diào)機(jī)體MPO的活性，使其維持正常生理水平，從而維持機(jī)體氧化-抗氧化系統(tǒng)平衡。而嗜酸性粒細(xì)胞(EO)是一種炎癥細(xì)胞，可刺激堿性蛋白的釋放，產(chǎn)生炎性介質(zhì)，引發(fā)炎癥反應(yīng)。EO釋放的蛋白酶EPO參與活性氧的細(xì)胞損傷，EPO在體內(nèi)可與過氧化氫和鹵化物反應(yīng)，生成氧化劑[26]。機(jī)體產(chǎn)生過量的EPO會(huì)促進(jìn)機(jī)體炎癥反應(yīng)，并誘發(fā)機(jī)體的氧化應(yīng)激反應(yīng)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，DSS誘導(dǎo)小鼠發(fā)生結(jié)腸炎時(shí)，血清中EPO和MPO活性增加，且結(jié)腸中ACC mRNA相對表達(dá)量也顯著增加，而直腸灌注7.70 mmol/LD-Asp時(shí)降低UC小鼠血清EPO和MPO活性以及結(jié)腸中ACCmRNA相對表達(dá)量，這意味著D-Asp可以通過下調(diào)血清EPO和MPO活性以及結(jié)腸中ACCmRNA相對表達(dá)量，從而減少結(jié)腸炎小鼠脂肪的合成，并調(diào)節(jié)結(jié)腸炎小鼠的炎癥反應(yīng)，減少小鼠體內(nèi)氧化劑的生成，維持UC小鼠機(jī)體的氧化和抗氧化平衡，從而減輕UC小鼠的氧化應(yīng)激反應(yīng)。

3.4 D-Asp改善UC小鼠氨基酸轉(zhuǎn)載體的表達(dá)

SLC25A12和SLC25A13是線粒體Asp-谷氨酸載體的神經(jīng)元亞型，是將氧化還原當(dāng)量從糖酵解轉(zhuǎn)移到線粒體基質(zhì)所必需的蘋果酸-Asp穿梭的組成部分，其在細(xì)胞代謝中起著重要作用，且在炎癥或腫瘤組織中顯著上調(diào)[27]。而SLC25A13是從線粒體基質(zhì)中輸出Asp，以換取細(xì)胞溶質(zhì)谷氨酸和氫離子(H+)，SLC25A13在蘋果酸-Asp穿梭中起關(guān)鍵作用[28]，其表達(dá)的升高可加速機(jī)體能量代謝，產(chǎn)生更多的ATP。本試驗(yàn)結(jié)果也進(jìn)一步驗(yàn)證了上述理論，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，0 mmol/LD-Asp組小鼠結(jié)腸中SLC25A12 mRNA相對表達(dá)量較對照組顯著升高，而經(jīng)7.70 mmol/LD-Asp處理后，其結(jié)腸中SLC25A12 mRNA相對表達(dá)量下降，但SLC25A13 mRNA相對表達(dá)量卻顯著提高，說明直腸灌注D-Asp可有效刺激線粒體基質(zhì)中輸出L-Asp進(jìn)入三羧酸循環(huán)，為機(jī)體提供更多的能量，促進(jìn)腸道損傷修復(fù)。這也進(jìn)一步證實(shí)，當(dāng)小鼠受到應(yīng)激損傷時(shí)，機(jī)體所需能量增加，同時(shí)對D-Asp的需求量也隨之增加，灌注D-Asp可以增加體內(nèi)D-Asp的含量，補(bǔ)充因應(yīng)激造成的D-Asp或L-Asp不足。此外，動(dòng)物神經(jīng)組織中D-Asp的含量與SLC25A12和SLC25A13 mRNA相對表達(dá)量密切相關(guān)，從而調(diào)節(jié)小鼠體內(nèi)D-Asp的轉(zhuǎn)運(yùn)。因D-Asp被證明是一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)，可有效緩解小鼠機(jī)械性異常性疼痛、抑郁及焦慮行為[29]，同時(shí)直腸灌注D-Asp也顯著降低了SLC25A12 mRNA相對表達(dá)量，從而可能會(huì)降低小鼠結(jié)腸炎發(fā)生癌變的風(fēng)險(xiǎn)。

4 結(jié) 論

直腸灌注D-Asp可調(diào)節(jié)UC小鼠血清和結(jié)腸中炎癥細(xì)胞因子的分泌和表達(dá)，調(diào)控抗氧化酶的活性和ACC信號(hào)分子，提高UC小鼠腸道抗氧化和免疫功能，從而促進(jìn)腸道組織損傷的恢復(fù)和改善UC小鼠生長性能，其中以灌注7.70 mmol/LD-Asp效果最好。