黃小流 羅 輝 黃玉珊* 許東風(fēng) 鄧先清 王偉業(yè)

(1.井岡山大學(xué)醫(yī)學(xué)部，吉安 343009；2.江西省紅壤丘陵區(qū)農(nóng)業(yè)環(huán)境污染防控重點實驗室，吉安 343009；3.井岡山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉安 343009)

斷奶期是幼齡哺乳動物“早期斷奶綜合征”發(fā)生的高風(fēng)險期[1-3]。研究發(fā)現(xiàn)，仔豬常在斷奶期間出現(xiàn)腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，是引起疾病發(fā)生的主要病因之一[4-6]。動物腸道內(nèi)數(shù)量龐大的菌群對腸道健康和宿主健康發(fā)揮關(guān)鍵重要作用，其可與宿主進行“信息”交換，能影響宿主腸道的生長、發(fā)育、營養(yǎng)物質(zhì)吸收和免疫力[7]。

近年來，抗生素在動物飼料的長期使用和濫用也帶來了諸多負(fù)面影響，尋找天然產(chǎn)物中的有效成分作為綠色飼料添加劑在動物生產(chǎn)中應(yīng)用越來越廣泛。在飼糧中添加葡萄籽原花青素可顯著改善生長豬結(jié)腸形態(tài)，降低微生物的多樣性，富集產(chǎn)短鏈脂肪酸的菌群[8]。金娜等[9]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加枸杞多糖可提高育肥豬腸道菌群的豐富度和多樣性，能建立更健康的腸道菌群結(jié)構(gòu)。馬齒莧多糖(PortulacaoleraceaL.polysaccharide，POP)是馬齒莧的主要活性成分之一，有抗氧化、抗衰老、免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤等活性，同時又是一種安全、高效、廣譜的抗菌劑[10-14]。馬齒莧是馬齒莧科植物馬齒莧的全草，性寒，味甘酸，入心臟、肝臟、脾臟、大腸，《食療本草》記載用馬齒莧煮粥可達到“止痢、治腹痛”的食療效果[15]。研究表明，POP對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和痢疾桿菌有明顯的抑制作用，其中對痢疾桿菌抑制效果最為明顯，但對綠膿桿菌抑制效果不明顯[16-17]。POP可通過促進腸道正常菌群生長、調(diào)整菌群失調(diào)來改善林可霉素建立的腸道微生態(tài)失調(diào)，使動物腸道維持穩(wěn)態(tài)，進而達到防治感染的作用，是理想的中藥微生態(tài)調(diào)節(jié)劑[18]。

目前，已有研究者關(guān)注POP在動物保健促生長方面的作用并開始嘗試應(yīng)用，如葛劍等[19]研究發(fā)現(xiàn)，POP可提高雛雞生長性能和飼料轉(zhuǎn)化率；李進杰等[20]發(fā)現(xiàn)POP可以改善斷奶仔豬的生長性能，降低腹瀉率。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)，POP可改善斷奶SD大鼠生長性能、促進腸道發(fā)育，但未進一步探究POP對動物腸道菌群的影響[21]。因此，本研究將POP作為斷奶SD大鼠的飼料添加劑，探討其對斷奶大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)和多樣性的影響，為POP在幼齡哺乳動物飼料添加應(yīng)用上提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與試劑

1.2 試驗儀器

5424離心機(Eppendorf公司，德國)、冷凍離心機(Beckman Coulter公司，美國)、DK-8D恒溫水浴鍋(上海博迅實業(yè)有限公司)、旋渦振蕩儀(太倉華利達實驗設(shè)備有限公司)、REPS300電泳儀(上海天能科技有限公司)、Tanon-2500凝膠成像儀(上海天能科技有限公司)、A200基因擴增儀(杭州朗基科學(xué)儀器有限公司)、DW-HL388超低溫冷凍儲存箱(中科美菱低溫科技有限責(zé)任公司)、Qubit4.0熒光定量儀(Thermo Scientific公司，美國)、Illumina MiSeq測序系統(tǒng)(Illumina公司，美國)。

1.3 動物分組及飼養(yǎng)

將大鼠隨機分為3組，每組10只，單籠飼養(yǎng)。對照組(Con組)大鼠灌胃2 mL生理鹽水，POP低劑量組(LD組)與POP高劑量組(HD組)大鼠分別按照100、200 mg/kg BW的劑量灌胃POP(溶于2 mL生理鹽水)，每日1次，連續(xù)28 d。各組均給予大鼠基礎(chǔ)飼糧，其組成及營養(yǎng)水平見表1，自由飲水。正式試驗前，動物適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d。養(yǎng)殖試驗在井岡山大學(xué)動物飼養(yǎng)中心進行，溫度維持在(23±1)℃，相對濕度約為40%，12 h白天與12 h黑夜模式。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.4 樣品的采集

試驗結(jié)束時，隨機處死每組6只大鼠，采集結(jié)腸內(nèi)容物，裝入無菌EP管中，迅速放入液氮速凍，-80 ℃低溫冰箱保存待測。

1.5 DNA提取和PCR擴增

根據(jù)糞便微生物DNA提取試劑盒說明書進行總DNA提取，用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質(zhì)量和濃度，將樣品稀釋至濃度為1 ng/μL，然后對16S rRNA可變區(qū)(V3～V4)進行PCR擴增(引物為F:5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′和R: 5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)。PCR擴增產(chǎn)用2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，回收目標(biāo)片段。Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit對純化的PCR產(chǎn)物進行建庫，將構(gòu)建好的文庫經(jīng)過Qubit定量和文庫檢測合格后，用MiSeq測序儀進行2×300 bp的雙端測序(委托杭州聯(lián)川生物技術(shù)股份有限公司完成)。

1.6 生物信息分析

采用FLASH(v1.2.8)軟件，根據(jù)雙端序列overlap關(guān)系，將序列拼接(merge)成長的tag，并將序列上建庫引入的barcode和引物序列去除，然后采用Vsearch(v2.3.4)過濾嵌合體。預(yù)處理之后的cleandata使用Vsearch將序列相似性大于97%的clean tags定為一個操作分類單元(OTUs)，挑選最佳的centroids(位于幾何中心)序列作為該OTU的代表序列。使用QIIME(v1.8.0)分析α多樣性以及β多樣性。使用blast進行序列比對，將OTU代表序列與RDP以及NCBI-16S數(shù)據(jù)庫對每個代表性序列進行物種注釋。其他圖片均是使用R包(V3.2.5)實現(xiàn)。

1.7 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2007整理后，SPSS 19.0統(tǒng)計軟件處理，進行單因素方差分析并進行組間差異顯著性比較，采用線性判別分析(LEfSe)效應(yīng)大小與t-test分析比較組間差異顯著的物種，宏基因組圖譜統(tǒng)計分析軟件(STAMP)對京都基因與基因組百科全書(KEGG)進行顯著性差異分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序質(zhì)量評估及物種注釋分析

由圖1-a可知，試驗中各樣本平均得到7 481個OTUs；當(dāng)樣本量增加至18時，很少有新的OTUs出現(xiàn)，提示測序深度足夠、數(shù)據(jù)量漸進合理和樣本量足夠。通過3組樣本聚類得到的OTUs差異韋恩圖(1-b)可見，3組共有4 725個相同的OTUs，其中Con組有140個特征OTUs，LD組有367個特征OTUs，HD組有174個特征OTUs。

a：物種累積箱形圖；b：分組OTUs韋恩圖。

2.2 各組大鼠腸道菌群多樣性分析

本試驗通過Chao1、Observed_species、Goods_coverage、Shannon、Simpson指數(shù)來分析菌群的α多樣性。由圖2-a至圖2-d可知，POP添加組斷奶大鼠Chao1、Observed species、Shannon、Simpson指數(shù)相對于Con組大鼠均下降，但沒有統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，結(jié)果表明，試驗組與對照組大鼠腸道微生物菌群有相似的整體多樣性。由圖2-f可見，各組樣本測序覆蓋率均在0.90以上，說明樣本中序列沒有被測出的概率較低，測序深度足夠，提示本次測序結(jié)果能代表樣本的真實情況。通過主成分分析(PCA)和非度量多維尺度分析(NMDS)來評估菌群的β多樣性，如圖2-f所示，PCA評分圖顯示了Con、LD和HD組之間的相似性和差異性，其中前3個分量解釋了總差異性的76.2%(PC1、PC2和PC3分別為40.9%、24.8%、10.5%)(P=0.008)；Con組與HD組組內(nèi)樣本的聚類效果較好，組間微生物明顯分開；LD組組內(nèi)樣本差異較大，與Con組差異小；未加權(quán)的NMDS也可見相似的結(jié)果(圖2-g)。

圖a至圖e：α多樣性分析；圖f至圖g:β多樣性分析。Figures a to e: analysis of alpha-diversity; figures f to g: analysis of beta-diversity.

2.3 腸道菌群結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)物種注釋結(jié)果，在門水平上各組優(yōu)勢菌門均為厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidetes)；二者的比值(F/B)在Con組為0.79，LD組上調(diào)為0.99，HD組上調(diào)為0.93(表2)；與Con組相比，HD組的軟璧菌門(Tenericutes)相對豐度顯著降低(P=0.02)。由圖3-b可見，在屬水平上，Con組優(yōu)勢菌屬為未分類紫單胞菌科(Porphyromonadaceae_unclassified)和阿洛-普氏菌屬(Alloprevotella)；POP組的優(yōu)勢菌屬為未分類紫單胞菌科和帕拉-普氏菌屬(Paraprevotella)。

表2 各組大鼠F/B值

圖a：前10門水平相對豐度構(gòu)成圖；圖b：前20屬水平相對豐度構(gòu)成圖。Fig.a: chart of the relative abundance of the first 10 phyla；Fig.b: relative abundance composition of the first 20 genera。Bacteroidetes:擬桿菌門；Firmicutes:厚壁菌門；Bacteria_unclassified:未分類_細(xì)菌；Verrucomicrobia:疣微菌門；Proteobacteria:變形菌門；Actinobacteria:放線菌門；Elusimicrobia:迷蹤菌門；Candidatus_Saccharibacteria:暫定種_糖化細(xì)菌；Cyanobacteria:藍藻門；Tenericutes:軟璧菌門；Lentisphaerae:黏膠球形菌門；unclassified:未分類；Deferribacteres:脫鐵桿菌門；Porphyromonadaceae_unclassified:未分類_紫單胞菌科；Paraprevotella:帕拉-普氏菌屬；Alloprevotella:阿洛-普氏菌屬；Lachnospiraceae_unclassified:未分類_毛螺旋菌科；Ruminococcaceae_unclassified:未分類_瘤胃球菌科；Akkermansia:艾克曼菌屬；Ruminococcus:瘤胃球菌屬；Prevotella:普氏菌屬；Eubacterium:優(yōu)桿菌屬；Acetivibrio:醋弧菌屬；Oscillospira:顫螺旋菌屬；Romboutsia:羅姆布茨菌屬；Bacteroides:擬桿菌屬；Oscillibacter:顫桿菌科；Acetatifactor:產(chǎn)醋酸菌屬；Clostridium:梭菌屬；Others:其他。

2.4 組間差異物種的篩選

為了鑒定與POP相關(guān)的特定菌群，本試驗采用LEfSe方法比較了Con組和POP補充組的糞便微生物區(qū)系。圖4-a和圖4-c顯示了代表糞便微生物和優(yōu)勢細(xì)菌結(jié)構(gòu)的包層圖，圖4-b和圖4-d顯示了2個組間差異最大的分類群，補充了POP能顯著提高斷奶大鼠的乳桿菌目(Lactobacillales)、羅姆布茨菌種(Romboutsia)和梭菌屬_sensu_stricto(Clostridium_sensu_stricto)等相對豐度(P<0.05)，顯著降低普氏菌屬(Prevotella)、紫單胞菌科(Porphyromonadaceae)和糞桿菌屬(Faecalibacterium)等相對豐度(P<0.05)。

圖a、圖b：LEfSe分析Con組和HD組16S rRNA序列的進化分支圖及LDA評分高于3的物種評分圖。圖c、圖d：LEfSe分析Con組和LD組16S rRNA序列的進化分支圖及LDA評分高于3的物種評分圖。Fig.a and Fig.b: taxonomic cladogram derived from LEfSe analysis of 16S rRNA sequences and LAD score plot of bacterial taxa with LDA scores higher than 3 in the Con group and the HD group.Fig.c and Fig.d: taxonomic cladogram derived from LEfSe analysis of 16S rRNA sequences and LAD score plot of bacterial taxa with LDA scores higher than 3 in the Con group and the LD group.

2.5 受試者工作特征(ROC)分析

用ROC曲線分析法來評估幾種相對豐度有差異性的菌屬作為POP對受試大鼠影響的值。由圖5-a～圖5-f可見，補充POP可顯著增加雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、羅姆布茨菌屬、鹽單胞菌屬和溶桿菌屬的相對豐度(P<0.05)，顯著降低針狀桿菌屬和糞桿菌屬相對豐度(P<0.05)。通過ROC曲線下的面積(AUC)可知，與高劑量受試大鼠最密切相關(guān)的屬是雙歧桿菌屬(AUC=0.917)、羅姆布茨菌屬(AUC=0.944)和針狀桿菌屬(AUC=0.944)(圖5-g)；與低劑量受試大鼠最密切相關(guān)的屬是鹽單胞菌屬(AUC=0.917)、溶桿菌屬(AUC=0.903)和糞桿菌屬(AUC=0.917)(圖5-h)。試驗結(jié)果提示，以上菌屬可能是POP促進斷奶大鼠腸道菌群穩(wěn)態(tài)的潛在標(biāo)志物。

圖a～圖f：馬齒莧多糖添加組與對照組的之間相對豐度有差異性的菌屬。圖g：羅姆布茨菌屬、針狀桿菌屬和雙歧桿菌屬的ROC曲線分析。圖h：鹽單胞菌屬、溶桿菌屬和糞桿菌屬的ROC曲線分析。Fig.a to Fig.f: differences of relative abundances of genus between the polysaccharide supplemental group and the control group.Fig.g: ROC analysis of Romboutsia, Acutalibacter and Bifidobacterium.Fig.h: ROC analysis of Halomonas, Lysobacter and Faecalibacterium.

2.6 功能預(yù)測分析

基于已測大鼠腸道中的細(xì)菌基因組的16S rDNA全長序列，依據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫，用隱性狀態(tài)重建進行群落系統(tǒng)進化研究(PICRUSt)法對菌群代謝功能進行預(yù)測。由圖6、圖7可見，Con組與POP組在核苷酸代謝、維生素代謝、碳水化合物的生物合成與代謝和脂質(zhì)代謝存在顯著性差異。Con組在糖化合物降解通路上的相對占比更高，這表明斷奶大鼠在補充POP后腸道菌群結(jié)構(gòu)變化對其參與的物質(zhì)代謝產(chǎn)生影響。

Mean proportion:平均比例; Difference in mean proportions:平均比例差異; 95% confidence intervals:95%置信區(qū)間。下圖同。The same as below.

aromatic biogenic amine degradation(bacteria):芳香族生物胺降解(細(xì)菌)；dTDP-L-rhamnose biosynthesis Ⅰ:dTDP-L-鼠李糖生物合成Ⅰ；dTDP-N-acetylthomosamine biosynthesis:dTDP-N-乙酰氨基乙醇生物合成；formaldehyde oxidation Ⅰ:甲醛氧化 Ⅰ；galactose degradation Ⅰ(Leloir pathway):半乳糖降解Ⅰ(Leloir途徑)；glycolysis Ⅰ(from glucose 6-phosphate)/Ⅱ(from fructose 6-phosphate):糖酵解Ⅰ(來自葡萄糖6-磷酸)/Ⅱ(來自果糖6-磷酸)；hexitol fermentation to lactate, formate, ethanol:己糖醇發(fā)酵生產(chǎn)乳酸、甲酸、乙醇；L-rhamnose degradation Ⅰ:L-鼠李糖降解Ⅰ；lipid IVA biosynthesis:脂質(zhì)IVA生物合成；pyrimidine deoxyribonucleosides salvage:嘧啶脫氧核苷補償；succinate fermentation to butanoate琥珀酸發(fā)酵到丁酸；sucrose degradation Ⅲ(sucrose invertase):蔗糖降解Ⅲ(蔗糖轉(zhuǎn)化酶)；urea cycle:尿素循環(huán)。

3 討 論

本研究通過Illumina MiSeq測序平臺的16S rRNA測序技術(shù)檢測飼喂POP后斷奶SD大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的變化，并對菌群信息進行了進一步的分析。

動物腸道內(nèi)定植了數(shù)量龐大的微生物菌群，菌群穩(wěn)態(tài)對機體的生理功能具有重要的影響[22]。腸道菌群多樣性與腸道穩(wěn)態(tài)又密切相關(guān)，有研究發(fā)現(xiàn)菌群多樣性指數(shù)越高，菌群區(qū)系平衡越不易被破壞[23]。本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，POP組與Con組之間腸道菌群整體多樣性沒有差異；但POP組的特征OTUs多于Con組，組間的β多樣性有差異性。這表明飼喂POP未破壞斷奶大鼠腸道微生物多樣性，但可促進特征菌群數(shù)量的增加，改變菌群結(jié)構(gòu)。

在人的腸道菌群中，厚壁菌門和擬桿菌門是優(yōu)勢菌門，兩者可占菌群數(shù)量的90%以上；本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)使用大鼠優(yōu)勢菌門與人相似，均以厚壁菌門和擬桿菌門為主。由表2可知，POP能提升厚壁菌門相對豐度和降低擬桿菌門相對豐度，這可能與厚壁菌門富含淀粉、半乳糖及丁酸等代謝酶、有助于促進機體對能量的吸收及脂肪的沉積有關(guān)[24]。Turnbaugh等[25]發(fā)現(xiàn)，相對正常小鼠，肥胖小鼠的擬桿菌門的數(shù)量減少50%，厚壁菌門數(shù)量增加。另外，飼喂了高劑量POP的斷奶大鼠腸道中的軟璧菌門相對豐度顯著下降。支原體、螺原體、脲原體和植原體是軟璧菌門典型物種，軟璧菌門的細(xì)菌通常對機體無害。有研究發(fā)現(xiàn)，一種食草能力強的短角蝗蟲中的軟璧菌門是優(yōu)勢菌門[26]；Kang等[27]研究發(fā)現(xiàn)喂食高脂飲食的小鼠腸道腸道中的軟璧菌門數(shù)量減少。本課題組已發(fā)表的研究數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，飼喂了POP的斷奶大鼠血清中的蛋白質(zhì)、膽固醇和葡萄糖含量顯著提高，腸道絨毛發(fā)育更好，料重比卻顯著降低[21]。以上結(jié)果說明POP可能通過改變腸道菌群結(jié)構(gòu)，提升從飼糧中獲得能量的能力進而促進生長發(fā)育。

雙歧桿菌、乳酸桿菌等有益菌能與腸道上皮細(xì)胞保持和諧共生的關(guān)系，它與腸壁緊密結(jié)合從而形成了一道生物膜保護屏障以阻止有害菌的入侵[28]。研究發(fā)現(xiàn)，雙歧桿菌的抑菌作用主要通過競爭營養(yǎng)與黏附位點、加強機體免疫力等途徑，對腸道致病菌的黏附和繁殖起到拮抗作用以及阻斷致病途徑[29]。本試驗結(jié)果顯示，飼喂POP能顯著增加斷奶大鼠腸道雙歧桿菌和乳酸桿菌的相對豐度，這與克里斯等[30]研究發(fā)現(xiàn)POP顯著提高衰老小鼠腸道雙歧桿菌和乳酸桿菌數(shù)量結(jié)果一致。有報道指出，羅姆布茨菌屬表現(xiàn)出益生性[31]，針狀桿菌屬可通過膽汁酸氧化途徑參與機體膽汁酸的代謝[32]，溶桿菌屬有增加產(chǎn)乳酶活性及抑菌效果[33-34]，鹽單胞菌屬相對豐度與仔豬血清白蛋白(ALB)及尿素氮(UN)含量顯著正相關(guān)[35]。本研究結(jié)果可見，飼喂POP后，斷奶大鼠腸道菌群中的羅姆布茨菌屬、鹽單胞菌屬和溶桿菌屬的相對豐度顯著增加，針狀桿菌屬相對豐度顯著降低。糞桿菌屬細(xì)菌廣泛存在人體腸道中，在下一代益生菌或生物治療藥物方面有潛在開發(fā)前景[36]。從試驗結(jié)果可知，飼喂低劑量的POP顯著降低糞桿菌屬相對豐度，而飼喂高劑量的POP未見對糞桿菌屬相對豐度的影響，由此推薦斷奶大鼠腸道中糞桿菌屬相對豐度對POP劑量可能比較敏感。

PICRUSt功能預(yù)測是以KEGG數(shù)據(jù)庫對組間功能差異進行分析，準(zhǔn)確率較高，尤其對于腸道微生物菌群功能準(zhǔn)確性可達95%[37]。本試驗PICRUSt分析結(jié)果表明，POP可以改變斷奶大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)影響機體的代謝功能，主要包括核苷酸代謝、維生素代謝、碳水化合物的生物合成與代謝和脂質(zhì)代謝。外源性核苷酸是幼齡動物生長發(fā)育不可缺少的營養(yǎng)成分，研究表明，哺乳動物乳汁中含有豐富的核苷酸[38]。雙歧桿菌能夠酸化腸道內(nèi)環(huán)境，抑制腐敗菌和病原菌的生長，產(chǎn)生維生素和氨基酸，為機體提供必需的營養(yǎng)[39]。腸道菌群可以通過各種途徑參與能量及脂類代謝，促使肝臟脂肪酸和甘油三酯的存儲[40]。維生素代謝與機體能量代謝及腸道菌群尤其是乳桿菌屬的生長密切相關(guān)，核黃素通過參與催化乙酸-CoA的還原及琥珀酸-CoA的轉(zhuǎn)化參與能量代謝[37]。通過PICRUSt結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，POP能提升dTDP-L-鼠李糖生物合成、黃素生物合成Ⅰ(細(xì)菌與植物)、嘧啶脫氧尿苷磷酸化、UDP-N-乙酰-D-葡糖胺生物合成Ⅰ、糖酵解Ⅰ(葡萄糖6-磷酸)、糖酵解Ⅱ(果糖6-磷酸)、脂質(zhì)IVA生物合成的菌群基因功能。但是，某一種菌群與具體代謝通路如何相互作用還有待進一步研究。

4 結(jié) 論

給予POP可增加斷奶大鼠腸道雙歧桿菌、乳酸桿菌和羅姆布茨菌等益生菌的相對豐度，從而優(yōu)化腸道菌群平衡，建立更健康的腸道菌群結(jié)構(gòu)。POP是提升斷奶大鼠相關(guān)核苷酸代謝、碳水化合物的生物合成與代謝、維生素代謝和脂質(zhì)代謝通路菌群基因功能的潛在添加劑，為POP在幼齡哺乳動物飼料添加應(yīng)用上提供科學(xué)依據(jù)。