劉 穎 金永鵬 羅蓀琳 陳義強(qiáng)

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193)

全球范圍內(nèi)，每年約有25%的谷物受到霉菌毒素污染，給畜牧業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。目前已發(fā)現(xiàn)的霉菌毒素有200多種，其中黃曲霉毒素(aflatoxins，AFs)、玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEA)及嘔吐毒素(deoxynivalenol，DON)是飼料中最常見的3類霉菌毒素[2]。黃曲霉毒素是一類主要由黃曲霉和寄生曲霉產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，常見的有黃曲霉毒素B1(AFB1)、黃曲霉毒素B2(AFB2)、黃曲霉毒素G1(AFG1)、黃曲霉毒素G2(AFG2)，其中以AFB1毒性最強(qiáng)，具有致癌性[3]。ZEA主要由鐮刀菌產(chǎn)生，具有高毒性，廣泛存在于玉米、小麥等飼料原料中，是一種雌激素類似物，可導(dǎo)致畜禽性激素機(jī)能紊亂，還具有一定程度的肝臟毒性、遺傳毒性及免疫毒性[4-5]。DON又稱脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，是由鐮刀菌屬產(chǎn)生的低分子質(zhì)量次級(jí)代謝產(chǎn)物，可導(dǎo)致畜禽胃腸功能紊亂、皮膚黏膜損傷及免疫性能低下[6-7]。

我國(guó)《飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》(GB 13078—2017)[8]中規(guī)定了霉菌毒素的限量，如AFB1在玉米加工產(chǎn)品中的限量為≤50 μg/kg，在仔豬配合飼料中的限量為≤10 μg/kg；ZEA在玉米等飼料原料中的限量為≤0.5 mg/kg；DON在植物性飼料原料中的限量為≤5 mg/kg，在豬配合飼料中的限量為≤1 mg/kg。建立飼料中霉菌毒素的檢測(cè)方法對(duì)于篩選合格飼料、保障畜禽機(jī)體健康及畜禽產(chǎn)品安全具有重要的意義。目前，霉菌毒素的檢測(cè)方法主要有薄層色譜法[9-11]、免疫層析法[12-13]、酶聯(lián)免疫吸附法[14-16]、高效液相色譜(HPLC)法[17-19]以及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[20-22]，其中薄層色譜法、免疫層析法和酶聯(lián)免疫吸附法主要用于霉菌毒素的快速篩檢，而HPLC法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法則主要用于霉菌毒素的定量分析。HPLC法對(duì)儀器設(shè)備要求低，但通常只能用于單種霉菌毒素的檢測(cè)；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法可用于多種霉菌毒素的同步檢測(cè)，但儀器設(shè)備昂貴且維護(hù)成本高，不適于基層實(shí)驗(yàn)室對(duì)霉菌毒素的定量分析。目前可同步檢測(cè)多種霉菌毒素的HPLC法相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道較少。因此，本試驗(yàn)旨在建立一種對(duì)飼料中AFB1、ZEA及DON含量同步檢測(cè)的HPLC法，為基層實(shí)驗(yàn)室中飼料霉菌毒素的快速定量檢測(cè)提供方法參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

甲醇、乙腈，色譜純，德國(guó)Merck公司；AFB1、ZEA、DON標(biāo)準(zhǔn)品溶液(1 mg/mL)，美國(guó)Sigma公司；吐溫-20(tween-20)，分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化鉀，分析純，北京化工廠有限責(zé)任公司，用于配制pH 7.0的磷酸鹽緩沖液(PBS，稱取8.0 g氯化鈉、1.44 g磷酸氫二鈉、0.24 g磷酸二氫鉀、0.2 g氯化鉀，用990 mL純水溶解，然后用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.0，最后用純水稀釋至1 000 mL)。

1.2 色譜條件

色譜柱：SymmetryShield RP18色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)。流動(dòng)相組成為水/甲醇，熒光檢測(cè)器激發(fā)波長(zhǎng)為360 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為440 nm，紫外檢測(cè)器設(shè)置雙波長(zhǎng)為218 nm/265 nm。柱溫30 ℃，進(jìn)樣量40 μL，流速0.8 mL/min，洗脫時(shí)間為20 min，洗脫程序?yàn)椋河袡C(jī)相(甲醇)在0～7 min時(shí)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%，7～8 min時(shí)質(zhì)量分?jǐn)?shù)由30%變?yōu)?5%并保持至第15 min，15～16 min時(shí)質(zhì)量分?jǐn)?shù)由75%變?yōu)?0%并保持至第20 min。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

本實(shí)驗(yàn)室購(gòu)買的AFB1、ZEA、DON標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度均為1 mg/mL。準(zhǔn)確移取一定體積的AFB1、ZEA、DON標(biāo)準(zhǔn)品溶液，用50%甲醇-水稀釋，最終配成AFB1濃度分別為1.0、2.5、5.0、10.0、20.0、50.0 ng/mL，ZEA濃度分別為50、125、250、500、1 000、2 500 ng/mL，DON濃度分別為100、250、500、1 000、2 000、5 000 ng/mL的三合一霉菌毒素標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。在所設(shè)定的液相色譜條件下，按照低濃度至高濃度進(jìn)行進(jìn)樣，采用外標(biāo)法定量，作峰面積-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到3種霉菌毒素的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程。

1.4 樣品處理方法

準(zhǔn)確稱取試樣2.0 g于50 mL離心管中，準(zhǔn)確加入20 mL乙腈-水(體積比6∶4)溶液，振蕩30 min，以6 010×g高速離心10 min。準(zhǔn)確移取2.0 mL上清液并加入28.0 mL含1%吐溫-20的PBS(pH 7.0)稀釋，備用。將上述30 mL濾液以1～2滴/s的流速全部通過(guò)ADZ三合一免疫親和柱，直至空氣進(jìn)入親和柱。將10 mL純水以1～2滴/s的流速通過(guò)親和柱，直至空氣進(jìn)入親和柱。將2 mL色譜級(jí)甲醇以1滴/s的流速淋洗親和柱，將淋洗液收集于玻璃試管中。50 ℃下濃縮氮?dú)獯蹈珊?，?0%甲醇-水定容至0.5 mL，供HPLC分析。

1.5 結(jié)果計(jì)算

按照以下公式計(jì)算飼料樣品中各種霉菌毒素的含量：

X=[(c/f)×v]/m。

式中：X為試樣中霉菌毒素(AFB1、ZEA、DON)的含量(μg/kg)；c為由標(biāo)準(zhǔn)曲線得到試液中霉菌毒素的濃度(ng/mL)；v為飼料樣品加入乙腈-水定容體積(mL)；f為濃縮倍數(shù)；m為所稱取的樣品質(zhì)量(g)。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

按選定的色譜條件對(duì)已配制的三合一霉菌毒素標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行上樣檢測(cè)，以各霉菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度為橫坐標(biāo)(X，ng/mL)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。由表1可知，AFB1標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度在2.5～50.0 ng/mL、ZEA標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度在50～2 500 ng/mL、DON標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度在250～5 000 ng/mL時(shí)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.99。

表1 3種霉菌毒素的線性范圍、回歸方程及相關(guān)系數(shù)

圖1 空白溶劑和AFB1標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

2.2 添加回收試驗(yàn)和穩(wěn)定性試驗(yàn)

稱取空白肉雞飼料做回收試驗(yàn)，每種霉菌毒素設(shè)置3個(gè)添加濃度，每個(gè)添加濃度進(jìn)行3次平行測(cè)定，按1.4方法進(jìn)行處理，上樣檢測(cè)，測(cè)定的3種霉菌毒素回收率見表2。由表可知，用所建HPLC法進(jìn)行霉菌毒素的添加回收試驗(yàn)，3種霉菌毒素均可達(dá)到較穩(wěn)定的回收率，在81.2%～92.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在4.3%～9.5%。

表2 3種霉菌毒素的回收率

圖2 空白溶劑和ZEA標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

圖3 空白溶劑和DON標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

為了進(jìn)一步驗(yàn)證所建HPLC法對(duì)不同飼料樣品的適用性以及同一樣品標(biāo)準(zhǔn)溶液在不同時(shí)間段測(cè)定結(jié)果的穩(wěn)定性，稱取空白玉米原料、小麥原料及豬配合飼料，參照我國(guó)《飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》(GB 13078—2017)[8]的限定值添加霉菌毒素，3種空白飼料加標(biāo)樣品中AFB1、ZEA、DON標(biāo)準(zhǔn)溶液的添加濃度分別為20、500和3 000 μg/kg，按1.4方法進(jìn)行處理，每間隔2 h進(jìn)行上樣檢測(cè)，共檢測(cè)9次，不同加標(biāo)樣品溶液中AFB1、ZEA和DON含量隨時(shí)間變化結(jié)果見圖4至圖6，在玉米原料、小麥原料及豬配合飼料加標(biāo)樣品溶液中，不同時(shí)間段AFB1、ZEA和DON檢測(cè)值間的RSD均小于9.0%。

圖4 不同加標(biāo)樣品溶液中AFB1檢測(cè)含量隨時(shí)間的變化

圖5 不同加標(biāo)樣品溶液中ZEA檢測(cè)含量隨時(shí)間的變化

圖6 不同加標(biāo)樣品溶液中DON檢測(cè)含量隨時(shí)間的變化

2.3 飼料樣品的檢測(cè)

采集送檢肉鴨配合飼料、玉米芯粉、玉米、小麥飼料樣品共計(jì)41份，采用所建HPLC法檢測(cè)每份飼料樣品中的AFB1、ZEA及DON總含量。由表3可知，所有飼料樣品均檢測(cè)出1種以上霉菌毒素，肉鴨配合飼料中AFB1檢出率100%，超標(biāo)率達(dá)81.8%；玉米芯粉中ZEA含量嚴(yán)重超標(biāo)，檢出率及超標(biāo)率均達(dá)100.0%；4種飼料樣品中DON含量未有超標(biāo)，檢出率為27.3%～100.0%。

表3 4種飼料樣品中霉菌毒素的檢測(cè)含量

3 討 論

3.1 色譜條件的選擇與優(yōu)化

試驗(yàn)首先針對(duì)色譜條件的選擇與優(yōu)化2個(gè)方面進(jìn)行了重點(diǎn)研究。對(duì)于霉菌毒素檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇，不同文獻(xiàn)報(bào)道的不盡相同。Gell等[23]在激發(fā)波長(zhǎng)365 nm，發(fā)射波長(zhǎng)455 nm色譜熒光檢測(cè)條件下定量檢測(cè)真菌培養(yǎng)物中的AFB1含量，取得良好效果；Kim等[24]所建立的同時(shí)檢測(cè)黃曲霉毒素(AFB1、AFB2、AFG1、AFG2)和赭曲霉毒素A(ochratoxin A，OTA)含量的HPLC法，可準(zhǔn)確用于動(dòng)物飼料中霉菌毒素定量分析，其中黃曲霉毒素?zé)晒鈾z測(cè)條件為激發(fā)波長(zhǎng)360 nm，發(fā)射波長(zhǎng)450 nm。班曉敏[25]和何苗等[26]的試驗(yàn)均采用218 nm紫外檢測(cè)波長(zhǎng)檢測(cè)飼料中DON含量，具有較高的準(zhǔn)確度。而ZEA既可通過(guò)熒光檢測(cè)器進(jìn)行測(cè)定，對(duì)于紫外檢測(cè)器也有較好的響應(yīng)效果，其檢測(cè)波長(zhǎng)不同報(bào)道有所差異[27-29]。參照前人研究文獻(xiàn)及免疫親和柱產(chǎn)品說(shuō)明書，以霉菌毒素峰形和分離效果為指標(biāo)，本研究對(duì)檢測(cè)波長(zhǎng)進(jìn)行了篩選優(yōu)化，最終采用熒光檢測(cè)器-柱后衍生的方法在激發(fā)波長(zhǎng)、發(fā)射波長(zhǎng)分別為360、440 nm時(shí)對(duì)AFB1含量進(jìn)行檢測(cè)，采用紫外檢測(cè)器在檢測(cè)波長(zhǎng)分別為265、218 nm時(shí)分別對(duì)ZEA和DON含量進(jìn)行檢測(cè)。

對(duì)于流動(dòng)相的選擇，液相色譜檢測(cè)多以乙腈與水或甲醇與水體系為主[30-31]。本研究通過(guò)對(duì)AFB1、ZEA、DON單標(biāo)采用這2種流動(dòng)相體系進(jìn)行上樣分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：甲醇與水流動(dòng)相體系下，霉菌毒素峰對(duì)稱性好、分離效果最佳，故將其作為同步檢測(cè)3種霉菌毒素的流動(dòng)相體系。通過(guò)對(duì)AFB1、ZEA、DON標(biāo)準(zhǔn)溶液在不同比例的甲醇∶水(1∶1、2∶8、3∶7、4∶6)條件下進(jìn)樣分析，發(fā)現(xiàn)DON最早出峰，且當(dāng)甲醇:水比例為3∶7時(shí)，DON峰形最佳，故洗脫程序起始設(shè)置為30%有機(jī)相保持7 min使DON得以洗脫出來(lái)。通過(guò)數(shù)次更換不同時(shí)間段的流動(dòng)相比例及洗脫時(shí)間對(duì)三合一霉菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行上樣分析，觀察出峰時(shí)間、峰面積及分離效果，以優(yōu)化洗脫程序，最終確定了1.2色譜條件中所述的洗脫程序。該洗脫程序洗脫時(shí)間僅為20 min，可同步檢測(cè)飼料中AFB1、ZEA及DON含量，而研究表明，這3種霉菌毒素單獨(dú)檢測(cè)時(shí)其上樣分析時(shí)間均在10 min以上[26，32-33]。因此，本研究所建方法檢測(cè)時(shí)長(zhǎng)相對(duì)較短，可大大提高檢測(cè)效率。

3.2 回收率和精密度

添加回收試驗(yàn)是驗(yàn)證霉菌毒素檢測(cè)方法的重要組成部分，對(duì)于同步檢測(cè)多種霉菌毒素含量的液相色譜方法研究，因前處理方法、所檢測(cè)霉菌毒素種類以及樣品種類等的不同，其加標(biāo)回收率和精密度也顯示出較大差異。Irakli等[34]建立了同步檢測(cè)麥麩中黃曲霉毒素、ZEA、DON及OTA的HPLC法，其中ZEA和DON的平均回收率為84.5%～100.8%，而AFB1的平均回收率則不太穩(wěn)定，為70.3%～101.4%，RSD為2.7%～12.0%。在李克等[35]的研究中，加標(biāo)玉米樣品ZEA和OTA的回收率為83.1%～91.9%，RSD為3.1%～9.3%，該方法可用于準(zhǔn)確檢測(cè)玉米、小麥和稻米中ZEA和OTA含量。Chen等[28]所建立的同步檢測(cè)花生中霉菌毒素HPLC法，6霉菌種毒素(AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、ZEA和OTA)均具有良好的加標(biāo)回收率，為83.1%～99.3%，且RSD均小于10.0%，精密度較好，但該方法部分毒素的保留時(shí)間較為接近，實(shí)際樣品檢測(cè)時(shí)分離效果可能不太理想。本研究添加回收試驗(yàn)結(jié)果顯示，加標(biāo)空白肉雞飼料樣品中，不同添加濃度的AFB1、ZEA及DON的平均回收率為81.2%～92.3%，RSD為4.3%～9.5%，這說(shuō)明本研究所建HPLC法具有較高的準(zhǔn)確度與精密度。此外，本研究還考察了不同加標(biāo)樣品溶液中霉菌毒素檢測(cè)含量隨時(shí)間變化情況，結(jié)果顯示，AFB1、ZEA及DON檢測(cè)值在不同加標(biāo)樣品溶液中隨時(shí)間波動(dòng)不大，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于9.0%，這表明該方法具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性，可實(shí)際應(yīng)用于基層實(shí)驗(yàn)室不同飼料品種中霉菌毒素的定量檢測(cè)，有利于保障飼料質(zhì)量安全。

3.3 飼料樣品的檢測(cè)

飼料原料在生產(chǎn)、貯存、運(yùn)輸?shù)冗^(guò)程中，受氣候、季節(jié)、加工不當(dāng)?shù)纫蛩赜绊?，極易發(fā)生霉變而產(chǎn)生霉菌毒素[36]。玉米、小麥?zhǔn)鞘澜缟袭a(chǎn)量最大的糧食作物，在我國(guó)作為飼料原料被大量用于畜禽配合飼料中。在本試驗(yàn)所檢測(cè)的8份玉米樣品中，AFB1檢出率高達(dá)100%，ZEA和DON檢出率為50%；而16份小麥樣品均檢出ZEA和DON，說(shuō)明這2類飼料原料易受霉菌毒素污染，且霉菌毒素共存現(xiàn)象較為普遍，這與龔阿瓊等[37]和史海濤等[38]研究結(jié)果相一致。在玉米芯粉樣品中，ZEA含量嚴(yán)重超標(biāo)，最高含量達(dá)3 676.8 μg/kg，遠(yuǎn)高于《飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》(GB 13078—2017)[8]限定值1 000 μg/kg，畜禽采食后可能會(huì)造成嚴(yán)重的器官損傷、免疫抑制，甚至引起畜禽死亡。配合飼料中的霉菌毒素污染問(wèn)題同樣嚴(yán)峻，研究表明，AFB1、ZEA、DON等毒素在部分豬全價(jià)料、肉雞配合飼料以及寵物飼料中有著極高的檢出率及超標(biāo)率[39-41]。本次所檢11份肉鴨配合飼料中，AFB1和ZEA檢出率均達(dá)100%，其中AFB1超標(biāo)率達(dá)81.8%，生產(chǎn)中此類高AFB1含量的飼料極易引發(fā)畜禽急性中毒現(xiàn)象，危害畜禽機(jī)體健康。

此外，霉菌毒素間的協(xié)同效應(yīng)同樣不容忽視。Levkut等[42]報(bào)道，ZEA、DON混合毒素能嚴(yán)重抑制肉雞白細(xì)胞的吞噬能力，降低肉雞免疫力。楊云斌[43]研究表明，ZEA與AFB1聯(lián)合添加能顯著降低人肝癌HepG2細(xì)胞活力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，兩者表現(xiàn)為協(xié)同效應(yīng)。Sun等[44]試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，AFB1與DON協(xié)同作用會(huì)加劇大鼠肝臟細(xì)胞毒性。本試驗(yàn)所檢小麥樣品，其ZEA、DON含量雖均未超標(biāo)，但最高含量分別達(dá)到了987.5和4 876.9 μg/kg，接近《飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》(GB 13078—2017)[8]限定值，且2種毒素存在協(xié)同增效可能，若畜禽長(zhǎng)期采食，易降低機(jī)體免疫力，增加疾病易感性。從以上檢測(cè)結(jié)果可以看出，常見植物性飼料原料以及配合飼料中的AFB1、ZEA及DON污染問(wèn)題不容樂(lè)觀。因此，在生產(chǎn)和養(yǎng)殖過(guò)程中，應(yīng)嚴(yán)格把控飼料生產(chǎn)加工、存儲(chǔ)、運(yùn)輸?shù)拳h(huán)節(jié)，減少飼料霉菌毒素污染；同時(shí)，做好飼料原料及配合飼料的霉菌毒素檢測(cè)工作，最大程度地避免畜禽采食霉變飼料，保障畜禽機(jī)體健康。

4 結(jié) 論

本研究所建立的HPLC法能夠同步檢測(cè)飼料樣品中的AFB1、ZEA及DON含量。該方法準(zhǔn)確度和精密度高，穩(wěn)定性好，樣品前處理操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)時(shí)間較短，能大大提高生產(chǎn)中霉菌毒素檢測(cè)效率。采用該方法實(shí)際檢測(cè)了4種飼料樣品中AFB1、ZEA及DON含量，說(shuō)明該方法適用性強(qiáng)，可用于不同飼料樣品的霉菌毒素檢測(cè)，作為飼料中常見霉菌毒素含量的檢測(cè)分析方法。