胡俊茹 袁夕宸 黃 文 李國(guó)立 張羽帆 王國(guó)霞 趙紅霞 黃燕華*

(1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華南動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省動(dòng)物育種與營(yíng)養(yǎng)公共實(shí)驗(yàn)室，廣東省畜禽育種與營(yíng)養(yǎng)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510640；2.廣州飛禧特生物科技有限公司，廣州 510640；3.北京奧特奇生物制品有限公司，北京 101499)

魚類屬于變溫動(dòng)物，水溫是影響魚類生理、行為及進(jìn)化過(guò)程中最重要的環(huán)境因素[1]。低溫應(yīng)激時(shí)，動(dòng)物可能有不同的營(yíng)養(yǎng)策略以提高自身的低溫適應(yīng)能力[2]。硒(Se)是動(dòng)物機(jī)體必需的微量元素，具有促生長(zhǎng)、抗氧化、提高免疫等功能。硒在體內(nèi)主要以硒蛋白的形式發(fā)揮作用，硒蛋白具有類胰島素的作用，影響內(nèi)分泌激素[3]，對(duì)促進(jìn)葡萄糖的攝入、調(diào)節(jié)糖酵解、糖異生以及脂肪酸的合成具有重要的作用[4]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，攝食酵母硒為硒源飼料的黃顙魚(Pelteobrusfulvidraco)血液中葡萄糖、甘油三酯含量顯著高于攝食亞硒酸鈉為硒源飼料的黃顙魚[5]，但是到目前為止這2種硒源發(fā)揮作用的分子機(jī)制尚不清楚。

轉(zhuǎn)錄組是指在特定的發(fā)育時(shí)期或生理狀態(tài)下，細(xì)胞內(nèi)所有轉(zhuǎn)錄本(transcript)的集合，它能夠從整體水平揭示特定生物學(xué)過(guò)程發(fā)生的分子機(jī)理，為我們探究動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)調(diào)控與抗環(huán)境脅迫機(jī)制提供了必要的分子手段[6]。因此，本試驗(yàn)采用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-seq)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)技術(shù)挖掘低溫應(yīng)激時(shí)攝食酵母硒和亞硒酸鈉的黃顙魚肝臟組織的關(guān)鍵信號(hào)通路和基因，為深入研究不同硒源的調(diào)控機(jī)理奠定基礎(chǔ)，也為黃顙魚抗低溫功能飼料的研制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)飼料

以酪蛋白為蛋白質(zhì)源，玉米淀粉為糖源，魚油、磷脂油為脂肪源配制基礎(chǔ)飼料，其組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。在基礎(chǔ)飼料中分別添加亞硒酸鈉和酵母硒，硒的實(shí)際添加量均為0.23 mg/kg[5]，配制2種試驗(yàn)飼料，添加亞硒酸鈉的試驗(yàn)飼料硒含量實(shí)測(cè)值為0.22 mg/kg，添加酵母硒的試驗(yàn)飼料硒含量實(shí)測(cè)值為0.21 mg/kg。飼料原料粉碎后過(guò)60目篩，各原料采用逐級(jí)擴(kuò)大法混合，然后于NH-10型捏合機(jī)中加入魚油、磷脂油再進(jìn)行二次混合，使用B20強(qiáng)力攪拌機(jī)攪拌均勻至成團(tuán)，采用SLX-80型雙螺桿擠壓機(jī)制成粒徑為2.0 mm的飼料，然后在G-500型造粒機(jī)中制粒，制粒完成后放入55～60 ℃烘箱中烘干，隨后冷卻，篩除粉末，用封口袋分裝、標(biāo)記，置于-20 ℃冰箱中待用。

表1 基礎(chǔ)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.2 試驗(yàn)魚與飼養(yǎng)管理

養(yǎng)殖試驗(yàn)在廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所水產(chǎn)研究室的室內(nèi)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中進(jìn)行。將5.7 g左右的黃顙魚隨機(jī)分成2組，每組4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)35尾，以重復(fù)為單位放養(yǎng)于水體容積300 L的養(yǎng)殖缸中。2組試驗(yàn)魚分別投喂添加亞硒酸鈉(T1組)和酵母硒(T2組)的試驗(yàn)飼料，每天飽食投喂2次(09:00和18:00)，持續(xù)投喂42 d。養(yǎng)殖期間，每天排污1次，每2周換水1次，水溫26～30 ℃，pH 7.0～7.5，氨氮含量≤0.2 mg/L，亞硝酸鹽含量≤0.02 mg/L，自然光照，24 h不間斷曝氣，每天記錄投喂量和死亡情況。待養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束，將上述每缸中20尾試驗(yàn)魚轉(zhuǎn)移至可控溫生態(tài)水槽系統(tǒng)的養(yǎng)殖缸(每缸水體容積150 L)中，降溫前測(cè)得水溫為26 ℃，降溫速度設(shè)定為1 ℃/h，連續(xù)降溫，當(dāng)水溫降到13 ℃時(shí)采樣，低溫應(yīng)激期間禁食。

1.3 樣品采集

低溫應(yīng)激試驗(yàn)結(jié)束時(shí)每缸隨機(jī)取3尾試驗(yàn)魚，用40 mg/L MS-222麻醉后尾靜脈取血，用于分析生化和抗氧化指標(biāo)；然后在無(wú)菌環(huán)境下解剖取肝臟，裝入無(wú)酶管，液氮速凍，于-80 ℃保存，用于轉(zhuǎn)錄組和基因表達(dá)分析。

1.4 RNA的提取及轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)的建立

采用TRIzol(Invitrogen)法提取黃顙魚肝臟中的總RNA，并使用DNase Ⅰ(TaKaRa)去除基因組DNA。分別采用2100 Bioanalyser(Agilent)、ND-2000(NanoDrop Technologies)檢測(cè)RNA樣品的質(zhì)量，以保證使用合格的樣品[OD260 nm/OD280 nm=1.8～2.2，OD260 nm/OD230 nm≥2.0，RNA完整值(RIN)≥6.5，28S/18S≥1.0，總量>2 μg]進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。RNA文庫(kù)的建立采用TruSeqTMRNA Sample Preparation Kit(Illumina)試劑盒。首先利用帶有Oligo(dT)的磁珠從1 μg總RNA中富集有poly-A尾的mRNA。再加入Fragmentation Buffer，將mRNA隨機(jī)斷裂成200 bp左右的小片段。接著采用SuperScript Double-Stranded cDNA Synthesis Kit(Invitrogen)試劑盒，加入六堿基隨機(jī)引物(Illumina)，以mRNA為模板反轉(zhuǎn)錄合成第1鏈cDNA，隨后進(jìn)行第2鏈合成，形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)。雙鏈的cDNA結(jié)構(gòu)為黏性末端，加入End Repair Mix將其補(bǔ)成平末端，隨后在3’末端加上1個(gè)A堿基，用于連接Y字形的接頭，具體步驟參見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書。cDNA經(jīng)過(guò)PCR富集后，使用DNA Clean Beads篩選200～300 bp的條帶。經(jīng)TBS380(Picogreen)定量后，文庫(kù)使用Ilumina Noveseq 6000測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序，測(cè)序讀長(zhǎng)為PE 150。以上過(guò)程由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成測(cè)序。

1.5 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析

將Ilumina Noveseq 6000測(cè)序平臺(tái)得到的圖像文件經(jīng)CASAVA堿基識(shí)別分析轉(zhuǎn)化為原始數(shù)據(jù)(raw data)，raw data經(jīng)過(guò)去接頭、低質(zhì)量數(shù)據(jù)過(guò)濾篩選等流程后，得到高質(zhì)量數(shù)據(jù)(clean data)。對(duì)mapped reads進(jìn)行拼接，并與原有的基因組注釋信息進(jìn)行比較。本研究采用TPM(transcripts per million reads，即每百萬(wàn)reads中來(lái)自于某轉(zhuǎn)錄本的讀段數(shù))方法計(jì)算基因的表達(dá)量。再利用DEGseq軟件包篩選差異表達(dá)基因，篩選閥值為差異倍數(shù)(fold change)>2和調(diào)整后P值(P-adjust)<0.05，且P-adjust越小基因表達(dá)量差異越顯著。使用Goatools軟件對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能注釋和KEGG通路富集分析，且P<0.05時(shí)表示差異表達(dá)基因顯著富集。

1.6 RT-qPCR

根據(jù)差異表達(dá)基因?qū)Φ蜏貞?yīng)激的響應(yīng)程度，本研究采用RT-qPCR試驗(yàn)對(duì)關(guān)鍵通路中的差異表達(dá)基因進(jìn)行驗(yàn)證，以此評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)鑒定差異表達(dá)基因的可靠性。使用Primer 3.0對(duì)各差異表達(dá)基因進(jìn)行引物設(shè)計(jì)(表2)，并在上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成引物的合成。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(BestarTMqPCR RT Kit)將各樣品的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板。以18S RNA為內(nèi)參，并使用ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix(2×)試劑，采用ABI7300熒光定量PCR儀進(jìn)行定量檢測(cè)，每個(gè)樣品3個(gè)平行，以減小誤差。采用2-△△Ct的方法計(jì)算出各候選基因的相對(duì)表達(dá)量。

表2 RT-qPCR引物

1.7 血清生化和抗氧化指標(biāo)

血清總蛋白、白蛋白、球蛋白、膽固醇、葡萄糖、甘油三酯含量采用日立全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行測(cè)定。

血清抗氧化指標(biāo)均采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒測(cè)定，按照使用說(shuō)明進(jìn)行操作。

1.8 生長(zhǎng)性能指標(biāo)計(jì)算

增重率(%)=100×(終末均重-初始均重)/初始均重；特定生長(zhǎng)率(%/d)=100×(ln終末均重-ln初始均重)/養(yǎng)殖天數(shù)；飼料系數(shù)=投飼總量/(終末體重+死亡體重-初始體重)；存活率(%)=100×終末尾數(shù)/初始尾數(shù)。

1.9 數(shù)據(jù)分析

生長(zhǎng)性能、血清生化和抗氧化指標(biāo)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，以P<0.05為顯著差異水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 生長(zhǎng)性能

由表3可知，與攝食以亞硒酸鈉為硒源的飼料相比，攝食以酵母硒為硒源的飼料的黃顙魚的生長(zhǎng)性能無(wú)顯著變化(P>0.05)，但增重率、特定生長(zhǎng)率和存活率有升高的趨勢(shì)。

表3 攝食不同硒源飼料黃顙魚的生長(zhǎng)性能

2.2 低溫應(yīng)激后血清生化和抗氧化指標(biāo)變化

由表3可知，與亞硒酸鈉相比，低溫應(yīng)激后酵母硒顯著提高了黃顙魚血清甘油三酯含量以及抑制與產(chǎn)生超氧陰離子自由基能力(P<0.05)，顯著降低了血清丙二醛含量(P<0.05)。

表4 低溫應(yīng)激后攝食不同硒源飼料黃顙魚的血清生化和抗氧化指標(biāo)

2.3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)及比對(duì)分析

對(duì)T1組和T2組黃顙魚肝臟組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，共獲得42.00 Gb clean data，各樣品的clean data均達(dá)到6.68 Gb。測(cè)序樣品的數(shù)據(jù)質(zhì)量及比對(duì)結(jié)果見(jiàn)表5，各樣品的Q30占比均在93%以上，GC含量均在46%以上。將各樣品的高質(zhì)量reads(clean reads)與黃顙魚基因組進(jìn)行序列比對(duì)，比對(duì)率均在66%以上，表明此次測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量較高，可用于后續(xù)分析。

表5 測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量和序列比對(duì)

2.4 低溫應(yīng)激后差異表達(dá)基因分析

基于表達(dá)量指標(biāo)TPM，以fold change的絕對(duì)值>2，P-adjust<0.05為閾值，對(duì)同一基因在不同組的表達(dá)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。與T1組相比，T2組有76個(gè)基因表達(dá)量上調(diào)，71個(gè)基因表達(dá)量下調(diào)，差異表達(dá)基因如圖1所示。

圖1 差異表達(dá)基因火山圖(T1組vs.T2組)

2.5 低溫應(yīng)激后差異表達(dá)基因的GO功能注釋及富集分析

Unigene在GO分類中被注釋到生物過(guò)程、細(xì)胞組分和分子功能等3大類別中。與T1組相比，T2組肝臟基因表達(dá)譜主要與代謝過(guò)程、催化活性、結(jié)合、單組織過(guò)程、細(xì)胞進(jìn)程等生物功能有關(guān)(圖2)，顯著富集到蛋白質(zhì)水解作用、水解酶活性、肽酶活性、肽鏈內(nèi)切酶活性、羧肽酶活性、蛋白質(zhì)代謝過(guò)程(圖3)。

X軸為注釋的基因/轉(zhuǎn)錄本數(shù)量，Y軸為GO term，圖中顯示的是豐度前20個(gè)GO term。X-axis was the annotated number of genes/transcripts, and Y-axis was GO term.The figure showed the top 20 GO terms of abundance.

X軸為富集的基因/轉(zhuǎn)錄本數(shù)量，Y軸為GO term，圖中顯示的是P-adjust最小的前20個(gè)GO term。X-axis was the enriched number of genes/transcripts, and Y-axis was GO term.The figure showed the top 20 GO terms with the smallest P-adjust.

2.6 低溫應(yīng)激后差異表達(dá)基因的KEGG功能注釋及富集分析

Unigene在KEGG分類中被注釋到代謝、環(huán)境信息處理、細(xì)胞過(guò)程、生物體系統(tǒng)、人類疾病等五大類別中。與T1相比，T2組差異表達(dá)基因主要注釋到消化系統(tǒng)、信號(hào)分子與相互作用、信號(hào)傳導(dǎo)、脂代謝、內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、糖代謝、氨基酸代謝、運(yùn)輸和分解代謝通路(圖4)，顯著富集到胰腺分泌、蛋白質(zhì)消化吸收、脂肪消化吸收、花生四烯酸代謝及醚脂類代謝通路(圖5)。

X軸為KEGG通路，Y軸為注釋的基因/轉(zhuǎn)錄本數(shù)量。圖中顯示的是注釋到的KEGG通路。X-axis was KEGG pathways, and Y-axis was the annotated number of genes/transcripts.The figure showed the annotated KEGG pathways.

X軸為富集的基因/轉(zhuǎn)錄本數(shù)量，Y軸為KEGG通路。圖中顯示的是所有富集的KEGG通路。X-axis was the annotated number of genes/transcripts, and Y-axis was KEGG pathways.The figure showed all the KEGG pathways.

2.7 低溫應(yīng)激后差異表達(dá)基因的分析及驗(yàn)證

如表6所示，胰腺分泌、蛋白質(zhì)消化與吸收、脂肪消化與吸收、花生四烯酸代謝、醚脂代謝等通路的類胰蛋白酶-1、羧肽酶A1、羧肽酶B、磷脂酶A2等關(guān)鍵基因的表達(dá)都顯著上調(diào)。利用RT-qPCR對(duì)蛋白質(zhì)消化與吸收通路差異表達(dá)基因硒蛋白M、磷脂酶A2、羧肽酶A1、類胰蛋白酶-1、胰凝乳蛋白酶樣彈性蛋白酶家族成員2A的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果中表達(dá)顯著上調(diào)的基因其驗(yàn)證結(jié)果也為表達(dá)顯著上調(diào)，表明基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)的差異表達(dá)基因分析結(jié)果可信(表7)。

表6 低溫應(yīng)激后相關(guān)差異表達(dá)基因的表達(dá)

表7 差異表達(dá)基因的qRT-PCR分析

3 討 論

生長(zhǎng)性能結(jié)果顯示，酵母硒組黃顙魚的生長(zhǎng)性能優(yōu)于亞硒酸鈉組，這一結(jié)果與我們前期開(kāi)展的8周養(yǎng)殖試驗(yàn)獲得的結(jié)果[5]一致，同樣，低溫應(yīng)激后血清谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、丙二醛以及抑制與產(chǎn)生超氧陰離子自由基所反映的抗氧化能力提高也與前期研究結(jié)果[5]一致。

溫度作為對(duì)魚體最重要的影響因素之一，對(duì)魚體自身的新陳代謝起著至關(guān)重要的作用。隨著水溫的持續(xù)降低以及應(yīng)激時(shí)間的延長(zhǎng)，魚體內(nèi)環(huán)境出現(xiàn)紊亂。研究顯示，部分魚類承受低溫應(yīng)激能力較強(qiáng)，最終可通過(guò)自身調(diào)節(jié)系統(tǒng)使機(jī)體適應(yīng)外界環(huán)境的變化，以維持或重建魚體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，從而減少或避免應(yīng)激造成的損傷；但一部分魚類自身抵抗力差，持續(xù)的低溫應(yīng)激對(duì)自身機(jī)體耗能過(guò)多，其自身的調(diào)節(jié)系統(tǒng)不足以使機(jī)體內(nèi)環(huán)境再次達(dá)到穩(wěn)定平衡的狀態(tài)，最終魚類自身調(diào)節(jié)系統(tǒng)衰竭，造成死亡[7]。魚類的內(nèi)分泌機(jī)能以及蛋白質(zhì)、脂肪和糖類等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的代謝對(duì)低溫應(yīng)激敏感[2,8-9]，低溫應(yīng)激從多方面影響魚類的生理活動(dòng)，顯然單獨(dú)研究某個(gè)或某些基因不能揭示信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)為我們從整體水平揭示特定生物學(xué)過(guò)程發(fā)生的分子機(jī)理提供了研究手段。

本研究通過(guò)轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)酵母硒組與亞硒酸鈉組之間共產(chǎn)生了147個(gè)差異表達(dá)基因，GO功能注釋表明，差異表達(dá)基因的功能主要在蛋白質(zhì)水解作用、催化活性(作用于蛋白質(zhì))、水解酶活性、肽酶活性、水解酶活性(作用于酸性磷氮鍵)、肽鏈內(nèi)切酶活性、蛋白質(zhì)代謝過(guò)程、脂質(zhì)分解過(guò)程富集，KEGG功能注釋顯示差異表達(dá)基因主要注釋到消化系統(tǒng)、信號(hào)分子與相互作用、信號(hào)傳導(dǎo)、脂代謝、內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、碳水化合物代謝、氨基酸代謝、運(yùn)輸和分解代謝通路，并顯著富集到胰腺分泌、蛋白質(zhì)消化吸收、脂肪消化吸收、花生四烯酸代謝、醚脂類代謝。上述結(jié)果表明，與亞硒酸鈉比較，酵母硒激活了內(nèi)分泌，蛋白質(zhì)、氨基酸、脂肪和糖類代謝等多個(gè)生物學(xué)過(guò)程，以調(diào)節(jié)黃顙魚適應(yīng)低溫應(yīng)激。魚類為了適應(yīng)環(huán)境脅迫，機(jī)體表現(xiàn)出神經(jīng)內(nèi)分泌活動(dòng)的改變，低溫應(yīng)激改變了水產(chǎn)動(dòng)物的內(nèi)分泌系統(tǒng)[10-11]，當(dāng)虹鱒(Oncorhynchusmykiss)處于急性低溫脅迫時(shí)，正常的甲狀腺功能降低[12]。硒具有調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)分泌激素的作用，硒蛋白P和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶與胰島β細(xì)胞的功能有關(guān)，具有降低血糖和調(diào)控胰島素介導(dǎo)的代謝過(guò)程等擬胰島素作用[13]，而碘甲腺原氨酸脫碘酶能夠介導(dǎo)甲狀腺激素的形成和降解，具有調(diào)節(jié)甲狀腺激素代謝平衡的作用[14]。本試驗(yàn)中，低溫應(yīng)激后酵母硒組的黃顙魚肝臟中23個(gè)差異表達(dá)基因富集在胰液分泌通路且顯著上調(diào)，這一結(jié)果也證明硒參與了黃顙魚低溫應(yīng)激時(shí)的內(nèi)分泌調(diào)控，與前述研究結(jié)果一致。有機(jī)硒的吸收效率和生物利用率高于無(wú)機(jī)硒[5,15-16]，這可能是導(dǎo)致酵母硒組黃顙魚內(nèi)分泌通路顯著上調(diào)的原因，這也恰恰說(shuō)明當(dāng)黃顙魚處于低溫應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，飼料中添加酵母硒能夠增強(qiáng)黃顙魚低溫應(yīng)激時(shí)的內(nèi)分泌機(jī)能，提高黃顙魚的抗寒能力。

胰腺分泌的有機(jī)物是多種消化酶，可作用于糖類、脂肪和蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)及消化過(guò)程[17-18]，其中胰腺脂肪酶包括甘油三酯脂酶、磷脂酶A2等，是主要的脂肪消化酶[19-20]。李敏芬[21]研究發(fā)現(xiàn)，急性低溫脅迫時(shí)烏鱧(Channaargus)和烏斑鱧(Channamaculata)的脂肪酶活性顯著上升，推測(cè)烏鱧及烏斑鱧對(duì)低溫的適應(yīng)性可能較好。此外，在暗紋東方鲀(Takifugufasciatus)[22]、斑馬魚(Daniorerio)[23]、牙鲆(Paralichthysolivaceus)[24]、金頭鯛(Sparusaurata[25]、鯉魚(CyprinuscarpioL.)[26]等魚類中發(fā)現(xiàn)低溫下脂類代謝增強(qiáng)，脂類代謝通路在魚類應(yīng)對(duì)低溫時(shí)發(fā)揮了關(guān)鍵作用。本試驗(yàn)中，酵母硒提高了胰液分泌通路上胰腺三酰甘油、磷脂酶A2、羧基酯脂肪酶的表達(dá)，同時(shí)脂肪消化與吸收通路顯著富集，血清甘油三酯含量顯著升高。羧基酯脂肪酶主要參與消化甘油三酯，為生命提供能量的物質(zhì)，說(shuō)明酵母硒提高了黃顙魚的脂肪分解供能能力，為機(jī)體積極應(yīng)對(duì)低溫應(yīng)激提供熱量。研究顯示，酵母硒本身具有顯著提高鳡魚(Elopichthysbambusa)[27]、草魚(Ctenopharyngodonidellus)[28]、刺參(Apostichopusjaponicas)[29]脂肪酶活性的能力，本研究結(jié)果與此一致。然而，在我們前期進(jìn)行的8周養(yǎng)殖試驗(yàn)的低溫應(yīng)激結(jié)果中，酵母硒組和亞硒酸鈉組黃顙魚血清甘油三酯含量并未出現(xiàn)顯著差異[5]。魚體的應(yīng)激調(diào)控系統(tǒng)是一個(gè)多層次、多功能的結(jié)構(gòu)體系[30]，動(dòng)物的分子響應(yīng)與代謝產(chǎn)物產(chǎn)生的時(shí)空特性還有待于進(jìn)一步研究。

蛋白質(zhì)作為體內(nèi)重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，首先在胃和腸道中被胃蛋白酶、胰蛋白酶以及肽酶等降解生成肽類物質(zhì)和游離氨基酸。動(dòng)物在面臨低溫應(yīng)激時(shí)自動(dòng)分解的氨基酸，一方面用于蛋白質(zhì)的合成與周轉(zhuǎn)，另一方面還可能承擔(dān)著抗應(yīng)激的功能[2]。研究發(fā)現(xiàn)，凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)在低溫應(yīng)激時(shí)肝胰腺啟動(dòng)了蛋白質(zhì)的分解機(jī)制以彌補(bǔ)體內(nèi)氨基酸的缺乏[31]，鱧在短時(shí)間低溫脅迫時(shí)胰蛋白酶活性顯著升高，通過(guò)消耗機(jī)體蛋白質(zhì)來(lái)應(yīng)對(duì)低溫脅迫[21]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，有18個(gè)差異表達(dá)基因顯著富集在蛋白質(zhì)消化與吸收通路，該通路中類胰蛋白酶-1、胰凝乳蛋白酶樣彈性蛋白酶家族成員2A、羧肽酶A1和羧肽酶B的表達(dá)量在酵母硒組顯著上調(diào)，表明酵母硒促使黃顙魚在低溫應(yīng)激時(shí)蛋白質(zhì)分解作用增強(qiáng)。本試驗(yàn)中酵母硒組黃顙魚血清總蛋白含量高于亞硒酸鈉組，但差異不顯著。目前，硒影響動(dòng)物蛋白質(zhì)代謝的報(bào)道主要集中在正常養(yǎng)殖環(huán)境下硒促進(jìn)蛋白質(zhì)合成方面，例如，酵母硒通過(guò)提高虹鱒肌肉的生長(zhǎng)以及肌肉蛋白質(zhì)的含量實(shí)現(xiàn)生長(zhǎng)[32-33]；硒激活胰島素信號(hào)級(jí)聯(lián)和調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)代謝，有利于骨骼肌發(fā)育[34]；母體補(bǔ)硒提高肉雞雉雞胸肌含量以及雷帕霉素的基因表達(dá)等[35]。但有關(guān)硒影響蛋白質(zhì)水解生成氨基酸的研究鮮有報(bào)道。

糖類是低溫應(yīng)激下魚類的重要能源物質(zhì)，機(jī)體為了抵御寒冷，可能會(huì)加快糖的分解利用。研究認(rèn)為，在應(yīng)激初期，糖原轉(zhuǎn)化成葡萄糖的速率加快，血糖水平上升；在應(yīng)激后期，血糖被大量分解生成ATP，以給機(jī)體提供能量，此時(shí)血糖水平會(huì)降低[36]。鯉魚、在急性低溫脅迫時(shí)糖酵解/糖質(zhì)新生過(guò)程被顯著富集，關(guān)鍵酶葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PC)、果糖-1,6-二磷酸酶(FBP)和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PCK)的基因表達(dá)量在鯉低溫適應(yīng)過(guò)程中均顯著升高[37]。然而，本試驗(yàn)條件下未篩選到糖代謝通路。在我們的前期研究中發(fā)現(xiàn)當(dāng)溫度下降到13℃時(shí)酵母硒組黃顙魚血清葡萄糖含量高于亞硒酸鈉組且達(dá)到顯著水平[5]，在此次試驗(yàn)中酵母硒組血清葡萄糖含量也高于亞硒酸鈉組，但未達(dá)到顯著水平。因此，本試驗(yàn)中導(dǎo)致糖代謝通路未被注釋和富集的原因需要進(jìn)一步研究。

硒蛋白M是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)硒蛋白，具有維持機(jī)體氧化還原水平、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞和調(diào)節(jié)鈣穩(wěn)態(tài)平衡等重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，凡納濱對(duì)蝦通過(guò)RNA干擾RNAi沉默硒蛋白M會(huì)降低鰓部過(guò)氧化物酶的活性，硒蛋白M是調(diào)節(jié)鰓氧化應(yīng)激的關(guān)鍵酶，可以作為肝胰腺的第二信使調(diào)節(jié)因子在氧化還原系統(tǒng)中發(fā)揮作用[38]。當(dāng)外源性能源的獲取受到抑制時(shí)，機(jī)體需要?jiǎng)訂T更多的內(nèi)源性能源物質(zhì)或潛在產(chǎn)能底物來(lái)提供能量應(yīng)對(duì)低溫環(huán)境，更多參與轉(zhuǎn)錄正調(diào)控、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、能量代謝、內(nèi)分泌等生理活動(dòng)的基因表達(dá)激活、上調(diào)都有助于對(duì)低溫環(huán)境的適應(yīng)[38]。本研究中，酵母硒組黃顙魚肝臟硒蛋白M的表達(dá)顯著上調(diào)，推測(cè)酵母硒可能通過(guò)提高硒蛋白M的表達(dá)進(jìn)而上調(diào)胰腺分泌、蛋白質(zhì)消化與吸收、脂肪消化與吸收等通路關(guān)鍵基因的表達(dá)，發(fā)揮酵母硒優(yōu)于亞硒酸鈉抗低溫應(yīng)激的效果。

4 結(jié) 論

與亞硒酸鈉相比，酵母硒可能通過(guò)提高黃顙魚硒蛋白M的表達(dá)，上調(diào)胰腺分泌、蛋白質(zhì)消化與吸收、脂肪消化與吸收、花生四烯酸代謝、醚脂代謝等通路中胰蛋白酶、羧肽酶、磷脂酶、羧基酯脂肪酶等關(guān)鍵基因的表達(dá)，進(jìn)而提高黃顙魚的抗低溫應(yīng)激能力。