李洪洋 南雪梅 孫 鵬

(中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動物營養(yǎng)學國家重點實驗室，北京 100193)

奶牛乳房炎是一種高發(fā)性多因素疾病，生理狀態(tài)、營養(yǎng)水平、環(huán)境條件、管理制度等方面的差異均有可能引起奶牛乳房炎的發(fā)生，導致產(chǎn)奶量和乳品質(zhì)受到影響，致使牧場經(jīng)濟效益大幅降低[1]。病源微生物是引起奶?；既榉垦椎闹饕蛑?，常見的致病菌包括金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和無乳鏈球菌，涵蓋革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性菌兩大類[2-3]，它們分布于空氣、水體以及奶牛可接觸物體表面，極易導致奶牛罹患乳房炎。致病菌由乳頭導管入侵并進入乳腺組織，隨后引發(fā)感染和炎癥反應[4]。由于前期治療乳房炎的有效藥物較少，使得抗生素憑借顯著的抗菌效果受到廣泛應用。但隨著抗生素的大量使用，由其導致了耐藥性、藥物殘留以及由此引發(fā)的食品安全等問題，因此，亟需尋求更為安全有效且成本低廉的天然活性物質(zhì)以替代抗生素。

褪黑素(melatonin，MT)是一種主要由松果體合成分泌的吲哚類激素[5]，其在皮膚[6]、骨髓[7]、視網(wǎng)膜[8]、線粒體[9]亦可少量合成，在體內(nèi)分布廣泛，成為重要的“同步信號”，可有效調(diào)控機體的生物節(jié)律[10]。隨著相關(guān)研究的深入，發(fā)現(xiàn)MT可發(fā)揮抗氧化[11]和免疫[12]等生物學效應。研究證實，MT及其多級代謝產(chǎn)物具有強大的抗氧化功能，是一種有效的自由基捕獲劑[13]。除自身強有力的抵抗自由基的活性外，MT還能夠通過促進抗氧化物酶的生成和增效抗氧化物酶的活性，從而發(fā)揮抗氧化效應[14]。研究表明，MT對免疫細胞具有增殖及增效作用，MT在谷胱甘肽和谷胱甘肽還原酶缺乏的情況下，可參與維持中性粒細胞的活性和功能[15]。MT與T細胞的關(guān)系也十分密切，現(xiàn)已證實T細胞內(nèi)含有合成MT所需的4種酶類，并可在特定情況下高水平分泌。同時，MT對T細胞的激活和分化也存在調(diào)控功能，尤其是輔助性T細胞17(Th17)、調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)和記憶T細胞[16]。近年來，除MT清除體內(nèi)自由基、促進免疫應答的功能外，其抗炎效應亦受到廣泛關(guān)注[17]。因此，本試驗旨在通過脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導奶牛乳腺上皮細胞(bovine mammary epithelial cells，BMECs)炎癥反應模型，探究MT對LPS引起的BMECs炎癥反應的緩解作用及潛在機制，為應用MT防治奶牛乳房炎提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

BMECs獲贈于北京畜牧獸醫(yī)研究所智慧畜牧業(yè)創(chuàng)新團隊，液氮保存；LPS[大腸桿菌(E.coli)O55∶B5]購自美國Sigma公司；MT購自上海易恩化學技術(shù)有限公司；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、DMEM+GlutaMAX培養(yǎng)基、F-12培養(yǎng)液、D-Hank’s平衡鹽溶液(Hank’s balanced salt solution，HBSS，不含鈣、鎂)、0.05%胰蛋白酶(trypsin)-乙二胺四乙酸(EDTA)消化液和Pen Strep雙抗混合液購自美國Thermo Fisher公司；腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)、白細胞介素-6(interleukin 6，IL-6)和白細胞介素-1β(interleukin 1β，IL-1β)的酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒購自上海瑞番生物科技有限公司；四甲基偶氮唑藍[3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide，MTT]細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒購自北京酷來博科技有限公司，Western blot相關(guān)試驗材料購自上海碧云天公司；一抗β-肌動蛋白(β-actin)和核因子-κB同源蛋白(P65)購自美國Immuno Way公司，Toll樣受體4(TLR4)購自美國Santa Cruz公司，核因子-κB抑制蛋白(IκB-α)購自美國CST公司；二抗購自美國Jackson ImmunoResearch公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 BMECs的培養(yǎng)

BMECs復蘇后，使用完全培養(yǎng)基(DMEM/F12，含10% FBS和1%雙抗)于37 ℃、5%二氧化碳(CO2)培養(yǎng)，傳3～8代后用于后續(xù)試驗[18]。

1.2.2 LPS炎性模型構(gòu)建

1.2.2.1 LPS處理液的配制

將10 mg LPS溶解于10 mL HBSS(含1%雙抗)配制1 mg/mL的LPS儲存液，分裝后-20 ℃儲存。使用時取1 mL儲存液溶于9 mL的無血清DMEM/F12培養(yǎng)基(含1%雙抗)配制100 μg/mL處理母液，再通過稀釋添加不同體積無血清DMEM/F12培養(yǎng)基(含1%雙抗)進一步配制濃度分別為0.1、0.5、1.0、5.0和10.0 μg/mL的LPS處理液，現(xiàn)用現(xiàn)配[10]。

1.2.2.2 LPS誘導BMECs炎癥反應模型

將BMECs按1×104個/孔接種于96孔板，每孔加入基礎培養(yǎng)基200 μL，邊緣孔各加入200 μL HBSS，培養(yǎng)24 h后，更換無血清DMEM/F12培養(yǎng)基(含1%雙抗)培養(yǎng)12 h。隨后每列分別更換為不同濃度(0、0.1、0.5、1.0、5.0和10.0 μg/mL)的LPS處理液100 μL，繼續(xù)分別培養(yǎng)6和12 h，每個濃度設6個重復。預試驗中，與0 μg/mL組相比，細胞活性和炎性因子水平出現(xiàn)顯著差異視為炎癥誘導成立[19]。

1.2.2.3 MTT檢測法

按照MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒說明書，避光條件下每孔加入20 μL MTT溶液，培養(yǎng)處理4 h；取出后每孔加入100 μL二甲基亞砜(DMSO)終止反應，搖床10 min后，用酶標儀(SpectraMax M5，美國Molecular Devices公司)在570 nm處測定吸光度。

1.2.2.4 炎性細胞因子含量檢測

按ELISA測定試劑盒說明書進行TNF-α、IL-6、IL-1β含量檢測，用酶標儀在450 nm處測定吸光度。

1.2.3 MT對BMECs活性的影響

1.2.3.1 MT處理液的配制

稱取0.023 2 g MT溶解于1 mL乙醇中[10]，再將溶解于乙醇的MT樣品溶解于99 mL無血清DMEM/F12培養(yǎng)基(含1%雙抗)，配制濃度為1 mmol/L的MT儲存液，以10 mL為單位分裝后-20 ℃儲存。使用時10 mL儲存液1∶9稀釋于無血清DMEM/F12培養(yǎng)基(含1%雙抗)配制處理母液，再用無血清DMEM/F12培養(yǎng)基(含1%雙抗)進一步配制濃度分別為1、5、10、50和100 μmol/L的MT處理液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.3.2 MT對BMECs活性的影響

將BMECs按1×104個/孔接種于96孔板，每孔加入基礎培養(yǎng)基200 μL，邊緣孔各加入200 μL HBSS，培養(yǎng)24 h后，更換DMEM/F12培養(yǎng)基(不含F(xiàn)BS，含1%雙抗)培養(yǎng)12 h。隨后每列分別更換為不同濃度(0、1、5、10、50和100 μmol/L)的MT處理液100 μL，繼續(xù)分別培養(yǎng)48 h。每個濃度設6個重復，利用MTT法測定細胞活性。

1.2.4 MT對LPS誘導的BMECs炎癥反應的影響

試驗共分為7組，對照組(C組)BMECs不進行LPS誘導和MT處理，LPS組BMECs進行LPS誘導12 h，LPS+MT組BMECs進行LPS誘導12 h后再經(jīng)不同濃度(1、5、10、50和100 μmol/L)MT處理48 h。每組設4個重復。

1.2.5 炎性細胞因子含量檢測

按ELISA測定試劑盒說明書對各組的細胞培養(yǎng)基進行炎性細胞因子(TNF-α、IL-6、IL-1β)含量檢測，使用酶標儀于450 nm處測定其吸光度值。

1.2.6 Western blot檢測炎癥反應相關(guān)蛋白的表達

使用HBSS清洗各組BMECs樣本。在細胞培養(yǎng)皿中添加細胞裂解液，用細胞刮刀刮取細胞后，將懸液移至新的做好標記的1.5 mL離心管中放在冰上進行充分裂解。4 ℃、12 000 r/min離心10 min后，將樣品的上清液移入離心管中。測定蛋白濃度，并調(diào)整蛋白濃度一致為4.0 μg/μL。隨后制備十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠，待膠體凝后將膠板組裝于電泳槽中，倒?jié)M電泳緩沖液依次加樣20 μg/孔。隨后120 V、15 min和200 V、45 min進行電泳。電泳結(jié)束后采用三明治濕轉(zhuǎn)法，用提前配制好的轉(zhuǎn)膜液進行轉(zhuǎn)膜。隨后，對膜進行封閉和一抗、二抗孵育，置于全自動化學發(fā)光儀(Tanon，5200)中顯色后，使用Image J分析軟件V1.8.0分析條帶的灰度值。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 365進行整理，應用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計，MTT法和Western blot檢測的試驗結(jié)果進行獨立t檢驗，ELISA法的試驗結(jié)果進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，并采用Duncan氏法進行多重比較。P<0.05代表差異顯著，P<0.01代表差異極顯著。試驗結(jié)果用平均值±標準差(mean±SD)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 LPS誘導BMECs炎癥細胞模型

預試驗中，利用MTT法測定細胞活性和ELISA法測定TNF-α、IL-6和IL-1β含量，確定LPS誘導細胞炎癥模型的處理濃度為10 μg/mL，處理時間為12 h。

2.2 MT對BMECs活性的影響

不同濃度(1、5、10、50和100 μmol/L)的MT作用于BMECs 48 h后，采用MTT法測定細胞活性，結(jié)果如圖1所示，不同濃度的MT處理對BMECs活性無顯著影響(P>0.05)，其中1和5 μmol/L MT組BMECs活性較高。

數(shù)據(jù)柱標注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同或無字母表示差異不顯著(P>0.05)。圖2同。

2.3 MT對LPS誘導的BMECs炎性因子含量的影響

如圖2所示，LPS誘導的BMECs中TNF-α、IL-6和IL-1β含量升高，其中，LPS組BMECs中IL-6和IL-1β含量顯著高于對照組(P<0.05)，LPS組BMECs中TNF-α含量與對照組差異不顯著(P>0.05)。BMECs經(jīng)MT處理48 h后，與LPS組相比，10和50 μmol/L MT組BMECs中TNF-α含量顯著降低(P<0.05)，1、5、10和100 μmol/L MT組BMECs中IL-6含量顯著降低(P<0.05)，10 μmol/L MT組BMECs中IL-1β含量顯著降低(P<0.05)。綜上所述，10 μLPS組的MT對LPS誘導的BMECs炎性因子含量升高的抑制效果最顯著。

C代表對照組；LPS代表LPS組；LPS+MT代表LPS+MT組；1、5、10、50、100分別代表1、5、10、50、100 μmol/L的MT。下圖同。

2.4 MT對LPS誘導的BMECs中TLR4、P65和IκB-α蛋白表達量的影響

如圖3所示，與對照組相比，LPS組BMECs中TLR4蛋白表達量有所升高(P>0.05)；與LPS組相比，不同劑量MT處理的BMECs中TLR4蛋白表達量均有所下降，其中50和100 μmol/L MT組差異顯著(P<0.05)。與對照組相比，LPS組BMECs中P65蛋白表達量顯著降低(P<0.05)；與LPS組相比，不同劑量MT處理的BMECs中P65蛋白表達量均有所升高，其中1和50 μmol/L MT組差異顯著(P<0.05)，10 μmol/L MT組差異極顯著(P<0.01)。與對照組相比，LPS組BMECs中P65蛋白表達量顯著降低(P<0.05)；與LPS組相比，不同劑量MT處理的BMECs中IκB-α蛋白表達量均有所升高，其中1、10和50 μmol/L MT組差異顯著(P<0.05)，5 μmol/L MT組差異極顯著(P<0.01)。

數(shù)據(jù)柱標注*表示與LPS組相比差異顯著(P<0.05)，標注**表示與LPS組相比差異極顯著(P<0.01)。

3 討 論

3.1 MT對LPS誘導的BMECs炎癥反應的影響

近年來，相繼發(fā)現(xiàn)MT的抗氧化、免疫和抗炎等生物學效應[11-12,17]，利用MT作為抗炎藥物緩解奶牛乳房炎不失為一種可嘗試的新思路。LPS作為大腸桿菌外膜的組成成分，利用其誘導BMECs建立體外炎癥模型在奶牛乳房炎的防治研究中被廣泛應用[18]。因此，本試驗旨在探究MT對LPS誘導的BMECs炎癥反應的影響。本試驗結(jié)果顯示，MT能夠降低LPS誘導的BMECs中炎性細胞因子含量，抑制TLR4蛋白表達量，抑制P65蛋白表達量的降低，升高IκB-α蛋白表達量，表明本試驗中MT對LPS誘導的BMECs的炎癥反應具有緩解作用。

3.2 MT對LPS誘導的BMECs中炎性細胞因子含量的影響

研究表明，體內(nèi)細胞因子含量的變化是誘發(fā)機體炎癥反應的主要原因[20]。TNF-α、IL-1β和IL-6作為炎性細胞因子，在體內(nèi)具有重要的信息傳遞作用[21]。它們與細胞中含有的特異性受體結(jié)合后，通過不同的信號傳導通路激發(fā)機體的免疫應答反應?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，MT進行預處理的Caco-2細胞再經(jīng)IL-1β炎癥誘導時，其炎性因子IL-6含量與對照組相比有所降低，表明MT對炎癥反應具有預防作用[22]。由于乳房炎屬于一種防治兼顧的炎癥疾病，因此本試驗重點研究其對BMECs炎癥反應的治療功效。本試驗中測定了MT對LPS誘導12 h后BMECs培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6含量的影響，發(fā)現(xiàn)經(jīng)LPS誘導12 h后BMECs培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6含量顯著升高，加入MT后顯著抑制了以上炎性細胞因子含量的升高，且基于這3種炎性細胞因子的綜合抑制效果發(fā)現(xiàn)，10 μmol/L MT的作用效果最佳，表明MT對LPS誘導的BMECs炎癥反應具有緩解作用。與本試驗結(jié)果相似，Mishra等[23]利用高濃度乙醇誘導小鼠肝臟組織損傷后，發(fā)現(xiàn)肝細胞中TNF-α、IL-1β和IL-6含量顯著升高，添加MT后得到有效抑制。Naveen等[24]研究發(fā)現(xiàn)，支氣管炎、鼻炎、肺纖維化及哮喘等疾病發(fā)生時，炎性細胞因子含量大幅升高，MT通過細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(ERK1/2)和磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信號通路抑制了肺部成纖維細胞中炎性細胞因子的過度表達，因此MT對BMECs中炎性細胞因子的抑制亦與信號通路密切相關(guān)。

3.3 MT對LPS誘導的BMECs中TLR4、P65和IκB-α蛋白表達的影響

研究發(fā)現(xiàn)，TLR4可識別LPS并通過信號傳導激活核因子-κB(NF-κB)[25]。NF-κB是一種轉(zhuǎn)錄因子，廣泛參與炎癥反應和先天性免疫應答等細胞活動。正常生理狀態(tài)下，NF-κB與NF-κB抑制蛋白(IκB)結(jié)合，以無活性的NF-κB/IκB復合物形式存在于細胞質(zhì)中。LPS作為一種外源性激活劑，能夠刺激IκB激酶活化，導致IκB發(fā)生磷酸化并被降解，引發(fā)NF-κB/IκB復合物解聚，從而使NF-κB活化并被釋放進入細胞核內(nèi)，與特定基因的啟動位點結(jié)合并調(diào)控相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯。研究表明，MT可通過抗氧化級聯(lián)反應清除過量的自由基，抑制細胞因子，從而調(diào)控NF-κB介導的炎癥反應[26]，MT也能夠直接調(diào)控NF-κB激發(fā)的炎癥信號通路[27]。因此，MT對于BMECs炎癥反應的緩解作用與NF-κB信號通路密切相關(guān)。本試驗中，MT能夠影響LPS誘導的BMECs中TLR4、P65和IκB-α蛋白表達量。MT處理BMECs 48 h后，不同劑量MT均能夠抑制TLR4蛋白表達量，且50和100 μmol/L MT組差異顯著，表明MT可能通過TLR4調(diào)控NF-κB介導的炎癥反應。不同劑量MT均抑制了LPS引起的P65蛋白表達量的降低，使其趨于對照組的正常水平，其中10 μmol/L MT組效果最顯著。與LPS組相比，不同劑量MT對IκB-α蛋白表達量均呈現(xiàn)促進效果，其中5 μmol/L MT組差異極顯著，表明MT通過促進IκB-α蛋白的表達，使NF-κB以無活性的復合物形式存在，從而抑制NF-κB引起的炎癥反應。Shao等[28]研究發(fā)現(xiàn)，MT有效抑制LPS誘導的小鼠乳腺上皮細胞中TLR4蛋白表達量，P65和IκB蛋白的磷酸化水平被顯著抑制，P65和IκB蛋白表達量有所升高，與本試驗結(jié)果一致。綜上所述，MT通過調(diào)控TLR4、P65和IκB-α的蛋白表達參與NF-κB炎癥通路，緩解LPS誘導的BMECs炎癥反應。

4 結(jié) 論

① MT能夠降低LPS誘導的BMECs中TNF-α、IL-1β和IL-6含量，且10 μmol/L MT組作用效果最佳。

② MT能夠抑制LPS誘導的BMECs中TLR4蛋白表達量的升高，并對P65和IκB-α蛋白表達量具有調(diào)控作用，MT可能通過參與NF-κB炎癥通路緩解LPS誘導的BMECs炎癥反應。