衡 諾 馬 鑫 郭 勇 齊曉龍* 盛熙暉 王相國(guó) 邢 凱 肖龍菲 陳 余 王 梁 倪和民

(1.北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 102206；2.北京市畜牧總站，北京 100107)

硒是動(dòng)物體內(nèi)的必需微量元素，影響動(dòng)物的繁殖力和生產(chǎn)力[1]。研究表明，硒是生物體內(nèi)谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的活性中心，其抗氧化作用可消除因自由基造成的氧化損傷，保護(hù)體內(nèi)細(xì)胞的正常生理功能，從而改善動(dòng)物繁殖性能[2]。目前，關(guān)于有機(jī)硒對(duì)種公畜禽繁殖性能的影響主要集中在對(duì)精子活力的研究上，但對(duì)于有機(jī)硒組和不添加硒組間的睪丸組織轉(zhuǎn)錄組測(cè)序方面的研究鮮有報(bào)道[3-4]。飼糧中添加適量的硒可以增強(qiáng)畜禽繁殖性能，然而關(guān)于有機(jī)硒是否能夠調(diào)控分子層面進(jìn)而增強(qiáng)其繁殖性能尚不明確[5-6]。本課題組前期通過比較飼糧中添加不同水平的硒代蛋氨酸對(duì)種公雞繁殖性能的影響，發(fā)現(xiàn)飼糧中添加硒水平為1 mg/kg的硒代蛋氨酸能提高種公雞的繁殖性能，且血漿中生殖激素含量最高[7]。本試驗(yàn)以此為基礎(chǔ)，選用378日齡蛋用種公雞為研究對(duì)象，通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的方法，挖掘種公雞睪丸組織中顯著差異表達(dá)的基因并對(duì)其功能進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，旨在探討硒提高種公雞繁殖能力的作用機(jī)制，為后續(xù)提高種公雞繁殖性能的營(yíng)養(yǎng)調(diào)控提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和基礎(chǔ)飼糧

選取120只378日齡健康、體況一致的羅曼褐蛋用種公雞為試驗(yàn)動(dòng)物。所用硒代蛋氨酸中硒的含量是0.2%?；A(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，將120只種公雞隨機(jī)分為2個(gè)組，每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10只雞。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗(yàn)組在基礎(chǔ)飼糧中添加硒水平為1 mg/kg的硒代蛋氨酸。試驗(yàn)預(yù)試期1周，正試期4周。試驗(yàn)用種公雞均采用單籠飼養(yǎng)，自由采食和飲水，光照采用每天13 h光照和11 h黑暗。

1.3 睪丸樣本采集和總RNA提取

試驗(yàn)期末，每個(gè)重復(fù)任選取1只種公雞，參照動(dòng)物福利對(duì)其處死后取出左側(cè)睪丸，減去附睪并剝離睪丸質(zhì)膜，分裝于1.5 mL的離心管中，在-80 ℃冰箱內(nèi)保存，用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。睪丸組織采用Trizol法，按照總RNA提取試劑盒說明書進(jìn)行操作，操作過程中所有直接接觸樣本的設(shè)備均采用紫外光照30 min以上。采用微量紫外分光光度計(jì)(Nanodrop 2000)計(jì)算出提取的RNA濃度及260和280 nm的吸光度(OD)值(OD260 nm/OD280 nm讀數(shù)在1.8～2.2時(shí)表明RNA質(zhì)量最好)，使用Agilent Bioanalyzer 2100系統(tǒng)的RNA 6000 Nano分析試劑盒來評(píng)估RNA樣本的完整性。測(cè)定完畢后，將剩余的RNA樣本進(jìn)行分裝，編號(hào)置于-80 ℃冷藏，之后將睪丸組織樣本送于北京百邁客生物科技有限公司進(jìn)行睪丸轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

1.4 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的文庫準(zhǔn)備

RNA樣本檢測(cè)合格后，進(jìn)行文庫構(gòu)建，主要流程如下：用多聚T寡糖磁珠富集真核生物mRNA，將mRNA隨機(jī)打斷并以mRNA為模板，用六堿基隨機(jī)引物生成第1條cDNA；隨后加入緩沖液、DNA聚合酶Ⅰ(DNA polymerase Ⅰ)、核糖核酸酶H(RNase H)和核苷三磷酸(dNTPs)生成第2條cDNA；利用AMPure XP磁珠純化cDNA后對(duì)cDNA進(jìn)行末端修復(fù)，加A尾并連接測(cè)序接頭；用AMPure XP磁珠對(duì)文庫進(jìn)行片段大小篩選；通過PCR富集得到cDNA文庫。文庫構(gòu)建完成后，使用Qubit 2.0以及Agilent Bioanalyzer 2100對(duì)文庫的濃度和插入片段大小進(jìn)行檢測(cè)。

1.5 測(cè)序、數(shù)據(jù)處理以及功能預(yù)測(cè)分析

檢驗(yàn)合格的文庫在cBot Cluster生成系統(tǒng)上進(jìn)行簇的生成，用Illumina HiSeqTM2500上機(jī)測(cè)序，測(cè)序長(zhǎng)度為PE100。利用TopHat2序列比對(duì)軟件將測(cè)序讀長(zhǎng)(reads)與參考基因組進(jìn)行比對(duì)[8]，生成成對(duì)的端讀。之后進(jìn)行插入片段長(zhǎng)度檢驗(yàn)、隨機(jī)性檢驗(yàn)等測(cè)序文庫質(zhì)量評(píng)估、表達(dá)量分析、新基因發(fā)掘和基因結(jié)構(gòu)優(yōu)化等。根據(jù)Reference genome對(duì)完全匹配或1個(gè)不匹配的序列進(jìn)行分析和注釋，采用Hisat2工具軟件繪制參考基因組?；谝韵聰?shù)據(jù)庫對(duì)基因功能進(jìn)行注釋：Nr、Nt、Pfam、KOG/COG、Swiss-Prot、KEGG和GO。根據(jù)基因在不同樣本中的表達(dá)量進(jìn)行差異表達(dá)分析、差異表達(dá)基因功能注釋和功能富集等生物信息學(xué)分析。

1.6 相對(duì)熒光定量PCR驗(yàn)證

根據(jù)睪丸轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，隨機(jī)挑選6個(gè)基因進(jìn)行相對(duì)熒光定量PCR驗(yàn)證。PCR驗(yàn)證所使用的cDNA模板均由轉(zhuǎn)錄組測(cè)序使用的剩余的RNA樣本反轉(zhuǎn)錄而來，以減少試驗(yàn)誤差。試驗(yàn)采用三步法進(jìn)行相對(duì)熒光定量PCR反應(yīng)，采用2-△△Ct法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量，即試驗(yàn)組的目的基因相對(duì)于對(duì)照組的表達(dá)量。引物序列見表2。

表2 引物序列

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件Student’st檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 雞睪丸RNA質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果

由表3可知，所測(cè)各樣本RNA濃度≥802.3 ng/μL，RNA總量≥20.1 μg，RNA完整值(RIN)≥7.00，且1.98≤OD260 nm/OD280 nm≤2.08。因此，各樣本檢測(cè)結(jié)果均為合格，質(zhì)量滿足建庫要求。利用AMPure XP磁珠評(píng)估RNA片段大小，各樣本均在18S和28S時(shí)峰值較高，且沒有殘缺部分，質(zhì)量符合要求，可進(jìn)行后續(xù)上機(jī)操作。

表3 雞睪丸RNA質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果

2.2 測(cè)序質(zhì)量控制結(jié)果

由表4可知，經(jīng)過嚴(yán)格的篩選和控制后總共得到100.28 Gbp高質(zhì)量reads堿基總數(shù)，所有樣本的堿基質(zhì)量值≥30的堿基百分比(Q30)均≥95.20%，且平均每個(gè)樣本得到28 055 741個(gè)高質(zhì)量reads。

表4 測(cè)序質(zhì)量控制結(jié)果

2.3 比對(duì)效率統(tǒng)計(jì)結(jié)果

由表5可知，各樣本的reads與參考基因組序列的比對(duì)效率為89.78%～90.96%，與參考基因組唯一對(duì)應(yīng)位置的比對(duì)效率為85.16%～86.45%，與參考基因組多處對(duì)應(yīng)位置的比對(duì)效率在4.42%～4.67%。

表5 比對(duì)效率統(tǒng)計(jì)結(jié)果

2.4 差異表達(dá)基因分析結(jié)果

如圖1所示，通過對(duì)所有基因挖掘分析，發(fā)現(xiàn)2組中基因重復(fù)性表達(dá)程度很高，有12 934個(gè)基因在2組中共同表達(dá)，僅有少數(shù)基因在各組中單獨(dú)表達(dá)，其中對(duì)照組中單獨(dú)表達(dá)的基因數(shù)有570個(gè)，試驗(yàn)組中單獨(dú)表達(dá)的基因數(shù)有587個(gè)。結(jié)果說明2組中睪丸組織樣本的基因表達(dá)保守，可以對(duì)重復(fù)性表達(dá)的基因進(jìn)行差異表達(dá)分析。

圖1 表達(dá)基因集維恩圖

2.5 基因表達(dá)量總體分布

基于所選參考基因組序列，對(duì)照組中平均比對(duì)到的對(duì)應(yīng)讀長(zhǎng)(mapped reads)個(gè)數(shù)為49 406 641個(gè)，試驗(yàn)組中平均比對(duì)到的mapped reads個(gè)數(shù)為52 085 792個(gè)，總共挖掘到新基因的個(gè)數(shù)為14 212個(gè)。如圖2所示，各樣本的FPKM(每一百萬個(gè)比對(duì)上參考基因組的reads中映射到外顯子的每一千個(gè)堿基上的fragment個(gè)數(shù))值主要集中在0.1～1.0，且每個(gè)樣本基因表達(dá)量的總體分布大致相同。

GL0-1～GL0-6為對(duì)照組樣本，GL1-1～GL1-6為試驗(yàn)組樣本。

2.6 差異表達(dá)基因篩選

基因顯著差異表達(dá)的條件為差異表達(dá)倍數(shù)(用|log2FC|表示)>1且P<0.05。結(jié)果表明，在2組睪丸組織樣本中總共挖掘出111個(gè)顯著差異表達(dá)基因，包括55個(gè)上調(diào)基因和56個(gè)下調(diào)基因。在這些差異表達(dá)的基因中，上調(diào)差異表達(dá)倍數(shù)最大的基因是微管蛋白alpha-8鏈(TUBA8A)，下調(diào)差異表達(dá)倍數(shù)最大的基因是鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅳ樣(CAMK4L)(圖3)。

圖3 差異表達(dá)基因火山圖

2.7 差異表達(dá)基因功能注釋結(jié)果

由表6可知，通過比對(duì)共注釋到86個(gè)篩選差異表達(dá)基因，其中在GO功能數(shù)據(jù)庫中注釋到的篩選差異表達(dá)基因數(shù)目為45個(gè)，在KEGG功能數(shù)據(jù)庫中注釋到的篩選差異表達(dá)基因數(shù)目為36個(gè)。

表6 差異表達(dá)基因功能注釋

2.8 差異表達(dá)基因的GO功能分析結(jié)果

GO功能數(shù)據(jù)庫主要?jiǎng)澐譃?類：生物學(xué)過程、細(xì)胞組分和分子功能。將注釋到的差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能富集分析，發(fā)現(xiàn)基因可能通過調(diào)控細(xì)胞過程、單生物過程、生物調(diào)節(jié)、代謝過程、細(xì)胞成分組織或生物發(fā)生、多細(xì)胞生物過程、定位、發(fā)展歷程、細(xì)胞、細(xì)胞組成、細(xì)胞器、膜、細(xì)胞器組成、高分子配合物、膜封閉腔、超分子配合物、結(jié)合、催化活性和結(jié)構(gòu)分子活性等生物學(xué)過程來調(diào)控種公雞的繁殖能力(表7)。

表7 差異表達(dá)基因的GO功能分析

2.9 差異表達(dá)基因的KEGG通路分析結(jié)果

將注釋到的差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG通路分析，發(fā)現(xiàn)吞噬體(phagosome)通路為富集程度最高的一條通路(表8)。

表8 差異表達(dá)基因的KEGG通路分析

distribution of samples

2.10 相對(duì)熒光定量PCR驗(yàn)證結(jié)果

通過相對(duì)熒光定量PCR對(duì)選取的6個(gè)基因蛋白質(zhì)chibby同源物1(CBY1)、TUBA8A、ADP核糖基轉(zhuǎn)移酶4(ART4)、鈣周期蛋白結(jié)合蛋白(CACYBP)、腺苷酸激酶7(AK7)和線粒體核糖體蛋白L17(MRPL17)進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明，相對(duì)熒光定量PCR結(jié)果與睪丸組織轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果表達(dá)趨勢(shì)相似，證明了睪丸組織轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果的可靠性，可以用于后續(xù)分析使用(圖4)。

CBY1：蛋白質(zhì)chibby同源物1 protein chibby homolog 1；TUBA8A：微管蛋白alpha-8鏈 tubulin alpha-8 chain；ART4：ADP核糖基轉(zhuǎn)移酶4 ADP-ribosyltransferase 4；CACYBP：鈣周期蛋白結(jié)合蛋白 calcyclin binding protein；AK7：腺苷酸激酶7 adenylate kinase 7；MRPL17：線粒體核糖體蛋白L17 mitochondrial ribosomal protein L17。

3 討 論

本課題組前期通過比較了飼糧添加不同水平硒代蛋氨酸(0、0.25、0.50、1.00和2.00 mg/kg)對(duì)種公雞繁殖性能的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)飼糧添加1.00 mg/kg硒代蛋氨酸能夠提高種公雞的繁殖性能和血漿中生殖激素的含量[7]。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，飼糧添加1 mg/kg硒代蛋氨酸能夠顯著提高種公雞精子密度、精子活率以及精子活力，且能夠顯著提高精漿中谷胱甘肽過氧化物酶和超氧化物歧化酶活性[9]。本試驗(yàn)選用378日齡羅曼褐種公雞為研究對(duì)象，平均分為2組，對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗(yàn)組在基礎(chǔ)飼糧中添加硒水平為1 mg/kg的硒代蛋氨酸。通過對(duì)2組種公雞的睪丸組織樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，挖掘與繁殖性狀相關(guān)的差異表達(dá)基因并對(duì)其功能進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。高通量測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性依賴于堿基質(zhì)量值和測(cè)序獲得reads的數(shù)量和質(zhì)量。本試驗(yàn)中，所有樣本堿基質(zhì)量值Q30均≥95.20%，平均每個(gè)樣本得到reads數(shù)量為28 055 741個(gè)，說明所選參考基因能夠滿足后續(xù)分析要求。結(jié)合GO功能數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)與繁殖性狀相關(guān)的分類，如細(xì)胞過程、單生物過程、生物調(diào)節(jié)、代謝過程、細(xì)胞成分組織或生物發(fā)生等，參與其中的基因有CBY1、ART4、AK7、TUBA8A、MRPL17和CACYBP等。

CBY1基因位于成熟的中心粒中，是纖毛基底體的組成成分，能夠促進(jìn)原發(fā)纖毛的形成，并通過β-連環(huán)蛋白直接調(diào)控拮抗Wnt的典型信號(hào)[9-10]。研究表明，硒能夠維持精細(xì)胞結(jié)構(gòu)和機(jī)能完整性并對(duì)精細(xì)胞的成熟和發(fā)育具有關(guān)鍵作用[11]。本試驗(yàn)中，CBY1基因表達(dá)呈顯著上調(diào)，可能通過降低纖毛病的發(fā)生，進(jìn)而提高種公雞繁殖性能。ART4參與蛋白質(zhì)ADP糖基化，對(duì)DNA的修復(fù)損傷發(fā)揮著重要作用，能降低染色體重排或細(xì)胞死亡的發(fā)生[12-13]。研究表明，雞體內(nèi)ART4含有與精氨酸特異性的活性位點(diǎn)基序相對(duì)應(yīng)的殘基[12,14]，ART4能夠提高精氨酸特異性酶活性[9]。精氨酸是精子蛋白的重要組成，具有增加精液品質(zhì)的作用[15-16]。本課題組前期研究結(jié)果表明，飼糧添加1 mg/kg硒代蛋氨酸能夠提高種公雞精子密度、活力和活率。本試驗(yàn)中，ART4基因表達(dá)呈顯著上調(diào)，可能是由于硒代蛋氨酸通過修復(fù)DNA損傷和提高精氨酸特異性酶活性進(jìn)而提高種公雞精液品質(zhì)[17]。

AK7在睪丸和纖毛組織中強(qiáng)烈表達(dá)且與纖毛、鞭毛的結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)[18-20]。研究發(fā)現(xiàn)，原發(fā)性纖毛運(yùn)動(dòng)障礙(PCD)患者的AK7表達(dá)水平低于健康受試者，并且這種基因的沉默導(dǎo)致纖毛活性顯著降低[20]。AK7基因缺失造成小鼠PCD，纖毛超微結(jié)構(gòu)缺陷以及精子發(fā)生異常[18,21]。本試驗(yàn)中，飼糧添加1 mg/kg硒代蛋氨酸使得AK7基因表達(dá)顯著下調(diào)，這可能是由于飼糧中添加有機(jī)硒提高了組織中谷胱甘肽過氧化物酶和超氧化物歧化酶活性，降低了由于氧化損傷造成的原發(fā)性纖毛運(yùn)動(dòng)障礙，導(dǎo)致AK7表達(dá)量下降。

TUBA8A屬于α-微管蛋白，是參與構(gòu)成微管的主要蛋白質(zhì)。微管參與細(xì)胞骨架的動(dòng)態(tài)組成部分，對(duì)神經(jīng)元的形態(tài)、功能和存活至關(guān)重要[22]；其雙螺旋結(jié)構(gòu)具有保持細(xì)胞內(nèi)部穩(wěn)定、外部形態(tài)正常的功能[23-24]。研究表明，硒能夠維持精細(xì)胞結(jié)構(gòu)和機(jī)能完整性[11]。本試驗(yàn)中，飼糧添加1 mg/kg硒代蛋氨酸使得TUBA8A基因表達(dá)呈顯著上調(diào)，這表明硒代蛋氨酸可通過維持精子細(xì)胞的正常生理形態(tài)，以及在線粒體定位和細(xì)胞減數(shù)分裂過程中發(fā)揮重要作用來提高種公雞繁殖性能。

MRPL17參與構(gòu)成核糖體，具有促進(jìn)線粒體內(nèi)熱休克蛋白60合成的作用[25]。研究表明，熱休克蛋白60可參與精子的生成過程，熱休克蛋白60的表達(dá)不僅受精原細(xì)胞有絲分裂過程中活性強(qiáng)弱的影響而且與線粒體活性和種類也相關(guān)[26]。Dorji等[27]研究表明，MRPL17調(diào)控線粒體核糖體蛋白表達(dá)，MRPL17表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)與發(fā)育能力有關(guān)的線粒體功能[28-29]。本試驗(yàn)中，MRPL17基因表達(dá)量呈顯著下調(diào)，可能是由于飼糧添加硒代蛋氨酸提高了機(jī)體內(nèi)抗氧化水平，減少了精子線粒體的氧化損傷，從而導(dǎo)致MRPL17表達(dá)量下降。

CACYBP是一種參與β-連環(huán)蛋白降解的鈣信號(hào)蛋白[30-31]，其表達(dá)受孕酮和β-雌二醇的正調(diào)控。CACYBP可能參與了妊娠早期子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡的調(diào)控，并在小鼠子宮內(nèi)膜中發(fā)揮重要的作用，如妊娠期建立等過程[32]。Matsuzawa等[33]研究指出，細(xì)胞周期隨CACYBP表達(dá)的變化而發(fā)生改變，當(dāng)機(jī)體內(nèi)CACYBP表達(dá)量下降時(shí)，β-連環(huán)蛋白降解程度減弱，大量的β-連環(huán)蛋白進(jìn)入細(xì)胞核，與T細(xì)胞因子/淋巴增強(qiáng)因子轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生生物學(xué)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞增殖；若抑制Ebi基因的生理功能且促進(jìn)p53基因的表達(dá)會(huì)引起S期和G2或M期的細(xì)胞數(shù)量增多和凋亡細(xì)胞數(shù)量降低的現(xiàn)象，但關(guān)于CACYBP調(diào)控細(xì)胞周期的具體原理尚待研究。CACYBP也能夠與微管蛋白相結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞骨架的重組[34]。本試驗(yàn)中，CACYBP基因表達(dá)量呈顯著上升，這表明飼糧添加硒代蛋氨酸能夠通過提高CACYBP基因表達(dá)量，維持精子細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，減少精子細(xì)胞凋亡，從而提高精液品質(zhì)。

4 結(jié) 論

① 飼糧添加1 mg/kg硒代蛋氨酸后，對(duì)照組和硒代蛋氨酸組種公雞睪丸差異表達(dá)基因共有111個(gè)，其中有55個(gè)上調(diào)基因和56個(gè)下調(diào)基因。

②CBY1、ART4、AK7、TUBA8A、MRPL17和CACYBP等基因可作為研究種公雞繁殖性能的候選基因并進(jìn)行進(jìn)一步地研究和探討。

③ 從差異表達(dá)基因GO功能分類注釋結(jié)果看，細(xì)胞過程、單生物過程、生物調(diào)節(jié)、代謝過程和細(xì)胞成分組織等顯著富集基因都與提高繁殖性能相關(guān)。