衡 諾 馬 鑫 郭 勇 齊曉龍* 盛熙暉 王相國 邢 凱 肖龍菲 陳 余 王 梁 倪和民

(1.北京農學院動物科學技術學院，北京 102206；2.北京市畜牧總站，北京 100107)

硒是動物體內的必需微量元素，影響動物的繁殖力和生產力[1]。研究表明，硒是生物體內谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的活性中心，其抗氧化作用可消除因自由基造成的氧化損傷，保護體內細胞的正常生理功能，從而改善動物繁殖性能[2]。目前，關于有機硒對種公畜禽繁殖性能的影響主要集中在對精子活力的研究上，但對于有機硒組和不添加硒組間的睪丸組織轉錄組測序方面的研究鮮有報道[3-4]。飼糧中添加適量的硒可以增強畜禽繁殖性能，然而關于有機硒是否能夠調控分子層面進而增強其繁殖性能尚不明確[5-6]。本課題組前期通過比較飼糧中添加不同水平的硒代蛋氨酸對種公雞繁殖性能的影響，發(fā)現(xiàn)飼糧中添加硒水平為1 mg/kg的硒代蛋氨酸能提高種公雞的繁殖性能，且血漿中生殖激素含量最高[7]。本試驗以此為基礎，選用378日齡蛋用種公雞為研究對象，通過轉錄組測序的方法，挖掘種公雞睪丸組織中顯著差異表達的基因并對其功能進行預測分析，旨在探討硒提高種公雞繁殖能力的作用機制，為后續(xù)提高種公雞繁殖性能的營養(yǎng)調控提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和基礎飼糧

選取120只378日齡健康、體況一致的羅曼褐蛋用種公雞為試驗動物。所用硒代蛋氨酸中硒的含量是0.2%?；A飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)

1.2 試驗設計

本試驗采用單因素試驗設計，將120只種公雞隨機分為2個組，每組6個重復，每個重復10只雞。對照組飼喂基礎飼糧，試驗組在基礎飼糧中添加硒水平為1 mg/kg的硒代蛋氨酸。試驗預試期1周，正試期4周。試驗用種公雞均采用單籠飼養(yǎng)，自由采食和飲水，光照采用每天13 h光照和11 h黑暗。

1.3 睪丸樣本采集和總RNA提取

試驗期末，每個重復任選取1只種公雞，參照動物福利對其處死后取出左側睪丸，減去附睪并剝離睪丸質膜，分裝于1.5 mL的離心管中，在-80 ℃冰箱內保存，用于轉錄組測序。睪丸組織采用Trizol法，按照總RNA提取試劑盒說明書進行操作，操作過程中所有直接接觸樣本的設備均采用紫外光照30 min以上。采用微量紫外分光光度計(Nanodrop 2000)計算出提取的RNA濃度及260和280 nm的吸光度(OD)值(OD260 nm/OD280 nm讀數(shù)在1.8～2.2時表明RNA質量最好)，使用Agilent Bioanalyzer 2100系統(tǒng)的RNA 6000 Nano分析試劑盒來評估RNA樣本的完整性。測定完畢后，將剩余的RNA樣本進行分裝，編號置于-80 ℃冷藏，之后將睪丸組織樣本送于北京百邁客生物科技有限公司進行睪丸轉錄組測序。

1.4 轉錄組測序的文庫準備

RNA樣本檢測合格后，進行文庫構建，主要流程如下：用多聚T寡糖磁珠富集真核生物mRNA，將mRNA隨機打斷并以mRNA為模板，用六堿基隨機引物生成第1條cDNA；隨后加入緩沖液、DNA聚合酶Ⅰ(DNA polymerase Ⅰ)、核糖核酸酶H(RNase H)和核苷三磷酸(dNTPs)生成第2條cDNA；利用AMPure XP磁珠純化cDNA后對cDNA進行末端修復，加A尾并連接測序接頭；用AMPure XP磁珠對文庫進行片段大小篩選；通過PCR富集得到cDNA文庫。文庫構建完成后，使用Qubit 2.0以及Agilent Bioanalyzer 2100對文庫的濃度和插入片段大小進行檢測。

1.5 測序、數(shù)據處理以及功能預測分析

檢驗合格的文庫在cBot Cluster生成系統(tǒng)上進行簇的生成，用Illumina HiSeqTM2500上機測序，測序長度為PE100。利用TopHat2序列比對軟件將測序讀長(reads)與參考基因組進行比對[8]，生成成對的端讀。之后進行插入片段長度檢驗、隨機性檢驗等測序文庫質量評估、表達量分析、新基因發(fā)掘和基因結構優(yōu)化等。根據Reference genome對完全匹配或1個不匹配的序列進行分析和注釋，采用Hisat2工具軟件繪制參考基因組。基于以下數(shù)據庫對基因功能進行注釋：Nr、Nt、Pfam、KOG/COG、Swiss-Prot、KEGG和GO。根據基因在不同樣本中的表達量進行差異表達分析、差異表達基因功能注釋和功能富集等生物信息學分析。

1.6 相對熒光定量PCR驗證

根據睪丸轉錄組測序結果，隨機挑選6個基因進行相對熒光定量PCR驗證。PCR驗證所使用的cDNA模板均由轉錄組測序使用的剩余的RNA樣本反轉錄而來，以減少試驗誤差。試驗采用三步法進行相對熒光定量PCR反應，采用2-△△Ct法計算目的基因的相對表達量，即試驗組的目的基因相對于對照組的表達量。引物序列見表2。

表2 引物序列

1.7 數(shù)據統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據采用SPSS 20.0軟件Student’st檢驗進行統(tǒng)計分析，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 雞睪丸RNA質量檢測結果

由表3可知，所測各樣本RNA濃度≥802.3 ng/μL，RNA總量≥20.1 μg，RNA完整值(RIN)≥7.00，且1.98≤OD260 nm/OD280 nm≤2.08。因此，各樣本檢測結果均為合格，質量滿足建庫要求。利用AMPure XP磁珠評估RNA片段大小，各樣本均在18S和28S時峰值較高，且沒有殘缺部分，質量符合要求，可進行后續(xù)上機操作。

表3 雞睪丸RNA質量檢測結果

2.2 測序質量控制結果

由表4可知，經過嚴格的篩選和控制后總共得到100.28 Gbp高質量reads堿基總數(shù)，所有樣本的堿基質量值≥30的堿基百分比(Q30)均≥95.20%，且平均每個樣本得到28 055 741個高質量reads。

表4 測序質量控制結果

2.3 比對效率統(tǒng)計結果

由表5可知，各樣本的reads與參考基因組序列的比對效率為89.78%～90.96%，與參考基因組唯一對應位置的比對效率為85.16%～86.45%，與參考基因組多處對應位置的比對效率在4.42%～4.67%。

表5 比對效率統(tǒng)計結果

2.4 差異表達基因分析結果

如圖1所示，通過對所有基因挖掘分析，發(fā)現(xiàn)2組中基因重復性表達程度很高，有12 934個基因在2組中共同表達，僅有少數(shù)基因在各組中單獨表達，其中對照組中單獨表達的基因數(shù)有570個，試驗組中單獨表達的基因數(shù)有587個。結果說明2組中睪丸組織樣本的基因表達保守，可以對重復性表達的基因進行差異表達分析。

圖1 表達基因集維恩圖

2.5 基因表達量總體分布

基于所選參考基因組序列，對照組中平均比對到的對應讀長(mapped reads)個數(shù)為49 406 641個，試驗組中平均比對到的mapped reads個數(shù)為52 085 792個，總共挖掘到新基因的個數(shù)為14 212個。如圖2所示，各樣本的FPKM(每一百萬個比對上參考基因組的reads中映射到外顯子的每一千個堿基上的fragment個數(shù))值主要集中在0.1～1.0，且每個樣本基因表達量的總體分布大致相同。

GL0-1～GL0-6為對照組樣本，GL1-1～GL1-6為試驗組樣本。

2.6 差異表達基因篩選

基因顯著差異表達的條件為差異表達倍數(shù)(用|log2FC|表示)>1且P<0.05。結果表明，在2組睪丸組織樣本中總共挖掘出111個顯著差異表達基因，包括55個上調基因和56個下調基因。在這些差異表達的基因中，上調差異表達倍數(shù)最大的基因是微管蛋白alpha-8鏈(TUBA8A)，下調差異表達倍數(shù)最大的基因是鈣/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶Ⅳ樣(CAMK4L)(圖3)。

圖3 差異表達基因火山圖

2.7 差異表達基因功能注釋結果

由表6可知，通過比對共注釋到86個篩選差異表達基因，其中在GO功能數(shù)據庫中注釋到的篩選差異表達基因數(shù)目為45個，在KEGG功能數(shù)據庫中注釋到的篩選差異表達基因數(shù)目為36個。

表6 差異表達基因功能注釋

2.8 差異表達基因的GO功能分析結果

GO功能數(shù)據庫主要劃分為3類：生物學過程、細胞組分和分子功能。將注釋到的差異表達基因進行GO功能富集分析，發(fā)現(xiàn)基因可能通過調控細胞過程、單生物過程、生物調節(jié)、代謝過程、細胞成分組織或生物發(fā)生、多細胞生物過程、定位、發(fā)展歷程、細胞、細胞組成、細胞器、膜、細胞器組成、高分子配合物、膜封閉腔、超分子配合物、結合、催化活性和結構分子活性等生物學過程來調控種公雞的繁殖能力(表7)。

表7 差異表達基因的GO功能分析

2.9 差異表達基因的KEGG通路分析結果

將注釋到的差異表達基因進行KEGG通路分析，發(fā)現(xiàn)吞噬體(phagosome)通路為富集程度最高的一條通路(表8)。

表8 差異表達基因的KEGG通路分析

distribution of samples

2.10 相對熒光定量PCR驗證結果

通過相對熒光定量PCR對選取的6個基因蛋白質chibby同源物1(CBY1)、TUBA8A、ADP核糖基轉移酶4(ART4)、鈣周期蛋白結合蛋白(CACYBP)、腺苷酸激酶7(AK7)和線粒體核糖體蛋白L17(MRPL17)進行驗證。結果表明，相對熒光定量PCR結果與睪丸組織轉錄組測序結果表達趨勢相似，證明了睪丸組織轉錄組測序結果的可靠性，可以用于后續(xù)分析使用(圖4)。

CBY1：蛋白質chibby同源物1 protein chibby homolog 1；TUBA8A：微管蛋白alpha-8鏈 tubulin alpha-8 chain；ART4：ADP核糖基轉移酶4 ADP-ribosyltransferase 4；CACYBP：鈣周期蛋白結合蛋白 calcyclin binding protein；AK7：腺苷酸激酶7 adenylate kinase 7；MRPL17：線粒體核糖體蛋白L17 mitochondrial ribosomal protein L17。

3 討 論

本課題組前期通過比較了飼糧添加不同水平硒代蛋氨酸(0、0.25、0.50、1.00和2.00 mg/kg)對種公雞繁殖性能的影響，結果發(fā)現(xiàn)飼糧添加1.00 mg/kg硒代蛋氨酸能夠提高種公雞的繁殖性能和血漿中生殖激素的含量[7]。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，飼糧添加1 mg/kg硒代蛋氨酸能夠顯著提高種公雞精子密度、精子活率以及精子活力，且能夠顯著提高精漿中谷胱甘肽過氧化物酶和超氧化物歧化酶活性[9]。本試驗選用378日齡羅曼褐種公雞為研究對象，平均分為2組，對照組飼喂基礎飼糧，試驗組在基礎飼糧中添加硒水平為1 mg/kg的硒代蛋氨酸。通過對2組種公雞的睪丸組織樣本進行轉錄組測序，挖掘與繁殖性狀相關的差異表達基因并對其功能進行預測分析。高通量測序結果的準確性依賴于堿基質量值和測序獲得reads的數(shù)量和質量。本試驗中，所有樣本堿基質量值Q30均≥95.20%，平均每個樣本得到reads數(shù)量為28 055 741個，說明所選參考基因能夠滿足后續(xù)分析要求。結合GO功能數(shù)據庫進行比對，發(fā)現(xiàn)與繁殖性狀相關的分類，如細胞過程、單生物過程、生物調節(jié)、代謝過程、細胞成分組織或生物發(fā)生等，參與其中的基因有CBY1、ART4、AK7、TUBA8A、MRPL17和CACYBP等。

CBY1基因位于成熟的中心粒中，是纖毛基底體的組成成分，能夠促進原發(fā)纖毛的形成，并通過β-連環(huán)蛋白直接調控拮抗Wnt的典型信號[9-10]。研究表明，硒能夠維持精細胞結構和機能完整性并對精細胞的成熟和發(fā)育具有關鍵作用[11]。本試驗中，CBY1基因表達呈顯著上調，可能通過降低纖毛病的發(fā)生，進而提高種公雞繁殖性能。ART4參與蛋白質ADP糖基化，對DNA的修復損傷發(fā)揮著重要作用，能降低染色體重排或細胞死亡的發(fā)生[12-13]。研究表明，雞體內ART4含有與精氨酸特異性的活性位點基序相對應的殘基[12,14]，ART4能夠提高精氨酸特異性酶活性[9]。精氨酸是精子蛋白的重要組成，具有增加精液品質的作用[15-16]。本課題組前期研究結果表明，飼糧添加1 mg/kg硒代蛋氨酸能夠提高種公雞精子密度、活力和活率。本試驗中，ART4基因表達呈顯著上調，可能是由于硒代蛋氨酸通過修復DNA損傷和提高精氨酸特異性酶活性進而提高種公雞精液品質[17]。

AK7在睪丸和纖毛組織中強烈表達且與纖毛、鞭毛的結構和功能相關[18-20]。研究發(fā)現(xiàn)，原發(fā)性纖毛運動障礙(PCD)患者的AK7表達水平低于健康受試者，并且這種基因的沉默導致纖毛活性顯著降低[20]。AK7基因缺失造成小鼠PCD，纖毛超微結構缺陷以及精子發(fā)生異常[18,21]。本試驗中，飼糧添加1 mg/kg硒代蛋氨酸使得AK7基因表達顯著下調，這可能是由于飼糧中添加有機硒提高了組織中谷胱甘肽過氧化物酶和超氧化物歧化酶活性，降低了由于氧化損傷造成的原發(fā)性纖毛運動障礙，導致AK7表達量下降。

TUBA8A屬于α-微管蛋白，是參與構成微管的主要蛋白質。微管參與細胞骨架的動態(tài)組成部分，對神經元的形態(tài)、功能和存活至關重要[22]；其雙螺旋結構具有保持細胞內部穩(wěn)定、外部形態(tài)正常的功能[23-24]。研究表明，硒能夠維持精細胞結構和機能完整性[11]。本試驗中，飼糧添加1 mg/kg硒代蛋氨酸使得TUBA8A基因表達呈顯著上調，這表明硒代蛋氨酸可通過維持精子細胞的正常生理形態(tài)，以及在線粒體定位和細胞減數(shù)分裂過程中發(fā)揮重要作用來提高種公雞繁殖性能。

MRPL17參與構成核糖體，具有促進線粒體內熱休克蛋白60合成的作用[25]。研究表明，熱休克蛋白60可參與精子的生成過程，熱休克蛋白60的表達不僅受精原細胞有絲分裂過程中活性強弱的影響而且與線粒體活性和種類也相關[26]。Dorji等[27]研究表明，MRPL17調控線粒體核糖體蛋白表達，MRPL17表達上調可促進與發(fā)育能力有關的線粒體功能[28-29]。本試驗中，MRPL17基因表達量呈顯著下調，可能是由于飼糧添加硒代蛋氨酸提高了機體內抗氧化水平，減少了精子線粒體的氧化損傷，從而導致MRPL17表達量下降。

CACYBP是一種參與β-連環(huán)蛋白降解的鈣信號蛋白[30-31]，其表達受孕酮和β-雌二醇的正調控。CACYBP可能參與了妊娠早期子宮內膜細胞凋亡的調控，并在小鼠子宮內膜中發(fā)揮重要的作用，如妊娠期建立等過程[32]。Matsuzawa等[33]研究指出，細胞周期隨CACYBP表達的變化而發(fā)生改變，當機體內CACYBP表達量下降時，β-連環(huán)蛋白降解程度減弱，大量的β-連環(huán)蛋白進入細胞核，與T細胞因子/淋巴增強因子轉錄因子發(fā)生生物學反應，誘導細胞增殖；若抑制Ebi基因的生理功能且促進p53基因的表達會引起S期和G2或M期的細胞數(shù)量增多和凋亡細胞數(shù)量降低的現(xiàn)象，但關于CACYBP調控細胞周期的具體原理尚待研究。CACYBP也能夠與微管蛋白相結合，促進細胞骨架的重組[34]。本試驗中，CACYBP基因表達量呈顯著上升，這表明飼糧添加硒代蛋氨酸能夠通過提高CACYBP基因表達量，維持精子細胞穩(wěn)態(tài)，減少精子細胞凋亡，從而提高精液品質。

4 結 論

① 飼糧添加1 mg/kg硒代蛋氨酸后，對照組和硒代蛋氨酸組種公雞睪丸差異表達基因共有111個，其中有55個上調基因和56個下調基因。

②CBY1、ART4、AK7、TUBA8A、MRPL17和CACYBP等基因可作為研究種公雞繁殖性能的候選基因并進行進一步地研究和探討。

③ 從差異表達基因GO功能分類注釋結果看，細胞過程、單生物過程、生物調節(jié)、代謝過程和細胞成分組織等顯著富集基因都與提高繁殖性能相關。