王 婧 李光燃 肖玉欣 鄧遠坤 唐宇龍 譚碧娥

(湖南農業(yè)大學動物科學技術學院，長沙 410128)

腸黏膜上皮細胞終身不斷自我更新，其增殖和分化是一個動態(tài)變化的過程，新生的上皮細胞沿著隱窩絨毛軸向上遷移，從未分化的細胞到活躍增殖的隱窩細胞，直到成熟的具有吸收功能的絨毛上皮細胞[1]。前期研究證明，仔豬腸道黏膜氨基酸的利用，在黏膜代謝和損傷修復中具有關鍵作用[2-9]。多胺(腐胺、亞精胺和精胺)及其主要前體物質(精氨酸、谷氨酰胺和脯氨酸等)在仔豬腸道黏膜細胞增殖分化和損傷修復中發(fā)揮重要的作用[2，6-9]。多胺與DNA、RNA以及蛋白質的生物代謝有關，在細胞分化、細胞周期的調節(jié)中起關鍵作用；對新生仔豬細胞增殖和分化至關重要，是小腸黏膜生長、發(fā)育、成熟所必需的物質[10]，可促進腸腺隱窩細胞的增殖、分化和移行，促進腸黏膜的損傷修復[11]。仔豬腸道多胺代謝與腸黏膜的生長密切相關，可作為腸道損傷修復的指征[12]。但是，多胺作為氨基酸的代謝產物，如何被腸黏膜感應利用從而調控黏膜增殖的機制尚不清楚。

研究表明，氨基酸轉運載體不僅具有轉運氨基酸的功能，并且可以通過感受細胞內外氨基酸含量等環(huán)境變化對胞內一系列代謝活動進行調節(jié)[12-13]。某些氨基酸轉運載體能通過轉運過程調節(jié)細胞內氨基酸含量，從而調控細胞內氨基酸感受體下游信號，發(fā)揮氨基酸轉運載體和受體的雙重功能[14-15]。Na+依賴性中性氨基酸轉運載體2(SNAT2)是氨基酸轉運感受體的典型代表，前期已克隆得到豬SNAT2的編碼基因，發(fā)現在仔豬十二指腸、空腸和回腸黏膜中均有表達，而且許多調控多胺代謝的前體氨基酸均能調控SNAT2的表達[16]。進一步證實，SNAT2通過哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路調控腸上皮細胞增殖和蛋白質合成；且抑制SNAT2可改變哺乳動物雷帕霉素靶蛋白C1(mTORC1)的上游調控因子基因的表達[17]。因此，本試驗選用腐胺(多胺的一種)以及能代謝生成多胺的前體物質脯氨酸和N-氨甲酰谷氨酸(NCG)，通過灌服哺乳仔豬，探討其調控SNAT2表達及其營養(yǎng)感應信號通路的作用，以期為仔豬腸道氨基酸利用和健康調控提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

選取遺傳背景相近(精液來源相同)、胎次相同的4窩“杜×長×大”三元雜交仔豬32頭，按照同窩和體重相近的原則配對分成4組，每組8頭豬，從出生當日開始分別灌服同體積生理鹽水(對照組)、腐胺(5 mg/kg BW)、脯氨酸(25 mg/kg BW)和NCG(8 mg/kg BW)，每天2次。腐胺的用量是基于Grant等[18]報道結果，脯氨酸的用量是母乳2倍[19]，NCG的用量是基于Wu等[20]的報道結果。母豬在相同飼養(yǎng)條件下飼喂同一飼糧(玉米-豆粕型基礎飼糧)，仔豬正常哺乳。仔豬14日齡斷奶，飼喂相同的乳豬料，斷奶后3 d，屠宰采樣。

1.2 樣品采集

試驗結束當天早晨空腹，試驗豬稱取體重，頸靜脈處穿刺采血5 mL，靜置30 min后3 000×g離心15 min，分離血清，-80 ℃凍存，待測膽囊收縮素(cholecystokinin，CCK)含量。試豬放血屠宰，分離空腸和回腸，生理鹽水沖洗后，刮取黏膜，迅速放入液氮速凍后，-80 ℃保存，用于游離氨基酸含量檢測以及RNA和蛋白質的提取。

1.3 檢測指標

1.3.1 生長性能測定

試驗開始和結束時，所有試驗豬空腹稱重，計算平均日增重(ADG)。

1.3.2 腸黏膜游離氨基酸含量測定

稱取空腸黏膜組織0.5 g，加入5 mL 0.1 mol/L HCl勻漿，5 000×g離心10 min，取上清液0.5 mL，并加入等體積的8%磺基水楊酸，混勻，4 ℃靜止過夜。12 000×g離心10 min，吸取上清，再次12 000×g離心10 min，取上清過濾膜后用LC-6A型高效液相色譜儀(日本島津公司)測定氨基酸含量。

1.3.3 血清CCK含量測定

血清中CCK含量采用CCK酶聯免疫試劑盒(EIA-CCK-1，RayBiotech)測定。所有試劑在25 ℃室溫下平衡30 min后制備，血清樣品避免反復凍融，按照說明書操作步驟檢測。

1.3.4 mRNA相對表達量測定

采用Trizol試劑(Invitrogen，美國)提取空腸、回腸黏膜樣品中的總RNA。使用無菌、無RNase的DNase Ⅰ(Promega 公司，德國)處理，去除總RNA樣品中存在的痕量基因組DNA。根據逆轉錄試劑盒(TaKaRa公司，大連)說明書進行操作,將RNA逆轉錄為cDNA。根據GenBank中登入的基因序列，依據引物設計原則，采用Primer5.0 軟件進行引物的設計(表1)。引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以反轉錄得到的cDNA作為模板，采用SYBR-Green Ⅰ染料(Molecular Probes，Eugene，OR)法，使用ABI 7900HT-PCR儀(ABI Biotechnology，美國)對樣品進行擴增，并運用配套軟件(Applied Biosystem，SDS2.3)進行數據分析。以最小循環(huán)閾值(Ct)和最高熒光值為標準，分別對循環(huán)條件、退火溫度、引物濃度進行優(yōu)化。分別檢測空腸、回腸黏膜組織中相關基因表達量。

表1 引物序列

1.3.5 蛋白質表達水平測定

采用Western blot檢測空腸和回腸黏膜組織SNAT2蛋白表達水平。取500～1 000 mg空腸和回腸黏膜組織樣品置于放有液氮的研缽中磨碎，裝至放有600 μL蛋白裂解液(RIPA)的1.5 mL離心管中，劇烈振蕩，在4 ℃冰箱中靜置1～2 h，4 ℃、12 000×g離心15 min，取上清。以牛血清蛋白(BSA)為標準品，采用雙氯喹酸法測定蛋白濃度。用5×十二烷基硫酸鈉(SDS)樣品緩沖液稀釋上清液(含組織蛋白)，在沸水中加熱5 min。將溶液冷凍后，采用Western blot檢測空腸和回腸黏膜組織SNAT2蛋白表達水平。以下一抗用于蛋白定量: SNAT2(1∶1 000，Santa Cruz Biotechnology)；β-肌動蛋白(β-actin,1∶1 000，Cell Signaling Technology)。

1.4 數據統(tǒng)計

各基因表達量以β-actin為內參，對獲得的信號、數據進行處理，采用2-ΔΔCt法對定量結果進行計算分析。試驗數據采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件中的單因素方差(ANOVA)分析進行統(tǒng)計，差異顯著者采用Duncan氏法進行多重比較。以P<0.05作為差異顯著性判斷標準，結果用平均值±標準誤表示。

2 結果與分析

3.1 N-氨甲酰谷氨酸、脯氨酸及腐胺對仔豬生長性能的影響

由表2可知，哺乳仔豬初始體重一致，14日齡斷奶3 d后，哺乳期灌服腐胺和脯氨酸的仔豬終末體重顯著高于對照組(P<0.05)。與對照組相比，灌服腐胺、脯氨酸和NCG均顯著提高了仔豬的平均日增重(P<0.05)。

表2 N-氨甲酰谷氨酸、脯氨酸及腐胺對仔豬生長性能的影響

2.2 N-氨甲酰谷氨酸、脯氨酸及腐胺仔豬腸黏膜游離氨基酸含量的影響

由表3可知，與對照組相比，腐胺組仔豬空腸黏膜精氨酸含量顯著降低(P<0.05)；NCG組仔豬空腸黏膜精氨酸含量顯著升高(P<0.05)；此外，灌服脯氨酸和NCG顯著降低了空腸黏膜丙氨酸含量(P<0.05)。

表3 N-氨甲酰谷氨酸、脯氨酸及腐胺對仔豬空腸黏膜游離氨基酸含量的影響

2.3 N-氨甲酰谷氨酸、脯氨酸及腐胺對仔豬腸道SNAT2 mRNA相對表達量和蛋白表達水平的影響

由圖1和圖2可知，與對照組相比，哺乳期灌服NCG顯著提高了斷奶后第3天仔豬回腸黏膜SNAT2 mRNA相對表達量(P<0.05)；灌服腐胺和NCG均顯著提高了空腸和回腸黏膜SNAT2蛋白表達水平(P<0.05)，但灌服脯氨酸顯著降低了空腸和回腸黏膜SNAT2蛋白表達水平(P<0.05)。

數據柱標注不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下同圖。

圖2 N-氨甲酰谷氨酸、脯氨酸及腐胺對仔豬小腸黏膜SNAT2蛋白表達水平的影響

2.4 N-氨甲酰谷氨酸、脯氨酸及腐胺對仔豬腸道氨基酸轉運感應相關基因mRNA相對表達量的影響

由表4可知，在空腸黏膜中，與對照組相比，灌服脯氨酸和NCG均顯著提高仔豬PAT1、CasR、PLCβ2和T1R3 mRNA相對表達量(P<0.05)；腐胺組PAT1 mRNA相對表達量顯著升高(P<0.05)。

表4 N-氨甲酰谷氨酸、脯氨酸及腐胺對仔豬空腸黏膜氨基酸轉運感應相關基因mRNA相對表達量的影響

由表5可知，在回腸黏膜中，與對照組相比，脯氨酸組和NCG組y+LAT2 mRNA相對表達量顯著降低(P<0.05)，而EAAC1 mRNA相對表達量顯著升高(P<0.05)，腐胺組y+LAT2 mRNA相對表達量顯著降低(P<0.05)，而T1R3 mRNA相對表達量顯著升高(P<0.05)。

表5 N-氨甲酰谷氨酸、脯氨酸及腐胺對仔豬回腸黏膜氨基酸轉運感應相關基因mRNA相對表達量的影響

2.5 N-氨甲酰谷氨酸、脯氨酸及腐胺對仔豬血清CCK含量及小腸黏膜膽囊收縮素受體(CCKR)mRNA相對表達量的影響

由圖3和圖4可知，與對照組相比，NCG組仔豬血清中CCK含量顯著高于脯氨酸組(P<0.05)，且NCG組仔豬空腸黏膜CCKRmRNA相對表達量顯著高于其他各組(P<0.05)。

圖3 N-氨甲酰谷氨酸、脯氨酸及腐胺對仔豬血清中CCK的含量的影響

圖4 N-氨甲酰谷氨酸、脯氨酸及腐胺對仔豬空腸黏膜CCKR mRNA相對表達量的影響

2.6 N-氨甲酰谷氨酸、脯氨酸及腐胺仔豬腸道m(xù)TOR信號通路相關基因mRNA相對表達量的影響

由表6可知，在空腸黏膜中，與對照組相比，哺乳期灌服NCG顯著提高了仔豬MAP4K3和mTOR的mRNA相對表達量(P<0.05)。

表6 N-氨甲酰谷氨酸、脯氨酸及腐胺對仔豬空腸黏膜mTOR信號通路相關基因的mRNA相對表達量的影響

3 討 論

研究表明，多胺對正常生理條件下的腸道上皮細胞完整性的維持具有重要意義；在腸道上皮細胞損傷后，需要多胺作為瞬時能量來源協助修復[21]。雖然母豬初乳中多胺的含量很高，但隨著日齡的增長逐漸降低[22]。因此，外源添加多胺物質對腸道黏膜的生長發(fā)育和修復損傷具有重要作用[21]。精氨酸被認為是多胺合成的主要前體，然而仔豬小腸中精氨酸酶活性較低，不足以催化精氨酸合成充足的多胺[23]。脯氨酸可經鳥氨酸脫羧酶分解代謝生成多胺，且仔豬小腸中鳥氨酸脫羧酶活性較高，故脯氨酸被認為是仔豬腸道多胺合成的主要前體物質[24]。NCG作為N-乙酰谷氨酸的類似物，能促進內源性精氨酸及精氨酸代謝產物的合成，如通過尿素循環(huán)產生多胺[25]。有研究認為，NCG可能有助于克服精氨酸向幼齡動物機體中傳遞的實際限制[26-27]。多胺之間可以互相轉化，腐胺可轉化為精胺和亞精胺[28]。因此，本試驗選用多胺或促進多胺生成的前體物，通過灌服哺乳仔豬，以期提高仔豬腸道氨基酸的利用，促進提早成熟，緩解斷奶應激。多胺調控仔豬腸道發(fā)育的作用在我們已發(fā)表的研究中得到證實[20]。本試驗中，哺乳期灌服腐胺、脯氨酸和NCG均顯著提高了仔豬平均日增重，這與多胺和NCG促進仔豬生長速率的前期研究相符[5,29]，同時下文重點討論的血清氨基酸含量與氨基酸感應信號通路的研究結果也支持這一結論。

首先，灌服NCG顯著增加了仔豬空腸黏膜中精氨酸的含量，同時提高了回腸黏膜SNAT2的mRNA相對表達量；灌服腐胺和NCG顯著提高了空腸和回腸黏膜SNAT2的蛋白表達水平。外源補充NCG能夠促進仔豬內源精氨酸的合成[30]。有研究表明，當增加氨基酸供應時，SNAT2的mRNA及蛋白表達水平以一種依賴mTOR通路的途徑顯著提高[31]，這可能是對于增加的胞內氨基酸轉運壓力的一種適應性機制[32]。但是，脯氨酸作為SNAT2的底物，降低了空腸和回腸黏膜中的SNAT2蛋白表達水平，表現出對SNAT2的抑制作用。這也許與底物和SNAT2轉運Km系數相關[33]。腐胺、脯氨酸和NCG分別上調了空腸PAT1及回腸EAAC1的mRNA相對表達量。PAT1是Na+依賴的亞氨基轉運系統(tǒng)的氨基酸轉運載體，主要負責脯氨酸的轉運[34]。外源補充脯氨酸可提高PAT1的表達[35]。EAAC1則主要是Na+依賴的小腸谷氨酸轉運載體[36]。NCG可調控谷氨酸向精氨酸的代謝，影響谷氨酸的轉運[5, 27]。灌喂脯氨酸并未顯著增加空腸黏膜中脯氨酸的含量，這可能由于脯氨酸進入腸道細胞后直接代謝生成多胺[12]。

此外，CasR和T1R1/T1R3是重要的氨基酸感應受體，屬于哺乳類GPCRs家族[37]。灌服脯氨酸和NCG顯著上調了空腸黏膜中CasR與T1R3的mRNA相對表達量，灌服腐胺顯著上調了回腸黏膜中T1R3的mRNA相對表達量。之前的報道顯示，底物的刺激，如胞外的Ca2+和氨基酸等，可以使得Ca2+感應受體CasR表達上調[38]。T1R1/T1R3作為直接感受機體能量狀態(tài)和胞外氨基酸濃度的感受器，有研究表明基因敲除該感受體后會直接影響氨基酸含量作為信號傳遞到mTORC1的過程[39]。本研究結果提示多胺及其前體氨基酸對CasR和T1R1/T1R3感應受體具有調控作用。并且，NCG與脯氨酸可能通過影響氨基酸含量改變氨基酸感應受體的表達[40]。已有研究表明，L-谷氨酸和L-精氨酸可以通過激活 T1R1/T1R3來提高胰島素的分泌[41-42]。具體機制可能為T1R1/T1R3通過Gg，激活PLCβ2，產生DAG和IP3，IP3與IP3R3結合，使胞內儲存的Ca2+被釋放出來，進而激活TRPM5通道，Na+流入細胞內，最終導致膜去極化和神經遞質釋放[15,32,38]。

轉運載體介導的氨基酸感應機制是其作為生電轉運感受體，誘導膜去極化和激素分泌[42]。氨基酸刺激可以轉換成化學信號，通過轉運載體蛋白構象的改變或氨基酸與轉運載體的簡單結合引起信號傳導[43-44]。感應信號主要通過與味覺受體結合提高胞內游離Ca2+濃度進而引發(fā)神經遞質的釋放[45]。胞外信號也可與G蛋白偶聯受體(GPCR)的結合，激活磷脂酶Cβ2(PLCβ2)，使4,5-二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)發(fā)生水解作用，導致了位于細胞內鈣庫膜上的IP3-門控鈣離子通道打開，儲備的Ca2+釋放，進而激活瞬時受體電位離子通道蛋白5(TRPM5)從而促進膜的去極化。通過檢測以上營養(yǎng)物質感應信號途徑相關的基因表達及激素分泌的水平發(fā)現灌服脯氨酸和NCG提高了空腸PLCβ2的表達量，同時NCG促進了CCK的分泌。CCK作為一種腸道激素，能夠調節(jié)胰島素的分泌、胃排空和食欲[46]。CCK的分泌受到多種因素影響，氨基酸能夠通過激活CasR促進CCK的分泌[47]。本研究結果顯示，NCG和脯氨酸能夠正向調節(jié)營養(yǎng)利用和相關激素的分泌。有研究證實，飼糧中添加NCG 10 d后環(huán)江香豬的平均日增重顯著高于基礎飼糧組，可能是由于NCG可以促進仔豬腸道對營養(yǎng)物質的吸收，進而改善機體的氨基酸平衡和蛋白質代謝，從而提高仔豬的生長性能[48-49]。

氨基酸刺激mTOR信號通路的表達。NCG對mTOR信號通路基因的表達調控主要反映在MAP4K3和mTORmRNA相對表達量的升高。MAP4K3是一個保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶，參與到多種信號通路連接，包括免疫缺陷同系物(IMD)、表皮生長因子受體(EGFR)、雷帕霉素受體C1(TORC1)和c-Jun氨基末端激酶(JNK)的信號通路[5,50]。有研究表明MAP4K3的活性直接受到氨基酸含量的調節(jié)，且不是通過胰島素的作用，進而調節(jié)mTORC1的表達[51]。然而，腐胺及脯氨酸對MAP4K3及mTOR信號通路的mRNA相對表達量無顯著作用。這可能與NCG，而非腐胺和脯氨酸，顯著增加了仔豬腸道黏膜中精氨酸含量有關。

4 結 論

哺乳期灌服腐胺、脯氨酸和NCG對仔豬腸道氨基酸含量、氨基酸轉運載體及感應信號的調控存在差異性。與腐胺和脯氨酸相比，NCG的作用更加明顯。NCG可提高仔豬空腸黏膜中精氨酸含量，促進SNAT2的相對表達量，并上調多種氨基酸轉運載體和感應受體的相對表達量，刺激胃腸激素CCK的分泌以及mTOR信號通路的相對表達量。脯氨酸的作用主要表現在調控氨基酸轉運載體，但可能通過反饋機制抑制了SNAT2的相對表達量。腐胺雖然上調了SNAT2的相對表達量，但對腸道黏膜氨基酸含量、氨基酸轉運載體和mTOR信號通路的相對表達量以及CCK的分泌均無顯著影響。因此，NCG可通過促進不同氨基酸轉運載體的表達，激活相應的營養(yǎng)感應信號，從而改善斷奶仔豬的生長性能。