凌 浩 肖紅艷 張紫陽(yáng) 何幼寬 屈金濤，2 張佩華*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)沙 410128；2.城步羴牧牧業(yè)有限公司，邵陽(yáng) 422500)

近年來(lái)，隨著生活水平的提高和對(duì)食品安全問(wèn)題的重視，人們?cè)絹?lái)越關(guān)注抗生素在畜禽產(chǎn)品中的殘留問(wèn)題。當(dāng)前，世界各地已基本達(dá)成禁止在飼糧中添加促生長(zhǎng)類抗生素的共識(shí)，我國(guó)已發(fā)布相關(guān)法令，自2020年1月1日起，退出除中藥外的所有促生長(zhǎng)類藥物飼料添加劑品種。為了畜牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，保障食品安全和動(dòng)物健康，開(kāi)發(fā)利用綠色、安全、高效的飼用抗生素替代品已經(jīng)成為當(dāng)下畜牧研究的熱點(diǎn)與重要方向。血根堿(C20H14NO4)是一種從博落回等植物中提取出來(lái)的苯菲啶異喹啉類生物堿，提純固體呈紅黃色粉末狀，相對(duì)分子質(zhì)量為332，具有抗菌、抗炎、抗氧化等多種生物學(xué)活性[1]。目前，血根堿在畜牧生產(chǎn)中的應(yīng)用研究已有一定進(jìn)展，國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究表明，飼糧中添加血根堿具有調(diào)節(jié)動(dòng)物腸道功能、增強(qiáng)機(jī)體免疫和抗氧化能力、提高畜禽生產(chǎn)性能及改善畜產(chǎn)品質(zhì)量等功效[2-6]。但是關(guān)于血根堿的應(yīng)用研究大多數(shù)都是在單胃動(dòng)物上進(jìn)行，在反芻動(dòng)物上的相關(guān)研究還鮮有報(bào)道，飼糧中添加血根堿能否提高奶山羊的生產(chǎn)性能、改善機(jī)體抗氧化和免疫功能還不清楚。因此，本研究擬在奶山羊飼糧中添加血根堿，探討其對(duì)奶山羊生產(chǎn)性能、抗氧化和免疫功能的影響，為血根堿在奶山羊上的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間與地點(diǎn)

試驗(yàn)于2020年5月25日至2020年8月20日在湖南省邵陽(yáng)市城步縣某奶山羊牧場(chǎng)進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)材料

血根堿制劑為博落回提取物，其活性成分為苯菲啶異喹啉類生物堿(血根堿含量≥0.15%)，由湖南某生物資源有限公司提供。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選擇24頭胎次[(2.4±0.3)胎]、泌乳日齡[(192±5)日齡]、產(chǎn)奶量[(1.55±0.12)kg]、體重[(54.96±3.48)kg]相近的西農(nóng)薩能奶山羊，隨機(jī)分成2組，每組12頭。對(duì)照組飼喂全混合日糧，血根堿組飼喂全混合日糧+400 mg/kg血根堿。血根堿添加量參考Wang等[7]和Estrada-Angulo等[8]的試驗(yàn)結(jié)果。試驗(yàn)期52 d，其中預(yù)試期10 d，正試期42 d。

1.4 試驗(yàn)飼糧

試驗(yàn)飼糧參照NRC(2007)奶山羊標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行設(shè)計(jì)，其組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。試驗(yàn)采用全混合日糧飼喂方式。

表1 試驗(yàn)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.5 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)羊采用小欄飼養(yǎng)，每組12頭，隨機(jī)分為4欄飼喂，每欄3頭。每天分別于08:00及16:30飼喂，保證每欄有5%剩料。每天分別于07:00及18:00擠奶。自由飲水和自由采食，消毒、免疫等按羊場(chǎng)常規(guī)程序進(jìn)行。

1.6 樣品采集及指標(biāo)測(cè)定

1.6.1 生產(chǎn)性能測(cè)定

正試期開(kāi)始后，每天記錄每頭試驗(yàn)羊的產(chǎn)奶量，用于測(cè)定平均日產(chǎn)奶量。

正試期以欄為單位每天記錄試驗(yàn)羊的平均喂料量和剩料量，用于測(cè)定干物質(zhì)采食量。飼料轉(zhuǎn)化率計(jì)算公式如下：

飼料轉(zhuǎn)化率=產(chǎn)奶量(kg/d)/干物質(zhì)采食量(kg/d)[9]。

1.6.2 飼糧樣采集與測(cè)定

正試期每周采用四分法收集1次對(duì)照組和血根堿組飼糧樣和剩料樣各500 g，稱重后在65 ℃鼓風(fēng)烘箱中烘48 h，測(cè)定初水分含量，測(cè)定后粉碎，過(guò)40目篩用于測(cè)定常規(guī)養(yǎng)分含量。參照GB/T 6435—2014的方法測(cè)定干物質(zhì)(DM)含量，參照GB/T 6432—2018的方法測(cè)定粗蛋白質(zhì)(CP)含量，參照GB/T 6433—2006的方法測(cè)定粗脂肪(EE)含量，參照GB/T 6438—2007的方法測(cè)定粗灰分(Ash)含量，參照GB/T 6436—2018的方法測(cè)定鈣(Ca)含量，參照GB/T 6437—2018的方法測(cè)定總磷(TP)含量，參照GB/T 6434—2006的方法測(cè)定中性洗滌纖維(NDF)和酸性洗滌纖維(ADF)含量。

1.6.3 血樣采集與測(cè)定

正試期第21和42天晨飼前，使用一次性真空采血管進(jìn)行頸靜脈采血，每頭羊采集血樣10 mL，其中5 mL注入普通真空采血管，離心(633×g，15 min)后，用移液槍取上清液并分裝到至1.5 mL離心管，-20 ℃冰箱保存，用于測(cè)定血清抗氧化和免疫指標(biāo)。剩余5 mL注入乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管4 ℃保存，2 h內(nèi)測(cè)定血細(xì)胞參數(shù)。

采用試劑盒法測(cè)定血清總抗氧化能力(T-AOC)、丙二醛(MDA)含量以及超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)活性。試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)法測(cè)定血清腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-2(IL-2)、白細(xì)胞介素-4(IL-4)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、白細(xì)胞介素-8(IL-8)、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白M(IgM)含量。ELISA試劑盒購(gòu)自江蘇雨桐生物科技有限公司。

使用全自動(dòng)五分類血細(xì)胞分析儀(光電MEK-7222K，日本)測(cè)定血液白細(xì)胞(white blood cell，WBC)、中性粒細(xì)胞(neutrophil，NEUT)、淋巴細(xì)胞(lymphocyte，LYMPH)、單核細(xì)胞(monocytes，MONO)、嗜酸性細(xì)胞(oxyphil cell，EO)、嗜堿性細(xì)胞(basophil，BASA)、紅細(xì)胞(red blood cell，RBC)數(shù)量。

1.7 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Excel 2010進(jìn)行初步整理后，利用SAS 9.4軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，統(tǒng)計(jì)結(jié)果用最小二乘法均值和均值標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)表示。生產(chǎn)性能數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)后，使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析。

血液指標(biāo)數(shù)據(jù)使用PROC MIXED模型進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，不同的采樣日期(第21天和第42天)測(cè)定結(jié)果視為重復(fù)，以試驗(yàn)羊?yàn)殡S機(jī)因素，試驗(yàn)處理、采樣日期、試驗(yàn)處理與采樣日期互作為固定因素。P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

統(tǒng)計(jì)分析模型：Yijk=μ+Ti+Dj+Ti×Dj+Gk+εijk。

式中：Yijk為因變量；μ為總體均值；Ti為處理(i=1，2)，固定效應(yīng)；Dj為采樣日期(j=21，42)，固定效應(yīng)；Ti×Dj為處理和采樣日期的交互作用，固定效應(yīng)；Gk(k=1,2,3,…,24)為試驗(yàn)?zāi)躺窖颍S機(jī)效應(yīng)；εijk為變量i、j、k的隨機(jī)誤差。

2 結(jié) 果

2.1 血根堿對(duì)奶山羊生產(chǎn)性能的影響

由表2可知，與對(duì)照組相比，血根堿組的產(chǎn)奶量顯著提高了8.3%(P<0.05)。2組之間干物質(zhì)采食量和飼料轉(zhuǎn)化率無(wú)顯著差異(P>0.05)。

2.2 血根堿對(duì)奶山羊血清抗氧化指標(biāo)的影響

由表3可知，血根堿組的血清MDA含量極顯著低于對(duì)照組(P<0.01)，血清GSH-Px活性和T-AOC極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。2組之間血清SOD活性無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表3 血根堿對(duì)奶山羊血清抗氧化指標(biāo)的影響

2.3 血根堿對(duì)奶山羊血細(xì)胞參數(shù)的影響

由表4可知，血根堿組的血液WBC數(shù)量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，血液NEUT數(shù)量極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。2組之間血液LYM、MONO、EO、BASO和RBC數(shù)量無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表4 血根堿對(duì)奶山羊血細(xì)胞參數(shù)的影響

2.4 血根堿對(duì)奶山羊血清免疫指標(biāo)的影響

由表5可知，血根堿組的血清IL-2和IgG含量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，血清IL-4和IgA含量極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。2組之間血清TNF-α、IL-6、IL-8和IgM含量無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表5 血根堿對(duì)奶山羊血清免疫指標(biāo)的影響

3 討 論

3.1 血根堿對(duì)奶山羊生產(chǎn)性能的影響

血根堿作為一種綠色、安全、高效的飼用抗生素替代品，可以在動(dòng)物體內(nèi)分解代謝為無(wú)潛在危害的二氫血根堿(C21H17NO5)，并且在機(jī)體內(nèi)不會(huì)被重新氧化成血根堿[10-11]，沒(méi)有耐藥性和殘留的風(fēng)險(xiǎn)，可在畜禽飼糧中長(zhǎng)期添加。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外已有較多研究表明，血根堿可以改善畜禽的生產(chǎn)性能。Abudabos等[5]研究發(fā)現(xiàn)，血根堿可以改善沙門(mén)氏菌感染的肉雞的生長(zhǎng)性能和腸道健康。Liu等[6]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加血根堿可改善1～28日齡黃羽肉雞的腸道形態(tài)和微生物群落結(jié)構(gòu)，從而提高其生長(zhǎng)性能。Chen等[4]研究發(fā)現(xiàn)，血根堿可以作為抗生素的潛在替代品，對(duì)斷奶仔豬的生長(zhǎng)性能、免疫狀況、抗氧化能力和腸道健康都有一定的促進(jìn)作用。產(chǎn)奶量的變化可以有效反映奶畜的生產(chǎn)性能和健康狀況。在本試驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，飼糧中添加血根堿能夠顯著提高奶山羊的產(chǎn)奶量，改善生產(chǎn)性能。其可能的原因是，血根堿具有抗炎和抗菌作用，能夠改善腸道形態(tài)和微生物群落結(jié)構(gòu)[4-5,12]，提高生產(chǎn)性能；或者是血根堿可以增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化和免疫功能[2,13-14]，保護(hù)腸道和乳腺的屏障功能，提高生產(chǎn)性能；也有可能是多種效果同時(shí)發(fā)揮作用，改善動(dòng)物的生產(chǎn)性能。

3.2 血根堿對(duì)奶山羊抗氧化功能的影響

奶畜在泌乳期乳腺組織的營(yíng)養(yǎng)代謝非常旺盛，容易產(chǎn)生較多的自由基，而過(guò)量的自由基會(huì)打破機(jī)體內(nèi)的氧化動(dòng)態(tài)平衡，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等大分子物質(zhì)過(guò)氧化，造成氧化損傷[15]。T-AOC是反映機(jī)體抗氧化系統(tǒng)綜合能力的指標(biāo)[16]；T-SOD和CSH-Px是機(jī)體清除自由基、對(duì)抗氧化應(yīng)激、保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整的特異性酶[17]；MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化代謝的終產(chǎn)物，能夠間接地反映細(xì)胞損傷的程度[18]。Bavarsadi等[19]研究發(fā)現(xiàn)，在蛋雞飼糧中添加血根堿可以降低血清MDA含量，提高機(jī)體抗氧化功能。張衛(wèi)兵等[20]研究表明，在犢牛飼糧中添加血根堿具有改善犢牛機(jī)體抗氧化功能的效果。在本試驗(yàn)中，飼糧中添加血根堿能夠極顯著降低奶山羊血清MDA含量，極顯著提高血清T-AOC和CSH-Px活性，改善機(jī)體抗氧化功能?？赡艿脑蚴茄鶋A通過(guò)抑制還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)氧化酶復(fù)合物的活性[21-22]，減少機(jī)體自由基的產(chǎn)生，從而發(fā)揮其抗氧化能力。

3.3 血根堿對(duì)奶山羊血細(xì)胞參數(shù)的影響

動(dòng)物機(jī)體發(fā)揮正常的免疫功能需要保證免疫細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的完整，WBC是包括MONO、粒細(xì)胞和LYMPH在內(nèi)的發(fā)揮非特異性免疫功能的血細(xì)胞[23]；NEUT具有運(yùn)動(dòng)和吞噬功能，發(fā)揮非特異性防御和保護(hù)作用，可以吞噬并殺滅入侵體內(nèi)的細(xì)菌、病毒等異物，它在血液中占WBC總數(shù)的50%左右，其增加或減少會(huì)直接影響WBC數(shù)量的變化[24]。在本試驗(yàn)中，2組奶山羊的血細(xì)胞參數(shù)均在正常范圍內(nèi)[25]；且與對(duì)照組相比，血根堿組的WBC數(shù)量顯著增加，NEUT數(shù)量極顯著增加，由此推測(cè)飼糧中添加血根堿能一定程度上提高奶山羊的非特異性免疫功能?？赡艿脑蚴茄鶋A具有較好的免疫增強(qiáng)作用，能夠保護(hù)免疫細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能的完整，激活免疫細(xì)胞的相關(guān)功能[26]，同時(shí)結(jié)合本試驗(yàn)中血清抗氧化和免疫指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，血根堿可以提高奶山羊的抗氧化功能，增加血清IL-2、IL-4、IgG和IgA含量，改善免疫功能，保護(hù)機(jī)體健康，但是具體作用機(jī)制還不清楚，需要進(jìn)一步探究。

3.4 血根堿對(duì)奶山羊免疫功能的影響

白細(xì)胞介素是一種由多種細(xì)胞產(chǎn)生的與炎癥通路和免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的生物活性物質(zhì)[27]。IL-2具有促進(jìn)LYMPH生長(zhǎng)、增殖和分化，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫應(yīng)答和抗病毒等多種生物活性；IL-4可以刺激活化B細(xì)胞和T細(xì)胞，調(diào)節(jié)體液免疫[28]。在本試驗(yàn)中，飼糧中添加血根堿可以顯著提高奶山羊血清IL-2含量，極顯著提高血清IL-4含量，改善奶山羊的免疫功能，保護(hù)機(jī)體健康。其原因可能是血根堿具有很強(qiáng)的抗炎活性，能夠抑制核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)的活化，發(fā)揮抗炎作用[19]。

免疫球蛋白是由B淋巴細(xì)胞增殖分化產(chǎn)生的免疫活性物質(zhì)，主要包括IgA、IgM、IgG，能夠抵御細(xì)菌、病毒等病原體入侵，是體液免疫的重要組成部分[29]。目前，大多數(shù)研究表明，飼糧中添加血根堿可以提高機(jī)體免疫球蛋白含量，改善免疫功能[30-32]；但也有相關(guān)研究表明，飼糧中添加血根堿會(huì)產(chǎn)生免疫抑制，降低機(jī)體免疫球蛋白含量[20]?？赡艿脑蚴茄鶋A產(chǎn)品的添加量與有效活性成分含量不同使試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生差異，或者是試驗(yàn)動(dòng)物的種類、生理階段等不同導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)論不一致。這提示血根堿是能替代抗生素應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐的，但是要全面替代抗生素，在動(dòng)物生產(chǎn)上大規(guī)模推廣應(yīng)用，還需要進(jìn)行大量完整、系統(tǒng)地研究，確定不同動(dòng)物種類與生理階段的適宜添加方式與添加量。在本試驗(yàn)中，飼糧中添加血根堿可以顯著提高血清IgG含量，極顯著提高血清IgA含量，對(duì)血清IgM含量無(wú)顯著影響。由此推測(cè)血根堿可以通過(guò)調(diào)節(jié)免疫球蛋白的分泌，增強(qiáng)奶山羊的體液免疫應(yīng)答，提高免疫力，抵御外界病原體的入侵。

4 結(jié) 論

在本試驗(yàn)條件下，飼糧中添加血根堿可以提高奶山羊產(chǎn)奶量，改善機(jī)體的抗氧化和免疫功能。