馬 靜 王 迅 孫 璐* 劉書杰*

(1.青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，西寧 810016；2.青海高原牦牛研究中心，西寧 810016；3.青海省高原放牧家畜動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧 810016)

牦牛主要分布于海拔3 000 m以上的青藏高原等高寒草原地區(qū)[1]。中國(guó)現(xiàn)有牦牛1 300萬(wàn)頭，約占世界牦?？倲?shù)的92.8%[2]，是世界上牦牛最主要的種質(zhì)資源庫(kù)和最大的牦牛畜產(chǎn)品生產(chǎn)基地。大部分牦牛生活在青藏高原超凈區(qū)，這種特殊的自然環(huán)境使牦牛乳中的蛋白質(zhì)、干物質(zhì)、脂肪及乳糖等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的含量高于其他乳。牦牛乳是一種天然、獨(dú)特的濃縮乳，具有“高濃度、高比重、高含量”的特點(diǎn)，被譽(yù)為“乳中之王”，還被譽(yù)為“上帝賜與人類最接近完美的食品”[3]。

原料奶具有復(fù)雜的微生物生態(tài)系統(tǒng)，其中包含許多菌株。牛乳微生物對(duì)健康的潛在影響包括阻斷腸胃病原體、中和結(jié)腸中產(chǎn)生的食物誘變劑，增強(qiáng)免疫反應(yīng)，降低血清膽固醇含量，預(yù)防結(jié)腸癌和肝性腦病，治愈腸道功能障礙、便秘以及消化性潰瘍[4]。人類膳食結(jié)構(gòu)的改變?cè)黾恿藢?duì)乳制品的需求，生鮮乳的質(zhì)量安全受到密切關(guān)注。食源性致病菌是引發(fā)食源性疾病的重要因素，牦牛乳極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值為各類微生物的生長(zhǎng)提供了良好的介質(zhì)，致病微生物的代謝產(chǎn)物對(duì)牦牛生鮮乳的質(zhì)量起著重要作用[5]。對(duì)生鮮乳微生物結(jié)構(gòu)和組成的研究在乳品質(zhì)的把控中十分關(guān)鍵，牛乳中的致病菌和腐敗菌可反映母牛的健康狀況、生鮮乳的衛(wèi)生狀況、儲(chǔ)存時(shí)間等重要指標(biāo)[6]。曾學(xué)琴等[7]為了對(duì)引起奶牛乳房炎的病原菌進(jìn)行溯源，通過高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)了乳房炎奶牛和正常奶牛的乳頭擦拭子和牛乳中細(xì)菌的16S rRNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，患病奶牛乳頭及牛乳微生物組成與健康奶牛乳頭及牛乳微生物組成存在差異。胡婕[8]通過比較Illumina MiSeq和IonS5TMXL 2個(gè)二代測(cè)序平臺(tái)對(duì)4 ℃冷藏、間隔6 d的原料乳微生物多樣性分析，發(fā)現(xiàn)原料乳冷藏過程中由于微生物的生長(zhǎng)代謝會(huì)導(dǎo)致其腐敗變質(zhì)。牛乳中有些微生物使得其風(fēng)味更加理想，有些則會(huì)使其發(fā)生腐敗變質(zhì)[9]。

微生物的組成由遺傳背景、宿主飲食、環(huán)境差異和溫度等多種因素決定，微生物在極端環(huán)境下經(jīng)過長(zhǎng)期的自然選擇，具備相對(duì)特殊的結(jié)構(gòu)、機(jī)能以及遺傳特性，以應(yīng)答相應(yīng)的脅迫因子[10-12]。目前，對(duì)于青海地區(qū)不同海拔高度牦牛生鮮乳的研究大多集中在其脂肪酸組成及營(yíng)養(yǎng)成分含量等方面[13-14]，但對(duì)于不同海拔高度牦牛乳微生物區(qū)系的組成及多樣性分析未見相關(guān)報(bào)道，因此對(duì)不同海拔高度牦牛乳微生物組成和多樣性進(jìn)行研究十分必要。

微生物的傳統(tǒng)檢測(cè)方法主要有純培養(yǎng)法、計(jì)數(shù)法、血清檢測(cè)法、特定引物的PCR檢測(cè)法等，雖然這些檢測(cè)方法都有利于病原微生物的鑒定，但也存在局限性，很難對(duì)微生物進(jìn)行全面檢測(cè)[15]。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，高通量測(cè)序技術(shù)因不依靠傳統(tǒng)培養(yǎng)基方法而簡(jiǎn)單高效，是研究復(fù)雜微生物結(jié)構(gòu)組成的較好選擇。因此，本研究利用16S rDNA分析方法，基于Illumina Nova測(cè)序平臺(tái)對(duì)青海地區(qū)高寒草地類不同海拔高度牦牛乳微生物群落結(jié)構(gòu)及其多樣性進(jìn)行研究，旨在為進(jìn)一步開發(fā)牦牛乳提供基礎(chǔ)參考。

1 材料與方法

1.1 采樣信息

選自然放牧狀態(tài)下全天候隨群放牧的體況、年齡、胎次基本一致的牦牛，以天然草場(chǎng)為主，不補(bǔ)充任何飼料。泌乳期的母牛和犢牛分開過夜，每天人工擠奶1～2次但不完全擠完，以便犢牛可以喝到奶。3個(gè)采樣點(diǎn)擠奶、采樣方法相同。本試驗(yàn)于2019年7—8月，分別在青海省玉樹州的稱多縣(yak1)、海西州的天峻縣(yak2)、海南州的共和縣(yak3)，采集高寒草甸類的天然草場(chǎng)的泌乳中期4～5胎次的健康牦牛乳樣本，每個(gè)采樣點(diǎn)采集5個(gè)樣本。采樣點(diǎn)基本信息見表1。每份牦牛乳樣本約50 mL，取5 mL于無(wú)菌無(wú)酶凍存管中，液氮速凍，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后儲(chǔ)存在-80 ℃冰箱備測(cè)。

表1 采樣點(diǎn)基本信息

1.2 儀器與設(shè)備

DCC體細(xì)胞檢測(cè)儀，利拉伐天津有限公司；超低溫(-80 ℃)冰箱，美國(guó)Thermo公司；Fresco21型高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)Thermo公司；Tprofessiona PCR儀，德國(guó)Biometral公司；Gel DOC XR凝膠成像系統(tǒng)、PowerPac Universal水平電泳儀、SUBCELL GT電泳槽(20 cm×25 cm)，美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 基因組總DNA提取及PCR擴(kuò)增、測(cè)序

1.3.2 環(huán)境因子的獲取

3個(gè)采樣點(diǎn)的海拔高度等信息利用天寶Juno SA無(wú)線GPS記錄器定位獲得，在國(guó)家氣象科學(xué)數(shù)據(jù)中心(http://data.cma.cn/site/index.html)獲取采樣點(diǎn)年平均氣溫。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

1.4.1 測(cè)序數(shù)據(jù)處理

測(cè)序所得原始序列截去Barcode和引物序列后,使用FLASH(version 1.2.7)進(jìn)行拼接獲得原始Tags數(shù)據(jù)，拼接得到的原始Tags數(shù)據(jù)經(jīng)Qiime軟件(version 1.9.1,http://qiime.org/scripts/split_libraries_fastq.html)質(zhì)量控制后獲得高質(zhì)量Tags(clean Tags)數(shù)據(jù)，通過與物種注釋數(shù)據(jù)庫(kù)(https://github.com/torognes/vsearch/)進(jìn)行比對(duì)檢測(cè)嵌合體序列，去除其中的嵌合體序列，得到最終的有效Tags(effective Tags)數(shù)據(jù)。

1.4.2 微生物多樣性分析

基于有效數(shù)據(jù)進(jìn)行操作分類單元(OTUs)聚類分析和物種分類分析。使用Qiime軟件(Version 1.9.1)計(jì)算Observed-species、Chao1、Shannon及Simpson指數(shù)，使用R軟件(Version 2.15.3)完成Alpha多樣性指數(shù)組間差異分析。

利用Mothur(version 1.30.1)計(jì)算Alpha多樣性指數(shù)。利用QIIME(version 1.17)計(jì)算Beta 多樣性距離矩陣?；贐ray-Curtis距離進(jìn)行相似性分析(ANOSIM)，基于Unweighted UniFrac距離對(duì)不同海拔高度牦牛乳微生物進(jìn)行主坐標(biāo)分析(CoA)。對(duì)牦牛乳微生物組成進(jìn)行差異判別分析(LEfSe)，再根據(jù)分類學(xué)組成對(duì)樣本按照不同的分類水平進(jìn)行線性判別分析(LDA，閾值為4)，找出對(duì)樣本劃分產(chǎn)生顯著性影響的菌群。此外，基于海拔高度以及年平均氣溫等環(huán)境因子數(shù)據(jù)，分析產(chǎn)生差異的原因。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣本測(cè)序結(jié)果及Alpha多樣性指數(shù)

基于Illumina Nova測(cè)序平臺(tái)測(cè)序，構(gòu)建PCR-free文庫(kù)，然后進(jìn)行雙末端(paired-end)測(cè)序。通過對(duì)Reads拼接，平均每個(gè)樣本測(cè)得90 459條Tags，經(jīng)過質(zhì)控平均得到76 843條有效數(shù)據(jù)，質(zhì)控有效數(shù)據(jù)量達(dá)60 460，質(zhì)控有效率達(dá)67.18%。以97%的一致性將序列聚類成為OTUs，共得到12 329個(gè)OTUs，然后對(duì)OTUs序列與Silva132數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行物種注釋。注釋結(jié)果中，共有4 211個(gè)(34.16%)OTUs注釋到屬水平。

Alpha多樣性指數(shù)中的Observed species、Shannon、Simpson和Chao1指數(shù)主要用于反映樣本中菌群的豐富度。由表2可知，不同采樣點(diǎn)牦牛乳樣本中Observed species、Shannon、Simpson和Chao1指數(shù)均無(wú)顯著差異(P>0.05)，表明不同海拔高度牦牛乳中菌群的豐富度差異不顯著。

表2 Alpha多樣性指數(shù)

2.2 不同海拔高度牦牛乳微生物組成

2.2.1 物種Venn圖分析

如圖1所示，yak1牦牛乳中總的OTUs數(shù)為5 367個(gè)，yak2牦牛乳中總的OTUs數(shù)為7 212個(gè)，yak3牦牛乳中總的OTUs數(shù)為6 095個(gè)。重疊的部分表示3個(gè)采樣點(diǎn)牦牛乳中共有的OTUs數(shù)，為2 988個(gè)。沒有重疊的部分表示3個(gè)采樣點(diǎn)牦牛乳中所特有的OTUs數(shù)，其中yak1為1 183個(gè)，yak2為2 143個(gè)，yak3為1 192個(gè)。yak1與yak2重疊的OTUs數(shù)為3 669個(gè)，yak1與yak3重疊的OTUs數(shù)為3 503個(gè)，yak2與yak3有4 388個(gè)OTUs重疊在一起。

圖1 基于OTUs的Venn圖

2.2.2 門水平下微生物組成

圖2顯示，不同海拔高度牦牛乳樣本中排名前10的菌門均為變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)、藍(lán)藻門(Cyanobacteria)、浮霉菌門(Planctomycetes)、酸酐菌門(Acidobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)。3個(gè)采樣點(diǎn)的15個(gè)樣本中均有分布且相對(duì)豐度較高的菌門為變形菌門和厚壁菌門，這2個(gè)菌門在yak1牦牛乳中分別占細(xì)菌總序列的44.49%和20.93%，在yak2牦牛乳中分別占細(xì)菌總序列的39.30%和32.66%，在yak3牦牛乳中分別占細(xì)菌總序列的41.32%和23.90%。由此可知，變形菌門和厚壁菌門為3個(gè)海拔高度牦牛乳中的優(yōu)勢(shì)菌門，變形菌門在海拔最高、年平均氣溫最低的稱多縣歇武鎮(zhèn)歇武村牦牛乳中占比最高，在海拔和年平均氣溫適中的天峻縣織合瑪鄉(xiāng)牦牛乳中占比最低。厚壁菌門的占比變化與變形菌門恰好相反，即海拔最高、年平均氣溫最低的稱多縣歇武鎮(zhèn)歇武村牦牛乳中厚壁菌門的占比最低，海拔和年平均氣溫適中的天峻縣織合瑪鄉(xiāng)牦牛乳中厚壁菌門的占比最高。

Proteobacteria：變形菌門；Firmicutes：厚壁菌門；Bacteroidetes：擬桿菌門；Actinobacteria：放線菌門；Cyanobacteria：藍(lán)藻門；Planctomycetes：浮霉菌門；Acidobacteria：酸酐菌門；Chloroflexi：綠彎菌門；Verrucomicrobia：疣微菌門；Gemmatimonadetes：芽單胞菌門；Others：其他。

2.2.3 屬水平下微生物組成

圖3顯示，不同海拔高度牦牛乳樣本中排名前10的菌屬為同棲水菌屬(Enhydrobacter)、藍(lán)藻門未定義菌屬(unidentified_Cyanobacteria)、金黃桿菌屬(Chryseobacterium)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、馬賽菌屬(Massilia)、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)、腸桿菌科未定義菌屬(unidentified_Enterobacteriaceae)、棒桿菌科未定義菌屬(unidentified_Corynebacteriaceae)、科薩克氏菌屬(Kosakonia)、肉桿菌屬(Atopostipes)。其中不動(dòng)桿菌屬為yak1(海拔最高、年平均氣溫最低)和yak3(海拔最低、年平均氣溫最高)牦牛乳中的優(yōu)勢(shì)菌屬，分別占細(xì)菌總序列的8.29%和7.71%，乳桿菌屬為yak2牦牛乳中相對(duì)豐度較高的菌屬，占細(xì)菌總序列的8.20%。未分類菌屬在yak1、yak2和yak3牦牛乳中的占比分別為68.44%、67.99%、73.22%。

Enhydrobacter：同棲水菌屬；unidentified_Cyanobacteria：藍(lán)藻門未定義菌屬；Chryseobacterium：金黃桿菌屬；Lactobacillus：乳桿菌屬；Massilia：馬賽菌屬；Acinetobacter：不動(dòng)桿菌屬；unidentified_Enterobacteriaceae：腸桿菌科未定義菌屬；unidentified_Corynebacteriaceae：棒桿菌科未定義菌屬；Kosakonia：科薩克氏菌屬；Atopostipes：肉桿菌屬；Others：其他。

熱圖(heat map)可呈現(xiàn)出樣本群落物種組成信息，反映每個(gè)分類級(jí)別的不同分組或樣本群落組成的相似性和差異性。圖4中，豐度較高的菌屬以紅色顯示，豐度較低的菌屬以藍(lán)色表示。在門水平上，所有樣本在左側(cè)物種聚類分支上分為七大支，分別為放線菌門、擬桿菌門、藍(lán)藻門、厚壁菌門、浮霉菌門、變形菌門、疣微菌門。在屬水平上，yak1牦牛乳中中金黃桿菌屬、Lutibacter、紅小梨形菌屬(Rhodopirellula)、Persicirhabdus的豐度較高；yak2牦牛乳中乳桿菌屬、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、水棲菌屬(Enhydrobacter)、馬賽菌屬的豐度較高；yak3牦牛乳中貪銅菌屬(Cupriavidus)、微桿菌屬(Microbacterium)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、動(dòng)性球菌屬(Planococcus)的豐度較高。

Cupriavidus：貪銅菌屬；Microbacterium：微桿菌屬；Bacillus：芽孢桿菌屬；Planococcus：動(dòng)性球菌屬；unidentified_Corynebacteriaceae：棒桿菌科未定義菌屬；Bergeyella：伯杰菌屬；Kosakonia：科薩克氏菌屬；Moraxella：莫拉菌屬；Bradyrhizobium：慢生根瘤菌屬；Ralstonia：勞爾氏菌屬；Streptococcus：鏈球菌屬；Sphingomonas：鞘氨醇單胞菌屬；Acinetobacter：不動(dòng)桿菌屬；Bifidobacterium：雙歧桿菌屬；unidentified_Lachnospiraceae：毛螺菌科未定義菌屬；Arsenophonus：殺雄菌屬；Enhydrobacter：水棲菌屬；Lactobaillus：乳桿菌屬；Massilia：馬賽菌屬；Gardnerella：加德納氏菌屬；Chryseobacterium：金黃桿菌屬；Rhodopirellula：紅小梨形菌屬；unidentified_Cyanobacteria：藍(lán)藻門未定義菌屬；Pseudomonas：假單胞菌屬；Bacteroides：擬桿菌屬；Enterococcus：腸球菌屬；Psychrobacter：嗜冷桿菌屬；Phylum：門；Actinobacteria：放線菌門；Bacteroidetes：擬桿菌門；Cyanobacteria：藍(lán)藻門；Firmicutes：厚壁菌門；Planctomycetes：浮霉菌門；Proteobacteria：變形菌門；Verrucomicrobia：疣微菌門。

2.2.4 種水平下微生物組成

由表3可知，奧斯陸莫拉氏菌(Moraxella_osloensis)、魯氏不動(dòng)桿菌(Acinetobacterlwoffii)和Kosakonia_oryzae為不同海拔高度牦牛乳樣本中所共有的微生物，但它們?cè)?個(gè)采樣點(diǎn)牦牛乳中的相對(duì)豐度各不相同。奧斯陸莫拉氏菌為yak2牦牛乳中的優(yōu)勢(shì)菌種，相對(duì)豐度為7.50%；魯氏不動(dòng)桿菌為yak1牦牛乳中的優(yōu)勢(shì)菌種，相對(duì)豐度為3.98%；Kosakonia_oryzae為yak3牦牛乳中的優(yōu)勢(shì)菌屬，相對(duì)豐度為5.78%。

表3 種水平下牦牛乳微生物的相對(duì)豐度

2.2.5 物種PCoA

PCoA結(jié)果如圖5所示，第1主成分對(duì)樣本差異的貢獻(xiàn)值為14.37%，第2主成分對(duì)樣本差異的貢獻(xiàn)值為11.37%。yak2和yak3樣本距離較近而離yak1樣本距離較遠(yuǎn)，由此可知，yak2和yak3樣本的群落結(jié)構(gòu)相似度較高，而與yak1樣本的群落差異較大。這可能是由于天峻縣織合瑪鄉(xiāng)與共和縣黑馬河鄉(xiāng)之間的距離與稱多縣歇武鎮(zhèn)歇武村相比較近，地理環(huán)境相似。且天峻縣織合瑪鄉(xiāng)與共和縣黑馬河鄉(xiāng)之間海拔高度差距與稱多縣歇武鎮(zhèn)歇武村相比較小。由此推測(cè)，微生物群落結(jié)構(gòu)相似度與地理環(huán)境與海拔高度有關(guān)。

圖5 基于Unweighted UniFrac距離的PCoA

2.3 不同海拔高度牦牛乳中微生物組成差異分析

yak1和yak3的海拔高度相差1 409 m，差距明顯，因此選取這2個(gè)采樣點(diǎn)進(jìn)行不同海拔高度牦牛乳中微生物組成分析。線性判別分析(LDA)值分布柱狀圖(圖6-A)及進(jìn)化分支圖(圖6-B)中體現(xiàn)了不同海拔高度牦牛乳間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的生物標(biāo)志物(biomarker)和差異顯著的物種。由此可知，yak1牦牛乳中主要影響微生物組成的差異物種為放線菌門和放線菌門未定義菌綱(unidentified_Actinobacteria)，yak3牦牛乳中主要影響微生物組成的差異物種為黃桿菌目(Flavobacteriales)、擬桿菌綱(Bacteroidia)。

A：LDA值分布柱狀圖 LDA score distribution histogram；B：進(jìn)化分支圖 evolutionary branch diagram。p：門 phylum；c：綱 class；o：目 order；f：科 family；g：屬genus；s：種 species。Actinobacteria：放線菌門；unidentified_Actinobacteria：放線菌門未定義菌綱；Corynebacteriales：棒桿菌目；Corynebacteriaceae：棒桿菌科；unidentified_Corynebacteriaceae：棒桿菌科未定義菌屬；Micrococcales：微球菌目；Kosakonia：科薩克氏菌屬；Rhodobacterales：紅桿菌目；Rhodobacteraceae：紅桿菌科；Chryseobacterium：金黃桿菌屬；unidentified_Flavobacteriales：黃桿菌目未定義菌科；Bacteroidetes：擬桿菌門；Bacteroidia：擬桿菌綱；Flavobacteriales：黃桿菌目。

3 討 論

牦牛乳是青藏高原區(qū)域游牧民族日常必需品，也是引起許多食源性疾病的主要來源。對(duì)不同海拔高度牦牛乳微生物多樣性的研究發(fā)現(xiàn)，青海地區(qū)牦牛乳中厚壁菌門和變形菌門為優(yōu)勢(shì)菌門，優(yōu)勢(shì)菌屬為不動(dòng)桿菌屬和乳桿菌屬，這與現(xiàn)有的研究結(jié)果[18-19]基本一致。

微生物的多樣性不僅受到動(dòng)物的影響，還與環(huán)境密切相關(guān)，高海拔生態(tài)系統(tǒng)通常具有氣溫低、降水量低、大氣壓力低的特征，這對(duì)微生物的多樣性有重大影響[20-21]。因此，海拔高度及氣溫差異可能是門、屬、科水平牦牛乳微生物組成差異的主要原因。不同海拔高度的牧草的營(yíng)養(yǎng)成分含量及生物量存在差異。高利娥[22]的研究結(jié)果顯示，不同海拔高度的傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛乳中乳酸菌的多樣性不同。微生物群落非常復(fù)雜，隨氣溫變化而變化，氣溫在微生物種群中起著至關(guān)重要的作用，高氣溫更有利于微生物的繁殖[23]。在海拔相對(duì)較低、氣溫相對(duì)較高的共和縣黑馬河牦牛乳中乳桿菌屬的占比最高，且該采樣點(diǎn)牦牛乳在門、屬、科水平下未分類的微生物占比最高。乳桿菌屬是乳酸菌群中的主要菌屬，是調(diào)節(jié)人體腸道菌群并使其保持正常狀態(tài)的重要細(xì)菌類群，在機(jī)體內(nèi)可將糖轉(zhuǎn)化為乳酸，利于發(fā)酵活性的維持，多數(shù)乳桿菌屬被用作益生菌[24-25]。海拔越高，則微生物多樣性越小，且極端溫度也與微生物活性和新陳代謝的降低有關(guān)[26]。海拔高度和氣溫呈負(fù)相關(guān)，由此推測(cè)海拔較低、氣溫較高的地區(qū)的可能更有利于提高牦牛乳中乳桿菌屬的占比，有利于機(jī)體胃腸疾病的改善，是牦牛乳發(fā)酵制品更理想的原料乳。

變形菌門在海拔高度為4 781 m的yak1牦牛乳中占比最高，厚壁菌門在海拔高度為3 984 m的yak2牦牛乳中占比最高。變形菌門包括一些致病菌，如奈瑟氏屬、耶爾森氏屬和博爾塔氏屬、農(nóng)桿菌屬、根瘤菌屬和大腸桿菌屬等[27]。有研究表明，γ-變形桿菌門尤其是腸桿菌科在未成熟的小鼠腸道大量存在，與早期腸道炎癥有關(guān)，不利于犢牛早期腸道微生物的定植[28-29]。變形菌門占比最高yak1牦牛乳可能更容易使腸道細(xì)菌在犢牛腸道定植，從而引起犢牛及飲用者的腹瀉和腸道炎癥。在屬水平上，作為優(yōu)勢(shì)菌屬的不動(dòng)桿菌屬，雖然在一些研究人員看來其產(chǎn)生的蛋白質(zhì)水解酶和脂解酶可能有助于改善乳制品的風(fēng)味、氣味或質(zhì)地[30]，但Gurung等[31]和Dijkshoorn等[32]認(rèn)為不動(dòng)桿菌屬具有致病性，是被低估的食源性病原體[33]。并且，不動(dòng)桿菌屬是原料乳中常見的嗜冷菌，若大量繁殖會(huì)破壞乳成分，導(dǎo)致腐敗變質(zhì)，從而影響牛乳品質(zhì)[34-35]。yak1牦牛乳中嗜冷菌占比最高的原因可能是該采樣點(diǎn)是3個(gè)采樣點(diǎn)中海拔最高、氣溫最低的。一般原料乳中不存在致病菌，而該乳中存在致病菌可能是因?yàn)槟撩袷止D乳過程中被污染。本試驗(yàn)中各采樣點(diǎn)均為牧民手工擠乳，這個(gè)過程中牛奶多次接觸空氣，空氣中的各種細(xì)菌、灰塵、雜物等必然污染牛奶[36]。目前未加工食品是食源性疾病患病率不斷上升的主要原因之一，如果原料乳中存在人畜共患病原體，則可能對(duì)公眾健康造成威脅，需盡量避免致病菌的附著。因此，應(yīng)規(guī)范牦牛的飼養(yǎng)管理，重視畜舍衛(wèi)生，生鮮牦牛乳應(yīng)嚴(yán)格按照生產(chǎn)規(guī)范，盡量實(shí)現(xiàn)牦牛乳的機(jī)械化擠乳，做好殺菌消毒等工作，避免因生鮮乳引起的食源性疾病，提高原料乳的品質(zhì)及安全性。

4 結(jié) 論

青海地區(qū)不同海拔高度牦牛乳中微生物組成和豐度存在差異。yak2和yak3牦牛乳中微生物群落結(jié)構(gòu)相似度較高，并與yak1牦牛乳中微生物群落結(jié)構(gòu)均存在較大差異。