羊秀美 陳炳旭 呂 靜 郭麗娟 閔育娜

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，楊陵 712100)

隨著抗生素使用過程中藥物殘留和耐藥性等對(duì)畜禽產(chǎn)品安全及人類健康危害的揭示，開發(fā)和應(yīng)用綠色、安全和無公害的抗生素替代物成為飼料和養(yǎng)殖行業(yè)的研究熱點(diǎn)。細(xì)菌素是由細(xì)菌核糖體合成的低分子蛋白質(zhì)及多肽類物質(zhì)，被廣泛用以抑制動(dòng)物體致病菌活性、調(diào)節(jié)腸道菌群平衡、改善腸道組織形態(tài)，進(jìn)而增強(qiáng)腸道消化吸收能力[1-3]，促進(jìn)畜禽生長發(fā)育，具有替代抗生素的潛力[4]。其中，由乳酸鏈球菌產(chǎn)生的乳酸鏈球菌素(Nisin)是一種天然抗菌肽，可有效抑制革蘭氏陽性菌和陰性菌生長及芽孢桿菌孢子形成[5]，有望成為抗生素的理想替代物。研究表明，肉雞飼糧添加Nisin可抑制腸道產(chǎn)氣莢膜梭菌及腸球菌活性，降低腸道有害細(xì)菌比例，調(diào)節(jié)腸道菌群平衡[6]，提高肉雞生長性能[7-8]。Kierończyk等[9]研究證實(shí)，飼糧添加Nisin能顯著提高肉雞1～35日齡階段飼料轉(zhuǎn)化效率及35日齡體重，降低血液葡萄糖含量。然而，Nisin對(duì)肉雞抗氧化性能、免疫機(jī)能及腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響尚不清晰，肉雞飼糧中Nisin的適宜添加水平還需要進(jìn)一步探討。因此，本試驗(yàn)以哈伯德肉雞為研究對(duì)象，探究飼糧添加Nisin對(duì)肉雞生長性能、屠宰性能、抗氧化性能、免疫性能及腸道形態(tài)的影響，以期客觀評(píng)估其在肉雞生產(chǎn)中的應(yīng)用效果，為其在肉雞飼糧中合理添加提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所用Nisin(98%)購自浙江某生物工程有限公司，活性為1×106IU/g。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼糧

采用單因素完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，選取1日齡體重[(38.40±0.80)g]相近的健康哈伯德肉用公雛雞360只，隨機(jī)分為3個(gè)組，每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)20只。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗(yàn)組分別在基礎(chǔ)飼糧中添加0.08%和0.11% Nisin。基礎(chǔ)飼糧為玉米-豆粕型，按照《雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》(NY/T 33—2004)配制，其組成及營養(yǎng)水平見表1。試驗(yàn)期42 d。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)期間肉雞均采用籠養(yǎng)方式，每籠為1個(gè)重復(fù)(20只)，雞只自由采食和飲水，23 h光照(每日22:00熄燈1 h)，舍內(nèi)為機(jī)械通風(fēng)，嚴(yán)格按照《哈伯德肉雞商品代飼養(yǎng)管理手冊(cè)》免疫、消毒和通風(fēng)等。試驗(yàn)開始前3 d室溫34 ℃，此后每周降溫2 ℃，直至24 ℃，維持至試驗(yàn)?zāi)?應(yīng)用風(fēng)機(jī)、燈帶和濕簾等嚴(yán)格控制環(huán)境溫度)；試驗(yàn)期間，舍內(nèi)相對(duì)濕度保持在60%～70%(濕簾、噴霧和地面灑水等維持環(huán)境濕度)。每天08:30和15:30記錄雞舍溫度和濕度，清掃衛(wèi)生，記錄死淘雞只體重及數(shù)目。

1.4 樣品采集與制備

于試驗(yàn)第21和42天，每重復(fù)選取1只體重接近均重的健康肉雞，翅靜脈采集5 mL血液樣品于采血管中，室溫靜置2 h后，1 048×g離心15 min，分離獲得血清樣品于1.5 mL離心管中，-80 ℃保存，待測(cè)定血清生化指標(biāo)。然后將肉雞二氧化碳(100%)窒息后屠宰，取空腸、回腸中間部位2 cm腸段，生理鹽水清洗后，固定于4%多聚甲醛，待分析腸道組織形態(tài)；采集空腸黏膜置于2 mL凍存管中，液氮速凍，至-80 ℃超低溫冰箱保存，用于腸道免疫屏障分析。

1.5 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.5.1 生長性能

試驗(yàn)第1、21和42天，以重復(fù)為單位對(duì)空腹12 h肉雞稱重，記錄重量，計(jì)算平均日增重(average daily gain,ADG)；于試驗(yàn)第21和42天，以重復(fù)為單位統(tǒng)計(jì)階段耗料量，計(jì)算平均日采食量(average daily feed intake,ADFI)和料重比(feed/gain,F/G)。

1.5.2 屠宰性能

于試驗(yàn)第42天，每重復(fù)選取1只接近平均體重的健康肉雞，使用二氧化碳窒息機(jī)(廣州儒銳科技有限公司，DW800)進(jìn)行二氧化碳(100%)窒息，脫頸致死，頸靜脈放血，去毛后解剖，分離胸肌、腿肌和腹脂并稱重記錄，計(jì)算屠宰率、半凈膛率、全凈膛率、胸肌率、腿肌率和腹脂率，公式如下：

屠宰率(%)=100×(屠體重/活體重)；全凈膛率(%)=100×(全凈膛重/活體重)；半凈膛率(%)=100×(半凈膛重/活體重)；胸肌率(%)=100×(2側(cè)胸肌重/全凈膛重)；腿肌率(%)=100×(2側(cè)腿肌重/全凈膛重)；腹脂率(%)=100×(腹脂重/全凈膛重)。

1.5.3 血清抗氧化指標(biāo)

采用比色法測(cè)定血清總抗氧化能力(T-AOC)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和超氧化物歧化酶(SOD)活性以及丙二醛(MDA)含量，試劑盒購自南京建成生物工程研究所，測(cè)定方法嚴(yán)格按照試劑盒說明書執(zhí)行。

1.5.4 腸道形態(tài)

取出固定后的腸道組織，常規(guī)方法制作石蠟切片，蘇木精-伊紅染色，在光學(xué)顯微鏡(Nikon 80i，日本)下觀察測(cè)定絨毛高度(villus height,VH)、隱窩深度(crypt depth,CD)和絨毛高度與隱窩深度比值(villus height/crypt depth,V/C)。每個(gè)切片隨機(jī)選取5個(gè)非連續(xù)性視野，每個(gè)視野統(tǒng)計(jì)3組數(shù)據(jù)，整體平均值為最終測(cè)定結(jié)果。

1.5.5 血清免疫球蛋白和空腸分泌型免疫球蛋白A(sIgA)含量

采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法測(cè)定肉雞血清免疫球蛋白A(immunoglobulin A,IgA)、免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG)、免疫球蛋白M(immunoglobulin M,IgM)以及空腸sIgA含量，試劑盒購自南京建成生物工程研究所，測(cè)定方法嚴(yán)格按照試劑盒說明書執(zhí)行。

1.6 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，以P<0.05表示差異顯著，0.05≤P<0.10為有差異顯著趨勢(shì)，結(jié)果以平均值和均值標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 Nisin對(duì)肉雞生長性能和屠宰性能的影響

由表2可知，試驗(yàn)前期(1～21日齡)，飼糧添加Nisin對(duì)肉雞ADFI、ADG和F/G均無顯著影響(P>0.05)。試驗(yàn)后期(22～42日齡)和全期(1～42日齡)，與對(duì)照組相比，2個(gè)Nisin組ADFI和F/G均顯著降低(P<0.05)。0.08%和0.11% Nisin組肉雞42日齡體重較對(duì)照組分別提高116.60和156.53 g(P=0.087)。

表2 Nisin對(duì)肉雞生長性能的影響

由表3可知，飼糧添加Nisin有提高肉雞屠宰率的趨勢(shì)(P=0.066)，對(duì)肉雞半凈膛率、全凈膛率、胸肌率、腿肌率和腹脂率均無顯著影響(P>0.05)。

表3 Nisin對(duì)肉雞屠宰性能的影響

2.2 Nisin對(duì)肉雞血清抗氧化指標(biāo)的影響

由表4可知，與對(duì)照組相比，飼糧添加0.08%和0.11% Nisin顯著提高了肉雞21日齡血清T-AOC(P<0.05)；0.11% Nisin組肉雞42日齡血清SOD活性顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。

表4 Nisin對(duì)肉雞血清抗氧化指標(biāo)的影響

2.3 Nisin對(duì)肉雞腸道形態(tài)的影響

由表5可知，與對(duì)照組相比，0.11% Nisin組肉雞21和42日齡空腸VH顯著提高(P<0.05)；飼糧添加Nisin對(duì)肉雞回腸形態(tài)指標(biāo)無顯著影響(P>0.05)。

表5 Nisin對(duì)肉雞腸道形態(tài)的影響

2.4 Nisin對(duì)肉雞血清免疫球蛋白和空腸sIgA含量的影響

由表6可知，與對(duì)照組相比，飼糧添加0.08%和0.11% Nisin顯著提高肉雞21日齡空腸sIgA和42日齡血清IgG含量(P<0.05)；0.11% Nisin組肉雞21日齡血清IgM和42日齡空腸sIgA含量均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。

表6 Nisin對(duì)肉雞血清免疫球蛋白和空腸sIgA含量的影響

3 討 論

3.1 Nisin對(duì)肉雞生長性能和屠宰性能的影響

Nisin是食品和工業(yè)上常用的抗菌肽，對(duì)革蘭氏陽性菌和陰性菌活性有較強(qiáng)抑制作用，且易降解、無毒副作用[10]。研究發(fā)現(xiàn)，羅斯308肉仔雞飼糧添加Nisin制劑可顯著提高肉雞35日齡體重，降低1～14日齡料重比[9]。本研究結(jié)果表明，飼糧添加0.08%和0.11% Nisin顯著降低了哈伯德肉雞后期和全期料重比，有提高42日齡體重的趨勢(shì)，且高劑量組生長性能改善效果更好，這與Józefiak等[7]在羅斯308肉仔雞上的研究結(jié)果相似。關(guān)于Nisin促生長作用的調(diào)節(jié)機(jī)制尚不清晰，但與其改善腸道健康作用密不可分。研究發(fā)現(xiàn)，Nisin能夠調(diào)節(jié)家禽腸道菌群結(jié)構(gòu)，抑制有害菌群活性，影響回腸脂肪酸組成，進(jìn)而促進(jìn)家禽生長發(fā)育[7]。另外，Kierończyk等[9]研究認(rèn)為，Nisin可通過降低腸道重量和長度，增強(qiáng)腸道對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的消吸收能力，提高家禽生長性能。本試驗(yàn)探究了Nisin對(duì)腸道形態(tài)和免疫屏障的作用。

目前，國內(nèi)外有關(guān)飼糧添加Nisin對(duì)家禽屠宰性能影響方面缺少詳細(xì)的研究報(bào)道。張欣鑫等[11]研究表明，飼糧添加Nisin能夠影響肉雞胴體組成，其中0.075%和0.100% Nisin組肉雞半凈膛率顯著低于對(duì)照組，胸肌率顯著高于對(duì)照組。與以上結(jié)果不同，本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼糧添加0.08%和0.11% Nisin有提高肉雞屠宰率的趨勢(shì)，對(duì)全凈膛率、胸肌率、腿肌率和腹脂率等指標(biāo)均無顯著影響，這與前人的研究結(jié)果不完全一致，原因可能與Nisin的活性有關(guān)[9]。

3.2 Nisin對(duì)肉雞抗氧化性能的影響

動(dòng)物機(jī)體抗氧化功能主要由抗氧化酶和非酶抗氧化物共同調(diào)控。SOD和GSH-Px是機(jī)體抗氧化系統(tǒng)的主要酶類物質(zhì)，可清除氧化產(chǎn)物，防止氧化自由基損害機(jī)體組織完整及細(xì)胞功能[12]；MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的一種代謝終產(chǎn)物，其含量能間接反映機(jī)體自由基積累情況及組織氧化受損程度[13]；T-AOC是反映機(jī)體酶系和非酶系抗氧化功能的綜合指標(biāo)，其水平可體現(xiàn)機(jī)體防御系統(tǒng)抗氧化能力的強(qiáng)弱[12]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼糧添加Nisin顯著提高了肉雞21日齡血清T-AOC，說明Nisin具有增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力的作用；并且，0.11% Nisin組肉雞42日齡血清SOD活性顯著提高。SOD是抗氧化酶體系歧化超氧化物自由基的關(guān)鍵酶，可將超氧化物自由基歧化為氧氣和過氧化氫，進(jìn)而保護(hù)機(jī)體組織及細(xì)胞免受損傷[14]。體外研究發(fā)現(xiàn)，0.1～5.0 mg/mL Nisin能夠有效清除氧化自由基，其清除氧化自由基作用隨添加劑量增強(qiáng)[15]。由此可見，飼糧添加Nisin能夠改善動(dòng)物機(jī)體抗氧化性能，其作用與SOD活性提高相關(guān)。

3.3 Nisin對(duì)肉雞腸道形態(tài)的影響

腸道是動(dòng)物消化吸收的主要場(chǎng)所，其黏膜正常形態(tài)和完整功能是機(jī)體充分消化吸收營養(yǎng)物質(zhì)的基礎(chǔ)。小腸絨毛是動(dòng)物腸道消化和吸收營養(yǎng)物質(zhì)的特有結(jié)構(gòu)，其VH、絨毛寬度和CD直接影響腸道養(yǎng)分吸收表面積[16]；V/C綜合反映腸道絨毛吸收功能。本研究結(jié)果表明，飼糧添加0.11% Nisin顯著提高了肉雞21和42日齡空腸VH，說明Nisin能夠改善肉雞空腸組織形態(tài)。腸道菌群結(jié)構(gòu)與腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)密切相關(guān)[17]。飼糧添加Nisin可調(diào)節(jié)肉雞腸道菌群結(jié)構(gòu)，抑制有害菌活性，促進(jìn)有益菌定植[3]。本試驗(yàn)中，肉雞腸道組織形態(tài)改善可能與Nisin調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)有關(guān)。絨毛基部上皮細(xì)胞下陷至固有層形成隱窩，隱窩中的細(xì)胞有分化功能，并向絨毛頂部遷移形成成熟絨毛細(xì)胞，其分化速度越快，CD越淺、VH越高，成熟細(xì)胞數(shù)目越多，腸道吸收功能越好[18-19]。本研究中，飼糧添加Nisin提高肉雞生長性能可能與腸道形態(tài)改善、養(yǎng)分吸收能力增強(qiáng)有關(guān)。Lauková等[20]研究發(fā)現(xiàn)，飲水添加Nisin未見顯著影響兔腸道VH、CD及V/C，與本試驗(yàn)結(jié)果存在差異。這種差異可能與添加劑量及添加方式不同有關(guān)。

3.4 Nisin對(duì)肉雞免疫性能的影響

免疫球蛋白是動(dòng)物體液免疫的主要免疫分子，在機(jī)體免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用[21]。血清免疫球蛋白含量能夠反應(yīng)機(jī)體免疫功能變化。IgG主要由免疫器官漿細(xì)胞分泌，是介導(dǎo)體液免疫的關(guān)鍵免疫蛋白，血清中含量較高；IgM是體液免疫過程中最先被分泌、釋放的免疫物質(zhì)，能與體內(nèi)和體外抗原相互反應(yīng)，消除病原體[22]。本研究結(jié)果表明，飼糧添加Nisin顯著提高了肉雞21日齡血清IgM和42日齡血清IgG含量。目前為止，有關(guān)Nisin對(duì)家禽免疫球蛋白的研究鮮有報(bào)道。先前研究表明，Nisin可調(diào)節(jié)豬免疫細(xì)胞活性，降低炎性因子水平[23]，提高小鼠B淋巴細(xì)胞(CD19+)和T淋巴細(xì)胞(CD4+、CD8+和CD3+)百分比及CD4+T淋巴細(xì)胞/CD8+T淋巴細(xì)胞值，增強(qiáng)機(jī)體免疫機(jī)能[24]。此外，飼糧添加SOD模擬物可提高肉雞血清IgG和IgM含量[25]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼糧添加Nisin可提高肉雞血清SOD活性。以上結(jié)果說明，Nisin提高肉雞血清免疫球蛋白含量可能與機(jī)體免疫細(xì)胞活性及SOD活性提高有關(guān)。

sIgA由腸道漿母細(xì)胞分泌，主要分布于黏液層，是腸道提供免疫保護(hù)的主要免疫球蛋白和黏膜免疫的核心，與病原微生物表面抗原結(jié)合，保護(hù)腸上皮細(xì)胞免受損害，是家禽體液免疫的主效應(yīng)因子[26]。抗菌肽作為動(dòng)物機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要效應(yīng)分子，可通過特異受體激活免疫細(xì)胞功能，促進(jìn)免疫球蛋白分泌(sIgA、IgA)，增強(qiáng)免疫機(jī)能[27]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼糧添加Nisin顯著提高了肉雞空腸sIgA含量，提示Nisin可增強(qiáng)肉雞腸道黏膜免疫機(jī)能。由此推測(cè)，Nisin促進(jìn)肉雞生長發(fā)育可能與腸道黏膜免疫機(jī)能增強(qiáng)有關(guān)[18]。

4 結(jié) 論

飼糧添加Nisin能提高肉雞免疫和抗氧化性能，促進(jìn)小腸絨毛生長發(fā)育，增強(qiáng)腸道黏膜免疫機(jī)能，從而改善肉雞生長性能；綜合促生長作用及養(yǎng)殖效益，0.08%添加水平較為適宜。