柳成東 肖明霞 趙 平 李琦華 白華毅 程志斌

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，昆明 650201)

產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(enterotoxigenicEscherichiacoli,ETEC)破壞腸道菌群平衡，損傷腸道正常形態(tài)，引發(fā)炎癥反應(yīng)，是斷奶仔豬高腹瀉率和較差生長性能的主要原因之一，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。飼糧添加土霉素等抑制ETEC的飼用抗生素，顯著降低了斷奶仔豬腹瀉，一定程度上改善了仔豬生長性能[2]。然而，隨著我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布第194號公告，規(guī)定于2020年7月1日起全面禁止促生長藥物飼料添加劑的使用，研發(fā)替代抗生素的功能性安全飼料添加劑迫在眉睫。

飼用益生菌是一類用以維持動(dòng)物腸道微生態(tài)平衡和改善動(dòng)物機(jī)體生理生化的功能性添加劑[3]。已有報(bào)道證明，飼用益生菌凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)具有高效抑制ETEC等多種腸道有害菌、維持腸道微生態(tài)平衡的作用，且凝結(jié)芽孢桿菌具有良好的耐熱性，適合顆粒飼料添加[4-5]，因此成為近年來研究與生產(chǎn)推廣的熱點(diǎn)[6-7]。大量試驗(yàn)報(bào)道[7-9]，衛(wèi)生條件控制較好的科學(xué)試驗(yàn)條件下，飼用凝結(jié)芽孢桿菌能夠顯著改善正常斷奶仔豬的生長性能。然而，實(shí)際上我國生豬養(yǎng)殖衛(wèi)生條件差異較大，以往的試驗(yàn)數(shù)據(jù)與結(jié)論是否能夠支撐飼用凝結(jié)芽孢桿菌在斷奶仔豬料中的普遍性推廣，值得深入探討。目前，只有Pu等[10]的1篇報(bào)道模擬較差的養(yǎng)殖衛(wèi)生環(huán)境，采用ETEC K88感染仔豬模型發(fā)現(xiàn)，飼糧添加復(fù)合功能性添加劑(0.2×107CFU/g凝結(jié)芽孢桿菌及苯甲酸、牛至油)，能夠顯著改善ETEC K88感染仔豬的腹瀉和生長性能。鑒于此，為了符合養(yǎng)豬生產(chǎn)多樣的衛(wèi)生條件，本研究首次采用體內(nèi)、體外相結(jié)合的2個(gè)試驗(yàn)，驗(yàn)證飼糧單一添加凝結(jié)芽孢桿菌對ETEC K88感染斷奶仔豬生長性能和腸道的作用效果，為飼用凝結(jié)芽孢桿菌在仔豬養(yǎng)殖生產(chǎn)中的推廣提供更多的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用凝結(jié)芽孢桿菌制劑(菌株編號YNAU 5517，總菌數(shù)0.91×1010CFU/g)由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)提供[11]；ETEC K88標(biāo)準(zhǔn)菌株(CGMCC1.2385)購買于北納生物科技有限公司；土霉素由昆明三正生物科技(集團(tuán))有限公司購買。

1.2 抑菌試驗(yàn)

試驗(yàn)設(shè)計(jì)陰性對照組(無菌蒸餾水組)和陽性對照組(土霉素組)，采用經(jīng)典牛津杯抑菌試驗(yàn)評估法[12]，對比該株凝結(jié)芽孢桿菌對ETEC K88的抑制作用及效果，為后續(xù)飼用凝結(jié)芽孢桿菌改善口服ETEC K88感染仔豬生長性能及腸道健康奠定基礎(chǔ)。土霉素配制成400 mg/L溶液，依據(jù)《飼料藥物添加劑使用規(guī)范》中全價(jià)配合飼料允許添加量范圍的上限。

牛津杯法評估與分析該株凝結(jié)芽孢桿菌抑制ETEC K88的方法參考李靜舒等[13]最新報(bào)道。抑菌圈直徑測定與數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)簡述如下：用游標(biāo)卡尺測定3個(gè)處理的抑菌圈直徑(含所用牛津杯的外徑值7.8 mm)最大值和最小值，并計(jì)算平均值，以確定抑菌圈直徑數(shù)據(jù)。為了對3個(gè)處理的抑菌直徑進(jìn)行方差分析，將沒有抑制作用的抑菌圈直徑值，定義為7.8 mm[13]。此外，依據(jù)本次試驗(yàn)所用牛津杯的直徑值(7.8 mm)，將牛津杯外徑的約2倍16.0 mm區(qū)分為“敏感”與“高敏感”，因此抑菌作用判定標(biāo)準(zhǔn)如下：“不敏感”，抑菌圈直徑=7.8 mm，無抑制作用；“敏感”，7.8 mm<抑菌圈直徑≤16.0 mm，有一定抑制作用；“高敏感”，抑菌圈直徑>16.0 mm，有較強(qiáng)抑制作用。

1.3 ETEC K88感染試驗(yàn)

1.3.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)選用32頭25日齡斷奶的健康“杜×長×大”商品公豬，按照初始體重一致原則分成4個(gè)組，每組8個(gè)重復(fù)，單籠飼養(yǎng)。ETEC K88感染前7 d(試驗(yàn)第1～7天)，2個(gè)組飼喂基礎(chǔ)飼糧(BD組)，另外2個(gè)組飼喂在基礎(chǔ)飼糧中添加1.0×107CFU/g凝結(jié)芽孢桿菌的飼糧(PD組)。第8天起，開展2×2雙因素試驗(yàn)(因素1，口服ETEC K88感染處理；因素2，飼用凝結(jié)芽孢桿菌處理)，4個(gè)組設(shè)計(jì)如下：1)NCH+BD組，口服生理鹽水、飼喂基礎(chǔ)飼糧；2)NCH+PD組，口服生理鹽水、飼喂添加凝結(jié)芽孢桿菌飼糧；3)CH+BD組，口服ETEC K88、飼喂基礎(chǔ)飼糧；4)CH+PD組，口服ETEC K88、飼喂添加凝結(jié)芽孢桿菌飼糧。第8～10天，每天08:00，試驗(yàn)豬口服5 mL ETEC K88(活菌數(shù)1.0×109CFU/mL)或5 mL 0.9%生理鹽水，每天1次[10]。

1.3.2 試驗(yàn)飼糧

參照NRC(2012)豬營養(yǎng)需要量標(biāo)準(zhǔn)配制基礎(chǔ)飼糧，其組成及營養(yǎng)水平見表1，基礎(chǔ)飼糧中不添加任何飼用抑菌藥物及其他益生菌。凝結(jié)芽孢桿菌制劑依據(jù)課題組前期報(bào)道[9,14]，在基礎(chǔ)飼糧中添加1.1 kg/t，添加量為1.0×107CFU/g。所有飼糧經(jīng)80 ℃制粒。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.3.3 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)在云南省玉溪市正和豬場完成。試驗(yàn)豬代謝籠(長×寬×高=1.1 m×0.4 m×0.9 m)單籠飼養(yǎng)，保育舍溫度保持26～28 ℃。試驗(yàn)全程自由采食和飲水，24 h光照。飼養(yǎng)試驗(yàn)周期10 d。

1.3.4 樣品采集

試驗(yàn)第11天08:00所有試驗(yàn)豬稱重后屠宰，取空腸和盲腸食糜樣品，放置-80 ℃冰箱中保存待測大腸桿菌和乳酸桿菌數(shù)量。空腸和回腸組織取樣并固定后(4%多聚甲醛)，用于絨毛高度和隱窩深度測定。刮取空腸黏膜，放置-80 ℃冰箱中保存待測細(xì)胞因子表達(dá)量。

1.3.5 指標(biāo)測定

1.3.5.1 生長性能

試驗(yàn)第1、8和11天08:00仔豬稱重，分別統(tǒng)計(jì)ETEC K88感染前和感染3 d期間的平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)、料重比(F/G)和腹瀉指數(shù)。腹瀉指數(shù)計(jì)算方法參考蒲俊寧[15]的報(bào)道。

1.3.5.2 腸道細(xì)菌數(shù)量

采用平板計(jì)數(shù)法[16-17]，檢測空腸和盲腸食糜中大腸桿菌和乳酸桿菌數(shù)量?？漳c和盲腸食糜中凝結(jié)芽孢桿菌數(shù)量測定參考柳成東等[11]的報(bào)道。檢測數(shù)據(jù)用lg(CFU/g)表達(dá)。

1.3.5.3 腸道形態(tài)

腸道形態(tài)學(xué)檢測參考Nosworthy等[18]報(bào)道的蘇木精-伊紅染色法，簡述如下：甲醛固定后的腸組織樣品修剪成1 cm3大小的樣品塊，經(jīng)二甲苯漂洗，并石蠟包埋。每個(gè)包埋好的樣品切出4個(gè)5 μm厚的切片，用蘇木精-伊紅染色。切片在尼康雙筒目鏡(Warsaw公司，波蘭)下測定腸絨毛高度和隱窩深度，每張切片至少連續(xù)觀測30根絨毛。

1.3.5.4 細(xì)胞因子表達(dá)量

參考Che等[19]報(bào)道的實(shí)時(shí)熒光定量法，檢測空腸黏膜細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-6(IL-6)和白細(xì)胞介素-10(IL-10)mRNA表達(dá)量，簡述如下：提取空腸黏膜IL-6和IL-10的總RNA，反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行PCR定量。選取磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)基因作為內(nèi)參基因，引物序列見表2。

表2 引物序列

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

體外抑菌試驗(yàn)的抑菌圈直徑采用SPSS 17.0進(jìn)行單因素方差分析和Duncan氏法多重比較；ETEC感染前生長性能數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析；口服ETEC感染試驗(yàn)?zāi)Ｐ蛿?shù)據(jù)采用2×2雙因素方差分析，分別統(tǒng)計(jì)ETEC感染處理效應(yīng)、飼用凝結(jié)芽孢桿菌處理效應(yīng)及其二者互作效應(yīng)。結(jié)果以平均值和均值標(biāo)準(zhǔn)誤表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 凝結(jié)芽孢桿菌對ETEC K88的抑制效果

由圖1可知，凝結(jié)芽孢桿菌對ETEC K88的抑制作用達(dá)到“敏感”(抑菌圈直徑=15.2 mm)，其抑制效果顯著小于土霉素(抑菌圈直徑=17.0 mm，“高敏感”)(P<0.05)。此外，陰性對照組無菌蒸餾水對ETEC K88沒有抑制作用(“不敏感”)。

Ⅰ組，無菌蒸餾水組；Ⅱ組，土霉素組；Ⅲ組，凝結(jié)芽孢桿菌組。數(shù)據(jù)柱標(biāo)注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同小寫字母或無字母表示差異不顯著(P>0.05)。下圖同。

2.2 飼用凝結(jié)芽孢桿菌對ETEC K88感染斷奶仔豬生長性能的影響

由表3可知，ETEC K88感染前7 d，與BD組(飼喂基礎(chǔ)飼糧)相比，PD組(飼喂添加凝結(jié)芽孢桿菌的飼糧)斷奶仔豬平均日增重和平均日采食量顯著提高(P<0.05)，料重比和腹瀉指數(shù)顯著降低(P<0.05)。

表3 飼用凝結(jié)芽孢桿菌對ETEC K88感染前斷奶仔豬生長性能的影響

由表4可知，口服ETEC K88持續(xù)感染3 d顯著降低斷奶仔豬平均日增重和平均日采食量(P<0.05)，顯著提高料重比和腹瀉指數(shù)(P<0.05)；飼糧添加凝結(jié)芽孢桿菌顯著提高斷奶仔豬平均日增重和平均日采食量(P<0.05)，顯著降低料重比和腹瀉指數(shù)(P<0.05)。除腹瀉指數(shù)外，ETEC K88感染處理與飼用凝結(jié)芽孢桿菌處理之間對其他生長性能指標(biāo)均無顯著互作效應(yīng)(P>0.05)。

表4 飼用凝結(jié)芽孢桿菌對ETEC K88感染3 d斷奶仔豬生長性能的影響

2.3 飼用凝結(jié)芽孢桿菌對ETEC K88感染斷奶仔豬腸道菌群的影響

由表5可知，ETEC K88感染處理顯著增加斷奶仔豬空腸和盲腸食糜中大腸桿菌數(shù)量(P<0.05)，顯著減少空腸和盲腸食糜中乳酸桿菌數(shù)量(P<0.05)；飼糧添加凝結(jié)芽孢桿菌顯著減少空腸和盲腸食糜中大腸桿菌數(shù)量(P<0.05)，顯著增加空腸和盲腸食糜中乳酸桿菌數(shù)量(P<0.05)。此外，ETEC K88感染處理與飼用凝結(jié)芽孢桿菌處理之間對以上腸道細(xì)菌測定指標(biāo)均無顯著互作效應(yīng)(P>0.05)。

表5 飼用凝結(jié)芽孢桿菌對ETEC K88感染斷奶仔豬腸道菌群的影響

由圖2可知，NCH+PD組仔豬空腸食糜中凝結(jié)芽孢桿菌數(shù)量顯著高于CH+PD組(P<0.05)。然而，NCH+PD組與CH+PD組之間盲腸食糜中凝結(jié)芽孢桿菌數(shù)量無顯著差異(P>0.05)。此外，飼糧未添加凝結(jié)芽孢桿菌的NCH+BD組和CH+BD組未檢測出凝結(jié)芽孢桿菌。

圖2 斷奶仔豬空腸和盲腸食糜中凝結(jié)芽孢桿菌的數(shù)量

2.4 飼用凝結(jié)芽孢桿菌對ETEC K88感染斷奶仔豬腸道形態(tài)的影響

由表6可知，ETEC K88感染處理顯著降低斷奶仔豬空腸和回腸的絨毛高度和絨毛高度/隱窩深度值(P<0.05)，顯著提高空腸和回腸的隱窩深度(P<0.05)；飼糧添加凝結(jié)芽孢桿菌顯著提高空腸和回腸的絨毛高度和絨毛高度/隱窩深度值(P<0.05)，顯著降低空腸的隱窩深度(P<0.05)，且對回腸的隱窩深度有降低的趨勢(P=0.068)。此外，ETEC K88感染處理與飼用凝結(jié)芽孢桿菌處理之間以上腸道形態(tài)指標(biāo)均無顯著互作效應(yīng)(P>0.05)。

表6 飼用凝結(jié)芽孢桿菌對ETEC K88感染斷奶仔豬腸道形態(tài)的影響

2.5 飼用凝結(jié)芽孢桿菌對ETEC K88感染斷奶仔豬空腸黏膜細(xì)胞因子表達(dá)量的影響

由圖3可知，ETEC K88感染處理顯著提高斷奶仔豬空腸黏膜IL-6 mRNA表達(dá)量(P<0.05)，顯著降低空腸黏膜IL-10 mRNA表達(dá)量(P<0.05)；飼糧添加凝結(jié)芽孢桿菌顯著降低空腸黏膜IL-6 mRNA表達(dá)量(P<0.05)，顯著提高空腸黏膜IL-10 mRNA表達(dá)量(P<0.05)。此外，ETEC K88感染處理與飼用凝結(jié)芽孢桿菌處理之間對以上細(xì)胞因子指標(biāo)均無顯著互作效應(yīng)(P>0.05)。

圖3 飼用凝結(jié)芽孢桿菌對ETEC K88感染斷奶仔豬空腸黏膜細(xì)胞因子表達(dá)量的影響

3 討 論

3.1 牛津杯法評估凝結(jié)芽孢桿菌對ETEC K88的抑制作用

本試驗(yàn)中，陰性對照組無菌蒸餾水對ETEC K88沒有抑制作用，陽性對照組土霉素對ETEC K88的抑制達(dá)到“高敏感”。以上結(jié)果表明，本次體外抑菌試驗(yàn)可用于比較評估凝結(jié)芽孢桿菌對ETEC K88的抑菌效果。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，試驗(yàn)所用凝結(jié)芽孢桿菌(菌株編號YNAU 5517)對ETEC K88的抑菌圈直徑為15.2 mm，抑制作用判定為“敏感”，抑制效果統(tǒng)計(jì)分析略低于土霉素。汪攀等[4]報(bào)道，凝結(jié)芽孢桿菌(菌株編號NJ102)對ETEC K88有較強(qiáng)的抑制作用。同年，張韻等[5]評估的4株凝結(jié)芽孢桿菌(菌株編號BC147、BC235、BC310和BC303)對ETEC K88均有顯著抑制作用。ETEC K88感染是斷奶仔豬腹瀉的主要原因之一，因此這一體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果為本研究后續(xù)構(gòu)建口服ETEC K88感染仔豬試驗(yàn)?zāi)Ｐ?，?yàn)證該株飼用凝結(jié)芽孢桿菌能否改善斷奶仔豬腸道健康與生長性能奠定了良好的研究基礎(chǔ)。

3.2 飼用凝結(jié)芽孢桿菌對感染ETEC K88斷奶仔豬生長性能的影響

大量綜述文章提示，包括凝結(jié)芽孢桿菌在內(nèi)的芽孢桿菌屬飼用益生菌，一般以芽孢體的形式添入飼糧，在畜禽胃腸內(nèi)需要一定時(shí)間活化為營養(yǎng)體，并增殖、增生，才能更有效地發(fā)揮益生促生長作用[6,20-21]。為了更貼近我國養(yǎng)豬生產(chǎn)不同衛(wèi)生狀況的實(shí)際需求，突出飼用凝結(jié)芽孢桿菌的預(yù)防效果，本研究將仔豬飼養(yǎng)試驗(yàn)分成2個(gè)階段實(shí)施：階段1，不感染ETEC K88條件下，開展預(yù)飼凝結(jié)芽孢桿菌7 d的對比試驗(yàn)；階段2，隨后實(shí)施3 d持續(xù)口服ETEC K88感染處理及飼用凝結(jié)芽孢桿菌處理的2×2雙因素試驗(yàn)。該試驗(yàn)設(shè)計(jì)與前人[1,22-23]報(bào)道其他飼用益生菌在斷奶仔豬上應(yīng)用的試驗(yàn)設(shè)計(jì)相似。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，ETEC K88感染仔豬的腹瀉指數(shù)和料重比顯著提高，平均日增重和平均日采食量顯著降低。這與前人報(bào)道的ETEC K88感染仔豬模型結(jié)果[10,19,23-25]一致，表明本研究建立的口服ETEC K88感染仔豬模型合理。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，無論是否ETEC K88感染處理，飼用凝結(jié)芽孢桿菌處理均能顯著降低斷奶仔豬的料重比，顯著提高平均日增重和平均日采食量；且ETEC K88感染處理與飼用凝結(jié)芽孢桿菌處理之間對上述生長性能指標(biāo)無顯著互作效應(yīng)。本課題組前期試驗(yàn)結(jié)果[9,14]證明：與基礎(chǔ)飼糧組相比，1.0×107CFU/g飼用凝結(jié)芽孢桿菌能顯著降低正常斷奶仔豬腹瀉率和料重比，顯著提高平均日增重。Pu等[10]進(jìn)一步采用ETEC K88感染仔豬模型試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，飼糧添加凝結(jié)芽孢桿菌(0.2×107CFU/g)、苯甲酸和牛至油的組合添加劑，能夠顯著降低ETEC K88感染仔豬的腹瀉指數(shù)和料重比，顯著提高平均日增重和平均日采食量。以上報(bào)道與本研究結(jié)果基本一致。

然而，Wu等[26]報(bào)道，飼糧添加2×106和2×107CFU/g凝結(jié)芽孢桿菌，對21日齡正常斷奶仔豬的平均日增重和平均日采食量無顯著影響。分析Wu等的[26]報(bào)道，本課題組推測生長性結(jié)果造成差異的原因，包括：1)不同凝結(jié)芽孢桿菌菌株的益生作用有差異。張韻等[5]篩選的4株凝結(jié)芽孢桿菌(菌株編號BC147、BC235、BC310和BC303)雖然對ETEC K88均有抑制作用，但抑菌圈直徑值統(tǒng)計(jì)有顯著差異，這提示不同凝結(jié)芽孢桿菌的菌株對ETEC K88的抑菌效果有明顯差異。據(jù)此推測，抑菌效果不同的凝結(jié)芽孢桿菌加入飼糧，其在腸道中發(fā)揮的益生作用可能有一定差異，最終導(dǎo)致生產(chǎn)性能的結(jié)果不同。2)試驗(yàn)動(dòng)物的個(gè)體差異，包括仔豬斷奶的日齡、體重及健康狀況等。Wu等[26]課題組使用了21日齡體重6.04 kg較小的斷奶仔豬，在10 d的試驗(yàn)期間，對照組仔豬平均日增重和平均日采食量的組內(nèi)數(shù)據(jù)變異系數(shù)分別達(dá)到23.7%和35.4%，且2個(gè)添加飼用凝結(jié)芽孢桿菌組仔豬的平均日增重和平均日采食量變異系數(shù)也較大。據(jù)此推測，Wu等[26]試驗(yàn)仔豬生長性能數(shù)據(jù)的組內(nèi)變異較高，可能是數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)未能體現(xiàn)凝結(jié)芽孢桿菌改善生長性能效果的主要原因。這也充分凸顯本研究結(jié)合了體外抑菌試驗(yàn)來評估單株飼用凝結(jié)芽孢桿菌益生效果的合理性。

3.3 飼用凝結(jié)芽孢桿菌對感染ETEC K88斷奶仔豬腸道菌群的影響

腸道菌群平衡是腸道健康的重要指標(biāo)之一，能夠保障仔豬斷奶的生長性能[27]。大腸桿菌是仔豬腸道的主要致病菌，不利于生長性能[28]；乳酸桿菌是仔豬腸道的優(yōu)勢有益菌，對仔豬生長性能和腸道健康具有重要意義[29]。本試驗(yàn)中，ETEC K88感染處理導(dǎo)致斷奶仔豬空腸和盲腸食糜中大腸桿菌數(shù)量顯著增加，乳酸桿菌數(shù)量顯著減少，這與前人的報(bào)道[10,23,30]基本一致。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，飼用凝結(jié)芽孢桿菌處理顯著降低了ETEC K88感染斷奶仔豬空腸和盲腸食糜中大腸桿菌數(shù)量，顯著提高空腸和盲腸食糜中乳酸桿菌數(shù)量。Pu等[10]使用飼用凝結(jié)芽孢桿菌及苯甲酸、植物精油的組合添加劑，在ETEC K88感染仔豬試驗(yàn)?zāi)Ｐ蜕汐@得了與本試驗(yàn)相似的結(jié)果。

為了進(jìn)一步證明飼喂該株凝結(jié)芽孢桿菌能夠在斷奶仔豬腸道發(fā)揮平衡菌群、改善生長性能的作用，本研究首次檢測了所有組仔豬空腸和盲腸食糜中凝結(jié)芽孢桿菌的數(shù)量，這在以往的文獻(xiàn)中沒有報(bào)道。結(jié)果顯示：飼喂添加凝結(jié)芽孢桿菌飼糧的NCH+PD組和CH+PD組斷奶仔豬空腸食糜中凝結(jié)芽孢桿菌數(shù)量分別為4.7×105和3.6×105CFU/g，盲腸食糜中凝結(jié)芽孢桿菌數(shù)量分別為9.3×105和8.3×105CFU/g；且未飼喂添加凝結(jié)芽孢桿菌飼糧的NCH+BD組和CH+BD組斷奶仔豬空腸和盲腸食糜中未檢測出凝結(jié)芽孢桿菌。

3.4 飼用凝結(jié)芽孢桿菌對ETEC K88感染斷奶仔豬腸道形態(tài)的影響

腸黏膜絨毛高度、隱窩深度的測定是表征腸道形態(tài)的最直觀指標(biāo)[31]。完整且較長的絨毛高度和適當(dāng)?shù)碾[窩深度有利于營養(yǎng)物質(zhì)的充分吸收；相反，腸黏膜上皮細(xì)胞破損會顯著降低絨毛高度，且提高隱窩深度，這是隱窩干細(xì)胞增殖、增生對腸絨毛上皮細(xì)胞的損傷修復(fù)作用[19,31]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示：感染ETEC K88斷奶仔豬空腸和回腸絨毛高度顯著降低，隱窩深度顯著提高，且絨毛高度/隱窩深度值顯著降低，這與前人報(bào)道結(jié)果[19,22,24]一致，表明ETEC K88及所產(chǎn)毒素破壞了仔豬腸道形態(tài)，不利于營養(yǎng)物質(zhì)吸收和生長性能發(fā)揮。

本試驗(yàn)結(jié)果還顯示：飼用凝結(jié)芽孢桿菌處理恢復(fù)了ETEC K88感染斷奶仔豬空腸和回腸絨毛高度，降低了隱窩深度，且絨毛高度/隱窩深度值得到提升。Che等[19]研究表明，飼用酵母菌恢復(fù)了感染ETEC K88斷奶仔豬空腸和回腸絨毛高度，降低了隱窩深度。Pan等[24]報(bào)道，飼糧添加地衣芽孢桿菌和酵母菌提高了感染ETEC K88斷奶仔豬空腸和回腸絨毛高度，降低了隱窩深度。以上結(jié)果表明，飼用益生菌通過拮抗有害菌及毒素的入侵，維持腸道菌群平衡，從而有利于腸道正常形態(tài)的維護(hù)。

3.5 飼用凝結(jié)芽孢桿菌對ETEC K88感染斷奶仔豬腸道黏膜IL-6和IL-10 mRNA表達(dá)量的影響

促炎細(xì)胞因子IL-6主要由活化的巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和腸上皮細(xì)胞分泌，正常情況下濃度很低。腸上皮細(xì)胞受到有害菌及其分泌內(nèi)毒素的刺激后，IL-6迅速表達(dá)，因此IL-6是腸道炎癥的重要指標(biāo)之一[32]。IL-10是由活化的單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和腸上皮細(xì)胞產(chǎn)生，作為公認(rèn)的抗炎細(xì)胞因子，能夠顯著抑制機(jī)體及相關(guān)組織的炎癥反應(yīng)[33]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示：感染ETEC K88斷奶仔豬空腸黏膜IL-6 mRNA表達(dá)量顯著上升，IL-10 mRNA表達(dá)量顯著降低。周棟[34]檢測ETEC K88感染仔豬的小腸T淋巴細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)空腸表達(dá)抗炎細(xì)胞因子IL-10的T淋巴細(xì)胞百分率顯著下降。Zhu等[35]報(bào)道，ETEC K88感染仔豬回腸促炎細(xì)胞因子IL-6 mRNA表達(dá)量顯著上升。以上結(jié)果均表明，口服ETEC K88造成了斷奶仔豬小腸炎癥反應(yīng)。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示：飼用凝結(jié)芽孢桿菌處理顯著降低了感染ETEC K88斷奶仔豬空腸黏膜促炎因子IL-6 mRNA表達(dá)量，顯著提高了抗炎因子IL-10 mRNA表達(dá)量。Li等[36]報(bào)道，飼用丁酸梭菌能夠顯著增加ETEC K88感染仔豬空腸抗炎因子IL-10 mRNA表達(dá)量。Zhu等[35]研究表明，飼用鼠李糖乳酸桿菌能夠顯著增加ETEC K88感染仔豬回腸抗炎因子IL-10 mRNA表達(dá)量。以上結(jié)果表明，飼用益生菌屏蔽有害菌及毒素對腸上皮細(xì)胞的免疫刺激，具有降低腸道炎癥反應(yīng)的作用。

此外，除腹瀉指數(shù)外，飼用凝結(jié)芽孢桿菌處理與ETEC K88感染處理之間對主要生長性能以及腸道菌群、腸道形態(tài)和腸細(xì)胞因子等指標(biāo)均無顯著互作效應(yīng)。這表明，無論是否ETEC K88感染處理，飼用凝結(jié)芽孢桿菌均能發(fā)揮改善斷奶仔豬生長性能及腸道健康的效果。

4 結(jié) 論

結(jié)合單株凝結(jié)芽孢桿菌對ETEC K88顯著抑制的體外抑菌試驗(yàn)數(shù)據(jù)，本研究進(jìn)一步采用口服ETEC K88感染斷奶仔豬試驗(yàn)?zāi)Ｐ妥C明：無論是否ETEC K88感染處理，飼糧添加該株凝結(jié)芽孢桿菌在腸道內(nèi)均能顯著抑制大腸桿菌，平衡腸道菌群，進(jìn)而通過維持腸道正常形態(tài)與緩解腸道炎癥反應(yīng)，改善斷奶仔豬生長性能。

致謝：

感謝云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院葛長榮教授對文稿所提的寶貴意見。