郭詠梅 閆素梅

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古自治區(qū)高校動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特 010018)

隨著奶牛產(chǎn)奶性能的不斷提高，乳腺代謝率相應(yīng)增加，尤其在圍產(chǎn)期和泌乳高峰期，旺盛的代謝導(dǎo)致短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生大量的自由基超過(guò)了機(jī)體的清除防御能力，進(jìn)而誘發(fā)氧化應(yīng)激及失調(diào)性炎癥反應(yīng)，這對(duì)于高產(chǎn)奶牛尤為嚴(yán)重。乳腺細(xì)胞的氧化損傷和降低的抗氧化機(jī)能不僅影響了動(dòng)物的福利，而且甚至降低了乳產(chǎn)量和乳品質(zhì)，給奶牛養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。體內(nèi)與體外的大量研究表明，硒可以有效減緩奶牛氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)，從而改善健康狀況，降低發(fā)病率，促進(jìn)乳蛋白的合成[2-4]。研究發(fā)現(xiàn)，硒的抗氧化功能是通過(guò)調(diào)節(jié)硒蛋白來(lái)實(shí)現(xiàn)的，主要包括谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GPx)及硫氧還蛋白還原酶(TrxR)家族；硒蛋白可以通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路從而調(diào)節(jié)機(jī)體氧化與抗氧化之間的穩(wěn)態(tài)平衡[5]。因此，本文從硒蛋白及其對(duì)相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)控角度總結(jié)硒緩解奶牛氧化應(yīng)激、調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的機(jī)制，有助于構(gòu)建更加合理的營(yíng)養(yǎng)策略，減緩代謝性疾病，改善奶牛健康。

1 氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)的產(chǎn)生

氧化應(yīng)激水平增加是誘導(dǎo)奶牛乳腺炎癥反應(yīng)和免疫功能障礙的主要因素。研究發(fā)現(xiàn)，處于圍產(chǎn)期或泌乳前期的奶牛乳腺氧化應(yīng)激水平升高，促炎細(xì)胞因子的基因表達(dá)顯著提高[16]；而中性粒細(xì)胞L-選擇蛋白的基因表達(dá)顯著降低[17]。大量的ROS可誘導(dǎo)奶牛肺泡細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激，并通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)一步促進(jìn)炎癥生物標(biāo)志物環(huán)氧合酶-2(COX-2)的表達(dá)[18]，這說(shuō)明增加的氧化應(yīng)激水平介導(dǎo)了細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。溫和的炎癥反應(yīng)對(duì)于免疫是必需的，但促炎細(xì)胞因子的過(guò)度表達(dá)通常會(huì)誘發(fā)病理學(xué)促炎反應(yīng)的發(fā)生[16]。臨產(chǎn)前后奶牛氧化應(yīng)激水平較高時(shí)，中性粒細(xì)胞的呼吸爆發(fā)能力、吞噬作用、遷移速率均顯著降低[19]。機(jī)體免疫系統(tǒng)的失衡引起炎癥反應(yīng)加強(qiáng)，更易誘發(fā)氧化應(yīng)激，最終形成惡性循環(huán)。

2 硒對(duì)奶牛氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用及其機(jī)制

2.1 對(duì)奶牛氧化應(yīng)激與炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用

機(jī)體具有周密的抗氧化系統(tǒng)，可以中和、代謝并延遲氧化物的產(chǎn)生?？寡趸瘎┌▋?nèi)源性酶，如GPx、TrxR、過(guò)氧化氫酶(CAT)及血紅素加氧酶(HO)等。此外，非酶促抗氧化劑也是發(fā)揮抗氧化作用的重要部分，包括飼糧來(lái)源的微量礦物質(zhì)(硒、銅、鋅)、多酚、維生素(A、C、D和E)以及維生素A前體物β-胡蘿卜素[20]。酶和非酶抗氧化劑協(xié)同保護(hù)細(xì)胞免受自由基誘導(dǎo)的氧化損傷。硒是重要的飼糧抗氧化劑來(lái)源，可以通過(guò)直接的抗氧化作用以及增強(qiáng)免疫力來(lái)有效對(duì)抗氧化應(yīng)激，進(jìn)而預(yù)防奶牛疾病的發(fā)生[21]。研究表明，單獨(dú)補(bǔ)加硒可以降低產(chǎn)犢期奶牛乳房炎癥感染率并減少含較高體細(xì)胞數(shù)的乳區(qū)比例[22]，改善泌乳中期奶牛血液及牛奶中抗氧化及免疫指標(biāo)[4]。Warken等[23]給予圍產(chǎn)期奶牛亞硒酸鈉肌肉注射后發(fā)現(xiàn)，牛奶體細(xì)胞數(shù)及ROS含量下降，SOD活性顯著升高，緩解了奶牛氧化應(yīng)激。體外研究也得出了類(lèi)似的結(jié)果，硒可以促進(jìn)BMEC的抗氧化功能，SOD、GPx、TrxR、CAT等抗氧化酶活性升高，減緩了過(guò)量自由基誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激[4,24]，但其機(jī)制并不清楚。

2.2 減緩奶牛氧化應(yīng)激與炎癥反應(yīng)發(fā)生的機(jī)制

2.2.1 通過(guò)過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ/核因子相關(guān)因子E2(PPARγ/Nrf2)上調(diào)硒蛋白酶的表達(dá)

作為硒蛋白酶的組成成分，硒可以調(diào)節(jié)硒蛋白酶的活性，進(jìn)而保護(hù)機(jī)體組織免受氧化損傷，調(diào)節(jié)抗氧化與免疫功能等；其中，TrxR和GPx是奶牛相關(guān)研究較多的與抗氧化有關(guān)的硒蛋白。Weiss[25]總結(jié)發(fā)現(xiàn)，硒或酵母硒可以顯著提高紅細(xì)胞中GPx的活性，改善奶?？寡趸δ?。Guo等[8]研究也發(fā)現(xiàn)，硒代蛋氨酸可以促進(jìn)BMEC的生長(zhǎng)并上調(diào)硒蛋白TrxR1及GPx1基因及蛋白的表達(dá)。Nrf2是對(duì)氧化還原反應(yīng)敏感的轉(zhuǎn)錄因子，控制編碼多種抗氧化及細(xì)胞保護(hù)相關(guān)蛋白的基因轉(zhuǎn)錄，如GPx、TrxR、HO、SOD等酶的合成。正常生理狀態(tài)時(shí)，Nrf2被錨定在細(xì)胞漿內(nèi)處于抑制狀態(tài)；發(fā)生氧化應(yīng)激時(shí)，Nrf2移位入細(xì)胞核，啟動(dòng)下游抗氧化基因及一系列Ⅱ相解毒酶的轉(zhuǎn)錄，從而發(fā)揮強(qiáng)大的抗氧化作用[26]。Gessner等[27]研究表明，從奶牛妊娠后期到泌乳啟動(dòng)的過(guò)渡時(shí)期，由于抗氧化活性降低，激活內(nèi)源性調(diào)節(jié)，導(dǎo)致Nrf2靶基因的表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)了抗氧化酶的表達(dá)，以提高機(jī)體的抗氧化能力。奶牛肝臟中的未折疊蛋白反應(yīng)在這個(gè)時(shí)期被激活，導(dǎo)致Nrf2通過(guò)蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶通路被激活[28]，從而促進(jìn)了抗氧化酶的表達(dá)并提高了抗氧化能力。這種內(nèi)源性調(diào)節(jié)機(jī)制可能也解釋了過(guò)多的抗氧化劑補(bǔ)充反而會(huì)損害抗氧化能力的事實(shí)[26]，大量抗氧化劑可能通過(guò)過(guò)度抑制Nrf2激活損害機(jī)體抗氧化能力。本課題組的研究結(jié)果也表明，在氧化應(yīng)激條件下，添加硒可以激活Nrf2的表達(dá)，從而上調(diào)其下游TrxR等抗氧化酶的表達(dá)，抑制NO誘導(dǎo)的BMEC氧化損傷及炎癥反應(yīng)[14]。

PPARγ不僅是乳脂調(diào)控的重要轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)奶牛氧化應(yīng)激與炎癥反應(yīng)也起到了良好的保護(hù)調(diào)控作用。研究表明，PPARγ可以調(diào)節(jié)Nrf2，小鼠肺部Nrf2的表達(dá)在PPARγ抑制后顯著下降[29]。補(bǔ)加硒可以顯著增加BMEC內(nèi)PPARγ與Nrf2的表達(dá)，但PPARγ的抑制降低了Nrf2的基因表達(dá)，降低了TrxR、SOD和CAT等抗氧化酶的活性，iNOS活性和炎癥因子的含量呈相反的變化趨勢(shì)，因此降低了抗氧化功能；而且當(dāng)PPARγ被抑制，硒對(duì)NO過(guò)量誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化應(yīng)激的預(yù)保護(hù)作用被抑制[30]。因此，硒可以通過(guò)調(diào)控PPARγ/Nrf2進(jìn)而對(duì)機(jī)體起到良好的抗氧化保護(hù)作用。

2.2.2 通過(guò)PPARγ/GPx-核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)抑制過(guò)量NO的生成

NF-κB是參與免疫功能調(diào)控的重要信號(hào)通路，受到細(xì)菌、ROS、LPS等因素的刺激，NF-κB上的p65亞基就會(huì)與抑制蛋白解離，并經(jīng)移位后進(jìn)入到細(xì)胞核中，與靶基因上的相應(yīng)位點(diǎn)結(jié)合[31]。研究表明，脂多糖(LPS)顯著誘導(dǎo)BMEC中NO的過(guò)量產(chǎn)生，并激活了NF-κB信號(hào)通路[32]；然而，硒的添加顯著抑制了LPS誘導(dǎo)NF-κB的核轉(zhuǎn)錄，降低了NO及促炎因子的產(chǎn)生[33]。石惠宇[32]發(fā)現(xiàn)，添加白細(xì)胞介素-1(IL-1)受體拮抗劑可以抑制BMEC中iNOS的表達(dá)和NO的釋放，說(shuō)明了白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)對(duì)NO過(guò)量釋放的介導(dǎo)作用。過(guò)量NO誘導(dǎo)的奶牛外周血單個(gè)核細(xì)胞的氧化應(yīng)激引起NF-κB通路磷酸化水平增強(qiáng)，上調(diào)了腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IL-6和IL-1β等細(xì)胞因子的基因與蛋白表達(dá)，而IL-1β的釋放可以介導(dǎo)iNOS的表達(dá)，進(jìn)而引起氧化應(yīng)激[34]；核轉(zhuǎn)錄因子-κB p65(NF-κB p65)沉默后，iNOS的表達(dá)顯著下降，促進(jìn)了細(xì)胞抗氧化應(yīng)激能力，降低了炎癥因子的產(chǎn)生[35]。硒添加通過(guò)增強(qiáng)全血GPx1的活性緩解了母牛的炎癥反應(yīng)[23]。硒蛋白如TrxR和GPx可調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)相關(guān)信號(hào)通路，進(jìn)而抑制不可控炎癥誘發(fā)的免疫病理過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)，BMEC中GPx1的過(guò)表達(dá)可以下調(diào)NF-κB p65活性及核易位，抑制其磷酸化激活[32]。相反地，GPx1基因沉默后，激活了BMEC中NF-κB信號(hào)通路，增加了下游炎癥因子的活性及基因表達(dá)量，iNOS活性及其基因表達(dá)與NO的生成量增加，細(xì)胞的抗氧化功能降低[30]。NF-κB信號(hào)通路的活化及核轉(zhuǎn)錄也可以通過(guò)過(guò)表達(dá)GPx4進(jìn)行抑制[36]。這些研究結(jié)果說(shuō)明，硒通過(guò)GPx-NF-κB減緩了奶牛乳腺氧化應(yīng)激及炎癥的發(fā)生。NF-κB通路還受到PPARγ的調(diào)節(jié)，當(dāng)PPARγ被抑制，NF-κB信號(hào)通路激活，下游IL-1β等炎癥因子及iNOS表達(dá)量升高，NO含量增加，導(dǎo)致氧化應(yīng)激水平升高；然而，硒的添加逆轉(zhuǎn)了上述氧化損傷，這說(shuō)明硒通過(guò)PPARγ/GPx-NF-κB抑制了過(guò)量NO的生成，減緩了奶牛乳腺氧化應(yīng)激的發(fā)生[30]。

2.2.3 通過(guò)TrxR-絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)/NF-κB途徑抑制過(guò)量NO的生成

TrxR、Trx及NADPH構(gòu)成了硫氧還蛋白系統(tǒng)[5]，其中Trx具有氧化型(Trx-S2)和還原型[Trx(SH)2]2種形式，其氧化還原調(diào)節(jié)功能是通過(guò)二硫鍵和巰基的互變來(lái)實(shí)現(xiàn)的[37]。研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)充有機(jī)硒可增強(qiáng)奶牛血液中硒蛋白TrxR的活性[4]，上調(diào)BMEC中TrxR的基因表達(dá)及其酶活性，抑制LPS誘導(dǎo)的BMEC內(nèi)TNF-α、IL-1、白細(xì)胞介素-6(IL-6)的蓄積[38]。研究表明，TrxR1活性受到抑制后，iNOS的蛋白表達(dá)顯著增加，其活性也伴隨增加，進(jìn)而誘導(dǎo)NO的過(guò)量產(chǎn)生[39]，并進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為毒性更強(qiáng)的過(guò)氧亞硝酸陰離子(ONOO-)[40]。siRNA靶向沉默TrxR基因表達(dá)試驗(yàn)也進(jìn)一步說(shuō)明了硒蛋白TrxR對(duì)BMEC及奶牛內(nèi)皮細(xì)胞過(guò)氧化損傷的保護(hù)作用[39,41]。這提示硒通過(guò)促進(jìn)TrxR活性下調(diào)了下游炎癥因子及NO的過(guò)量產(chǎn)生。

MAPK家族包括p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)和細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(ERK1/2)，也是重要的與氧化還原密切相關(guān)的通路。H2O2、細(xì)胞因子及其他應(yīng)激因素導(dǎo)致的激活蛋白-1的激活主要受到JNK及p38MAPK通路的調(diào)節(jié)[42]。細(xì)胞凋亡信號(hào)激酶-1(ASK-1)是MAPK信號(hào)通路的中間體，可以激活下游促炎癥和促凋亡細(xì)胞信號(hào)級(jí)聯(lián)，哺乳動(dòng)物Trx(SH)2是ASK-1激酶的活性抑制劑，也是依賴(lài)ASK-1表達(dá)的基因的負(fù)調(diào)節(jié)因子[43]，兩者之間具有高度的依賴(lài)性。Trx(SH)2與ASK-1的N端區(qū)域結(jié)合，抑制其活性，當(dāng)BMEC發(fā)生氧化應(yīng)激時(shí)，TrxR活性下降，ASK-1被激活，進(jìn)而導(dǎo)致p38MAPK和JNK磷酸化，通路活性被激活[16]。MAPK信號(hào)通路的激活可以進(jìn)一步誘導(dǎo)NF-κB通路的活化，進(jìn)而促使IL-1β等炎癥因子的大量產(chǎn)生，導(dǎo)致NO等自由基的大量釋放；過(guò)量釋放的自由基反過(guò)來(lái)又誘導(dǎo)MAPK信號(hào)通路的激活，并刺激NF-κB的進(jìn)一步活化，形成惡性循環(huán)，最終誘發(fā)不可控的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致機(jī)體損傷[44]。然而，硒的添加可以抑制金黃色葡萄球菌或過(guò)量NO誘導(dǎo)的BMEC內(nèi)p38MAPK、JNK、ERK1/2以及NF-κB的激活，進(jìn)而下調(diào)炎癥因子的表達(dá)[14,45]。研究表明，SB203580、SP600125分別抑制了由DNCB引起的p38MAPK、JNK信號(hào)通路的磷酸化水平的升高，抑制了其通路活性，IL-1的生成及其基因表達(dá)顯著下降，降低了NO的生成；相反，過(guò)表達(dá)TrxR1基因顯著降低了p38MAPK、JNK通路的基因表達(dá)與磷酸化水平及其下游IL-1β和iNOS的基因與蛋白表達(dá)，減緩了NO誘導(dǎo)的氧化損傷[39]。這些研究結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明，硒通過(guò)促進(jìn)TrxR1的表達(dá)，抑制了MAPK信號(hào)通路的激活，減緩了NO誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化損傷。

2.2.4 通過(guò)TrxR-MAPK/硒蛋白-LOX/COX調(diào)節(jié)ARA

ARA的大量釋放也與細(xì)胞氧化應(yīng)激密切相關(guān)。ARA通常以磷脂的形式存在于細(xì)胞膜上，在磷脂酶C、磷脂酶A2(PLA2)2種酶的催化作用下，分解為游離的ARA[46]。研究發(fā)現(xiàn)，二硝基氯苯抑制TrxR活性后，MAPK信號(hào)通路中ASK-1的活性及其下游p38MAPK和JNK的磷酸化水平顯著加強(qiáng)，通路下游底物cPLA2被磷酸化激活，促進(jìn)了ARA的釋放，過(guò)多的ARA會(huì)誘導(dǎo)BMEC中ROS的蓄積[47]。而硒的添加使BMEC中TrxR活性顯著升高，逆轉(zhuǎn)了二硝基氯苯誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激及對(duì)TrxR的抑制作用，Trx(SH)2與ASK-1結(jié)合阻礙了MAPK通路的進(jìn)一步激活及下游cPLA2誘導(dǎo)的ARA及其相關(guān)代謝產(chǎn)物在BMEC中的過(guò)量蓄積[47]。ARA經(jīng)LOX、COX、細(xì)胞色素P450單氧化酶、非酶氧化4條途徑分別代謝生成不同的具有生物活性的代謝產(chǎn)物，包括前列腺素、血栓素A2、白三烯等[48]。5-LOX和白三烯A4水解酶是ARA代謝產(chǎn)生類(lèi)花生四烯酸的2個(gè)限速酶，硒可以下調(diào)上述2個(gè)限速酶進(jìn)而減少類(lèi)花生酸類(lèi)物質(zhì)的產(chǎn)生，從而降低其促炎作用[49]。某些硒蛋白，如GPx1、GPx4可以調(diào)節(jié)COX/LOX的表達(dá)，進(jìn)而有效控制細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)[50-51]。因此，硒還可以通過(guò)調(diào)節(jié)硒蛋白的表達(dá)調(diào)節(jié)ARA的代謝，以緩解氧化應(yīng)激。

3 小 結(jié)

本文從硒蛋白、Nrf2、MAPK及NF-κB信號(hào)通路4個(gè)方面論述了硒對(duì)奶牛乳腺氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)的緩解作用及其機(jī)制。從妊娠到泌乳的過(guò)渡期，奶牛需要適應(yīng)機(jī)體快速代謝，在飼糧中補(bǔ)加硒是奶牛代謝需求增加時(shí)增強(qiáng)抗氧化防御機(jī)制及免疫功能并維持健康的重要手段。然而，對(duì)于多種硒蛋白及其他中間硒代謝物在乳腺氧化應(yīng)激反應(yīng)和宿主免疫中的作用以及信號(hào)通路間的相互作用知之甚少，還需要進(jìn)一步探究。