朱 智 紀邑奇 黃文明 左福元

(西南大學動物科學技術(shù)學院，西南大學醫(yī)學研究院免疫學研究中心，重慶市肉牛工程技術(shù)研究中心，重慶 402460)

近年來，在集約化養(yǎng)殖中，為了提高生產(chǎn)效率而大量飼喂以谷物淀粉為主要能量飼料的高精料飼糧，其大量使用也提高了代謝性疾病的發(fā)病率。亞急性瘤胃酸中毒(subacute ruminal acidosis，SARA)是反芻動物生產(chǎn)中一種最常見的消化紊亂疾病，是由于飼喂過量的高度可發(fā)酵碳水化合物和不足的膳食粗纖維引起的[1]。SARA的后果包括采食量、纖維消化率和乳脂率降低，腹瀉、蹄葉炎、肝臟膿腫和細菌內(nèi)毒素增加，炎癥方面表現(xiàn)為急性期蛋白增加[2]。由于我國優(yōu)質(zhì)粗飼料的資源缺乏，而且質(zhì)量普遍較差，生產(chǎn)者為了追求較高的生產(chǎn)性能，生產(chǎn)中不得不大量使用富含淀粉的谷物精料來滿足動物的營養(yǎng)需要，致使動物對優(yōu)質(zhì)纖維的攝入不足，高產(chǎn)奶牛和強度育肥牛羊發(fā)生酸中毒的情況普遍存在。SARA的發(fā)生已經(jīng)成為制約我國牛羊生產(chǎn)的重要因素之一。

丁酸(butyrate)又稱酪酸，具有腐臭的酸味。丁酸是瘤胃或大腸中主要的揮發(fā)性脂肪酸(volatile fatty acids，VFA)之一，占總VFA的10%～20%[3]。飼喂高谷物飼糧或增加丁酸比例時，瘤胃液pH降低，總VFA和丁酸濃度或比例增加[4-7]。相對于酸中毒易感牛，耐酸中毒牛的瘤胃液pH和丁酸濃度增加，總VFA濃度降低，而采食量沒有顯著變化[8]。活體試驗表明，丁酸或丁酸鹽能夠促進瘤胃上皮細胞的發(fā)育，增加乳頭的表面積[9-12]，增強VFA攝取和代謝相關(guān)基因和蛋白的表達[11-15]，以及改善高精料飼糧對上皮屏障功能的損害和誘導的炎癥[16-17]。細胞培養(yǎng)研究表明，丁酸作為一種信號分子上調(diào)參與短鏈脂肪酸(short chain fatty acids，SCFA)及代謝物轉(zhuǎn)運的基因表達[18-19]。丁酸可以通過激活G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptor，GPR)[20-23]，或與β-羥丁酸作為組蛋白去乙?；?histone deacetylase，HDAC)抑制劑[21-22,24-26]，在生物進程中發(fā)揮著廣泛作用，如引起細胞凋亡和增殖、改變基因表達和調(diào)節(jié)機體免疫。本文綜述了丁酸或其鹽類對反芻動物的影響，探討丁酸在SARA發(fā)生中可能存在的保護作用機制。

1 SARA的定義和發(fā)病機制

1.1 定義

由于SARA臨床癥狀表現(xiàn)不明顯，研究者多數(shù)采用瘤胃液pH或乳酸濃度的變化進行界定。SARA是瘤胃環(huán)境pH處于5.0～5.5、總VFA濃度升高、VFA比例向丙酸和丁酸轉(zhuǎn)移、瘤胃液中累積乳酸濃度不超過5～10 mmol/L時的狀態(tài)[27]。反芻動物發(fā)生SARA時瘤胃液pH的閾值設(shè)定不一。瘤胃液pH 5.5可以作為衡量SARA發(fā)生的閾值[2]，也有學者將瘤胃液pH閾值定為5.8[28]。Duffield等[29]建議，通過瘤胃穿刺、腹囊處瘤胃瘺管、胃插管獲得的瘤胃液測定的用于預測SARA的pH閾值分別為5.5、5.8、5.9。多數(shù)研究采用連續(xù)動態(tài)監(jiān)測瘤胃液pH的變化以及pH低于某個閾值所持續(xù)的時間長短綜合判斷SARA的發(fā)生。瘤胃液pH低于5.6并且每天持續(xù)時間不低于3 h可以界定為發(fā)生SARA[1,13]，也有學者以瘤胃液pH低于5.8且持續(xù)時間不少于3 h/d為標準[5]。瘤胃液pH處于波動之中，采樣時間會影響pH。因此，通過閾值對SARA界定，在增加持續(xù)時間的基礎(chǔ)上，需要反映取樣時間以更加準確地定義SARA。

1.2 發(fā)病機制

1.2.1 有機酸中毒

高谷物飼糧(易發(fā)酵碳水化合物)在瘤胃中被微生物劇烈發(fā)酵，產(chǎn)生大量有機酸。研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)生SARA的瘤胃內(nèi)乳酸積累較少甚至沒有[4,28,30]，而VFA濃度較高，在100 mmol/L以上[31]。瘤胃液pH是由瘤胃液中的質(zhì)子濃度決定的，它依賴于飼糧發(fā)酵提供質(zhì)子與質(zhì)子消除之間的平衡狀態(tài)。據(jù)估計，大約37%的質(zhì)子在瘤胃中被唾液緩沖液中和，7%的質(zhì)子向后段腸道轉(zhuǎn)移而消失，剩下超過50%的質(zhì)子被瘤胃上皮細胞吸收或上皮細胞分泌的緩沖液中和而清除[32]。瘤胃內(nèi)過量VFA超過緩沖能力和上皮吸收能力，會導致VFA的大量累積，進而降低pH。多數(shù)學者認為，SARA是由VFA在瘤胃內(nèi)過量蓄積所導致的[4,28,30]。

1.2.2 內(nèi)毒素與生物胺中毒

脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)作為內(nèi)毒素主要的抗原性和致病性部分，與革蘭氏陰性菌表面結(jié)合十分緊密，當細菌快速生長或死亡裂解時會被釋放出來。發(fā)生SARA后瘤胃菌群最明顯的變化是革蘭氏陰性菌擬桿菌門數(shù)量下降，推測瘤胃內(nèi)LPS主要源于死亡的擬桿菌，但是擬桿菌LPS毒性低于大腸桿菌或其他腸桿菌科細菌[33]。飼喂高谷物飼糧時，瘤胃[16,34-36]、門靜脈和肝靜脈[31,35-37]以及回腸和盲腸[38-40]中LPS濃度顯著升高。SARA發(fā)生期間低pH的生理環(huán)境會造成瘤胃上皮損傷，并對上皮細胞的選擇性通透造成嚴重影響，使得大量內(nèi)毒素透過瘤胃上皮進入血液，形成內(nèi)毒素血癥[2]。SARA發(fā)生時低pH環(huán)境使瘤胃黏膜發(fā)炎、損傷、網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)受損，使得解毒機能大大降低；長期的酸性環(huán)境引起革蘭氏陰性菌大量死亡，釋放的大量內(nèi)毒素容易通過受損的瘤胃上皮移位進入血液，觸發(fā)系統(tǒng)性炎癥反應。

生物胺是一類低分子質(zhì)量、堿性含氮化合物，在瘤胃中是由氨基酸前體經(jīng)微生物酶發(fā)生脫羧反應，或者由醛類、酮類化合物經(jīng)胺化而生成，如組胺、酪胺、腐胺、甲胺和色胺等。正常瘤胃液中組胺濃度很低，瘤胃上皮存在對組胺的分解和分泌過程，完整的上皮組織對組胺的通透性很低，有效限制了機體對組胺的吸收[41]。飼喂高精料可改變氨基酸代謝模式，致使瘤胃內(nèi)組胺、酪胺、腐胺、甲胺等生物胺含量顯著升高[5,42-43]。組胺不直接影響瘤胃上皮的通透性，而是通過受損的上皮吸收入血，避免了在上皮組織中的分解代謝，而屏障受損主要是由低pH環(huán)境造成的[44]。在高精料飼喂反芻動物的瘤胃中也發(fā)現(xiàn)乙醇和乙醇胺濃度顯著升高[42-43]。高濃度乙醇會損害腸道黏膜屏障，進而增加細菌毒素的轉(zhuǎn)運[45]。乙醇胺可作為細菌的碳源或氮源，包括致病菌沙門氏菌、埃希氏菌屬等，促進致病菌的定植和致病作用[46]。長期低pH環(huán)境引起瘤胃微生物區(qū)系發(fā)生改變，產(chǎn)生大量內(nèi)毒素、生物胺等有害物質(zhì)，同時損傷上皮的黏膜屏障，進而增加有害物質(zhì)吸收入血，進一步加重SARA的發(fā)展。因此，有機酸、內(nèi)毒素和生物胺相互聯(lián)系、共同作用引起SARA的發(fā)生發(fā)展。

2 丁酸對瘤胃的影響

2.1 對瘤胃發(fā)酵的影響

瘤胃是反芻動物主要的消化吸收和代謝場所。飼糧被微生物發(fā)酵產(chǎn)生VFA，主要成分乙酸、丙酸、丁酸的比例為75∶15∶10～40∶40∶20，主要受飼糧組成和飼喂時間的影響[3]。丁酸鈉可以影響瘤胃VFA濃度和組成。高精料飼糧中添加丁酸鈉增加了瘤胃液總VFA、丁酸和丙酸的濃度[16]。新生羔羊口服丁酸鈉增加了瘤胃液總VFA、丁酸濃度和摩爾比例[12]。灌注不同劑量的丁酸鈉，發(fā)現(xiàn)奶牛瘤胃總VFA和丁酸濃度線性增加，丙酸濃度二次曲線增加，而乙酸濃度不受影響[47]。研究瘤胃發(fā)酵進程時發(fā)現(xiàn)，灌注丁酸鈉1.0 h后丁酸濃度顯著增加，乙酸和丙酸濃度顯著降低，2.5 h后乙酸和丙酸濃度恢復到灌注前水平，而丁酸濃度在2.5 h之前仍顯著升高，3.5 h時才恢復到灌注前水平，總VFA濃度在不同時間點均沒有顯著變化[11]。瘤胃中乙酸和丙酸濃度的減少可能是由于丁酸對微生物的抑制作用[48]，或者是丁酸促進了瘤胃上皮對乙酸和丙酸的吸收[10]。

丁酸鹽對瘤胃液pH影響小，或者可以改善pH環(huán)境。羔羊口服丁酸鈉對瘤胃液pH沒有顯著影響[12]。在誘導奶牛出現(xiàn)SARA的飼糧中添加丁酸鹽，導致瘤胃液最低pH升高，但平均pH、最高pH和pH低于5.6的持續(xù)時間不受影響[49]。也有研究表明，高精料飼糧中添加丁酸鈉具有改善瘤胃液pH的作用[16-17,36]。Zhang等[17]認為，丁酸鈉水溶液的堿性特點可能是誘導pH升高的原因。瘤胃液pH是通過酸的產(chǎn)生與清除之間的平衡來維持[32]。因此，高比例易發(fā)酵碳水化合物或者大量添加外源丁酸導致瘤胃中高濃度的丁酸可能會降低瘤胃液pH，并對瘤胃發(fā)酵不利。

2.2 對微生物區(qū)系的調(diào)控作用

丁酸對瘤胃微生物區(qū)系產(chǎn)生深遠影響。Li等[48]向奶牛瘤胃中連續(xù)灌注丁酸(168 h，12.5 mol/d)，72 h時即引起瘤胃4個門類細菌、19個屬類細菌、43個操作分類單元的數(shù)量發(fā)生顯著變化，如擬桿菌門數(shù)量顯著降低和硬壁菌門數(shù)量顯著增加。Shen等[50]連續(xù)灌注丁酸鈉(28 d，0.3 g/kg體重)顯著降低了山羊瘤胃中硬壁菌門與擬桿菌門數(shù)量。微生物區(qū)系的不同反應可能與丁酸的灌注劑量和灌注時間有關(guān)。硬壁菌門和擬桿菌門分別是主要的革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌，在瘤胃微生物群落中占80%～90%[43,48,50-51]。添加丁酸鹽顯著降低瘤胃液LPS濃度[16,36]，或者趨于降低LPS濃度[49]，這可能與丁酸對微生物區(qū)系的影響有關(guān)，如作為革蘭氏陰性菌的擬桿菌門。丁酸被認為是平衡細菌生長的信號分子[52]。丁酸濃度的升高似乎對丁酸產(chǎn)生菌具有刺激作用[48]。丁酸鈉導致細菌區(qū)系由丁酸產(chǎn)生菌向乙酸產(chǎn)生菌和丙酸產(chǎn)生菌轉(zhuǎn)變，這種變化可能是微生物群用來維持瘤胃中主要VFA穩(wěn)定比例的一種策略[50]。Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)在塑造消化道微生物的組成中起著重要作用，丁酸可能通過影響上皮中TLR信號變化(如TLR2和TLR5基因表達)來影響微生物組成[50]。飼喂高谷物飼糧或出現(xiàn)SARA時，瘤胃出現(xiàn)了大量丁酸產(chǎn)生菌[43,51]。瘤胃內(nèi)容物中總菌16S rRNA基因拷貝數(shù)與丁酸比例在耐酸中毒牛和酸中毒易感牛中分別存在正相關(guān)(r=0.74)和負相關(guān)關(guān)系(r=-0.73)，丁酸產(chǎn)生菌的數(shù)量和活力在耐酸中毒牛中高于酸中毒易感牛[53]。因此，關(guān)于微生物菌群尤其是丁酸產(chǎn)生菌數(shù)量和功能的研究有助于闡明微生物在SARA發(fā)生中的作用和機制。

2.3 對瘤胃上皮的影響

2.3.1 對上皮功能的影響

瘤胃發(fā)酵產(chǎn)生的大量VFA通過瘤胃上皮吸收，為機體提供70%以上的能量需要，而瘤胃乳頭能夠促進其吸收。如果瘤胃乳頭上皮細胞增殖嚴重不足，會導致角化不全，相應地引起VFA吸收降低以及上皮易于損壞和感染。灌注乙酸、丙酸和丁酸可以刺激上皮的生長與發(fā)育，其中丁酸的作用最顯著，其次是丙酸[54-55]。丁酸被認為是瘤胃上皮發(fā)育的主要刺激物，可能與瘤胃壁代謝丁酸供能直接相關(guān)，因為丁酸是上皮中吸收最廣泛且很大程度上被代謝的VFA，其能值也高于丙酸和乙酸[56]。多項研究表明，丁酸或丁酸鹽能夠促進瘤胃上皮增殖，增加乳頭大小和表面積，進而增強VFA吸收[9-12]。丁酸是瘤胃細胞凋亡的特異性抑制劑，通過減少細胞凋亡來刺激黏膜發(fā)育[54]。丁酸增強瘤胃上皮細胞的增殖，同時垂死或死亡細胞的比例也增加[9]。Soomro等[11]發(fā)現(xiàn)，丁酸鈉似乎僅刺激快速增殖過程中產(chǎn)生的不需要或有缺陷的細胞的凋亡，引起增殖速率高于凋亡速率，共同調(diào)控上皮細胞的增殖和凋亡。丁酸對前胃的分化和成熟至關(guān)重要，但是過量的丁酸可能是有毒的，尤其是在體內(nèi)低pH的情況下[52]。高淀粉飼糧中VFA的過度產(chǎn)生以及丁酸濃度的大量增加會破壞瘤胃上皮緊密連接，改變瘤胃選擇性通透，高滲透壓和低瘤胃pH導致上皮的屏障功能受損，進而降低VFA的吸收[34,57]。因此，適當提高瘤胃丁酸水平，促進瘤胃上皮細胞增殖，增加乳頭表面積和VFA吸收，進而可以在一定程度上增強SARA的耐受程度。

丁酸產(chǎn)品也常用于促進瘤胃發(fā)育，改善瘤胃上皮的吸收和屏障功能。向飼喂不同營養(yǎng)水平的閹公牛瘤胃中灌注丁酸，瘤胃乳頭的長度、寬度和表面積均增加了20%～40%[9]。高精料對上皮角質(zhì)層破壞嚴重，而添加丁酸鈉的瘤胃上皮保持完整，盡管上皮中也有一些炎癥細胞募集，但其數(shù)量比高精料組少得多，表明丁酸鈉可以減輕高精料引起的瘤胃上皮的局部炎癥和破壞，并保護上皮完整性[16]。類似研究顯示，丁酸鈉可以改善高精料飼糧對山羊瘤胃上皮屏障功能的損害[17]。代乳粉中添加丁酸鈉有助于新生犢牛增重、健康和代謝產(chǎn)物的生成，并間接刺激瘤胃發(fā)育，而開食料中添加甘油三酯包被丁酸鈉直接刺激了瘤胃發(fā)育[58]?？诜∷徕c的新生羔羊表現(xiàn)出更高的排空瘤胃重量，更大的瘤胃乳頭長度、寬度和表面積，以及更大的角質(zhì)層和總上皮厚度[12]。Aschenbach等[59]指出，在斷奶犢牛中使用丁酸促進了瘤胃屏障的發(fā)育，但是在發(fā)育完全的成年牛中過量添加丁酸可能會促進瘤胃過度角化、角化不全和上皮損傷。吳東霖等[60]推薦在哺乳期開食料中添加不包被丁酸鈉(0.3%～1.0%干物質(zhì))，在生長期飼糧中添加包被丁酸鈉，而且丁酸鈣的使用效果不及丁酸鈉。因此，丁酸對瘤胃上皮細胞的增殖作用是可變的，不僅與丁酸劑量有關(guān)，也與丁酸來源(丁酸鹽或丁酸酯)、添加形式(受保護或未保護)、添加方法(液體飼料中或固體飼料中)和動物的生理狀態(tài)有關(guān)。

活體試驗條件下丁酸促進了瘤胃上皮的發(fā)育，但是體外細胞培養(yǎng)的研究結(jié)果卻相反。兩者的不同結(jié)果可能與對丁酸及代謝產(chǎn)物反應的激素介質(zhì)有關(guān)。細胞培養(yǎng)條件下，丁酸會抑制瘤胃上皮細胞的生長，當加入生長因子[如胰島素、胰島素樣生長因子-1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)、表皮生長因子]時可以克服丁酸對細胞生長的抑制作用[61]。瘤胃上皮細胞的培養(yǎng)研究也證實了IGF-1能夠促進細胞的DNA合成和增殖[62]。細胞培養(yǎng)試驗發(fā)現(xiàn)，丁酸鈉增加了瘤胃上皮細胞G0～G1期的細胞比例，降低了S期和G2～M期的細胞比例，表明丁酸有利于上皮細胞處于靜止期，抑制細胞增殖，同時發(fā)現(xiàn)IGF-1增強了上皮細胞的增殖，并且與丁酸鈉具有協(xié)同作用[63]。在研究丁酸對瘤胃上皮生長和分化的調(diào)控作用時，出現(xiàn)了血漿中一些激素介質(zhì)的增加，如胰島素、IGF-1和IGF-1受體[12,47]，以及胰高血糖素樣肽(glucagon-like peptide，GLP)-2[47,58]。不同VFA具有在生理環(huán)境(pH 6.1)下形成緊密上皮屏障的潛力，但是高濃度丁酸(30 mmol/L)可能有不利影響，而在酸性環(huán)境(pH 5.1)下VFA均具有損害瘤胃上皮完整性的作用，丁酸濃度增加后損害更嚴重[64]。丁酸濃度的大幅度增加會降低瘤胃上皮的選擇性通透，導致屏障功能受損[57]。因此，丁酸對上皮細胞生長的調(diào)控作用不僅與生長因子(受丁酸及其代謝產(chǎn)物的調(diào)控)刺激的細胞生殖有關(guān)，也與丁酸濃度、pH、細胞分化狀態(tài)有關(guān)。

2.3.2 對上皮基因和蛋白的影響

作為細胞分子，丁酸誘導著瘤胃上皮細胞約65%基因的轉(zhuǎn)錄水平[24]。連續(xù)灌注28 d丁酸鈉，灌注后5 h時瘤胃上皮中細胞周期蛋白(Cyclin)D1、細胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinase，CDK)2、CDK4和CDK6(細胞G0/G1期調(diào)節(jié)劑)，7 h時CyclinE1(細胞G1/S期調(diào)節(jié)劑)，以及9 h時CyclinA1和CDK1(細胞S期調(diào)節(jié)劑)的mRNA表達增強，此外凋亡基因[如含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-3、Caspase-9和B淋巴細胞瘤-2相關(guān)X蛋白(Bax)]的mRNA表達在灌注后5 h上調(diào)，表明丁酸通過時間依賴性地改變參與細胞增殖和凋亡的基因表達來改善上皮生長[11]。丁酸鈉通過增加瘤胃上皮增殖相關(guān)基因(如CyclinA2、CyclinD1和CDK6)、降低上皮細胞凋亡相關(guān)基因(如Caspase-3和Bax)以及影響內(nèi)分泌相關(guān)基因[如IGF-1受體、胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白-3(insulin-like growth factor binding protein，IGFBP)-3、IGFBP-5]的mRNA表達，促進瘤胃乳頭的生長發(fā)育[12]。單羧酸共轉(zhuǎn)運蛋白(monocarboxylate cotransporter isoform，MCT)1和鈉/氫交換蛋白(sodium/hydrogen exchanger isoform，NHE)3參與質(zhì)子輸出細胞外，而鈉/碳酸氫鹽共轉(zhuǎn)運蛋白1(sodium/bicarbonate cotransporter isoform 1，NBC1)參與碳酸氫鹽輸入細胞內(nèi)[65]。細胞培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)丁酸上調(diào)瘤胃上皮細胞中MCT1和MCT4的mRNA表達，這些基因在VFA及其代謝產(chǎn)物的轉(zhuǎn)運中發(fā)揮作用[18-19]。Liu等[12]也發(fā)現(xiàn)丁酸鈉增強了瘤胃上皮VFA攝取[如MCT1、NHE2、腺瘤下調(diào)(downregulated in adenoma，DRA)]與VFA代謝相關(guān)基因的mRNA表達。然而，Malhi等[15]研究顯示，灌注丁酸鈉3 h后瘤胃上皮中cyclinD1的mRNA表達增加，7 h時恢復至灌注前水平，而CDK4和MCT1、MCT4的mRNA表達沒有隨著灌注時間發(fā)生變化，推測cyclinD1轉(zhuǎn)錄的瞬時增加有助于丁酸誘導的乳頭生長，并隨后導致VFA吸收增加。SARA發(fā)生期間，添加丁酸鹽增加瘤胃上皮基底膜外側(cè)MCT1的蛋白表達來促進VFA攝取入血，降低NBC1的蛋白表達來減少基底外側(cè)碳酸氫鹽攝入細胞，而NBC1降低碳酸氫鹽攝入有助于緩解MCT1增加的風險，因為MCT也能從細胞液中釋放質(zhì)子而使細胞內(nèi)呈堿性[14]。瘤胃上皮細胞中MCT1、NHE1和NHE2以及陰離子交換劑[DRA和假定陰離子轉(zhuǎn)運蛋白1(putative anion transporter 1，PAT1)]的mRNA表達沒有差異，但是耐酸中毒牛中NHE3的mRNA表達比酸中毒敏感牛高176%，判斷耐酸中毒牛的高瘤胃液pH可能部分是由于VFA吸收速度更快、VFA產(chǎn)生較低或兩者兼有[8]。因此，外源丁酸可以改變瘤胃上皮中基因/蛋白的表達，影響上皮的生長發(fā)育和膜轉(zhuǎn)運蛋白的可塑性，進而增強VFA吸收和改善瘤胃液pH。

RNA-seq研究顯示，灌注丁酸72 h后即導致緊密連接蛋白[(tight junction protein 3，TJP3)和封閉蛋白(claudin)]以及連接黏附分子(junctional adhesion molecule，JAM)2和JAM3的mRNA表達增加，這些基因在維持和/或恢復屏障功能中可能起重要作用[66]。Dionissopoulos等[49]發(fā)現(xiàn)丁酸影響參與非特異性宿主防御、基質(zhì)重塑或適應以及免疫應答相關(guān)基因的表達。宿主組織的TLR能夠識別細菌的副產(chǎn)物，觸發(fā)宿主先天免疫應答，促進上皮細胞增殖和屏障功能。瘤胃乳頭中TLR2和TLR4在耐酸中毒牛中的mRNA表達高于酸中毒敏感牛，表明耐酸中毒牛的先天性免疫反應高于酸中毒敏感牛[53]。丁酸鈉可以增加瘤胃上皮中TLR2和TLR5的mRNA表達，降低白細胞介素(interleukin，IL)-1β和干擾素-γ(interferon-gamma，IFN-γ)的mRNA表達，而TLR信號傳導可以抑制促炎性細胞因子的產(chǎn)生[50]。類似報告顯示，高精料中添加丁酸鈉降低瘤胃促炎細胞因子[如IL-1β、IL-8、IL-10、TLR4、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)]的mRNA表達，以及降低核因子-κB(NF-κB)(p65和磷酸化p65)、IL-1β、IL-6和TNF-α的蛋白表達，降低外周血中IL-1β、IL-6和TNF-α濃度，其水平與低精料飼糧組相似，表明丁酸鈉可以減輕高精料飼糧引起的瘤胃上皮的局部炎癥和破壞，從而保護上皮的完整性和屏障功能[16]。Zhang等[17]發(fā)現(xiàn)，在誘導山羊出現(xiàn)SARA的高精料飼糧中添加丁酸鈉降低了蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)活性和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路中部分基因的mRNA表達和磷酸化蛋白水平，表明丁酸鈉可以通過抑制PKC和MAPK信號通路來逆轉(zhuǎn)瘤胃上皮緊密連接的損傷。丁酸鈉可以通過MAPK路徑調(diào)控細胞的增殖[67]。在出現(xiàn)SARA的奶牛飼糧中添加丁酸鹽顯著增加糖酵解和氧化磷酸化相關(guān)基因的mRNA表達，降低脂肪生成相關(guān)基因的mRNA表達，推斷丁酸能夠促進瘤胃上皮的能量動員，進而阻止因SARA造成的能量應激[13]。丁酸對飼喂高精料飼糧的反芻動物瘤胃上皮具有保護和免疫增強作用，可以緩解SARA帶來的風險。

GPR是可以通過SCFA特異性識別的跨膜受體，它的激活可以引起多種轉(zhuǎn)錄因子的活化。丁酸激活GPR，特別是GPR41、GPR43和GPR109A，在代謝、炎癥和疾病的調(diào)節(jié)中起著重要作用[20]。RNA-seq研究發(fā)現(xiàn)，丁酸誘導的一些獨特表達的基因參與了一些經(jīng)典路徑，如GPR介導的信號傳導[21]。蛋白質(zhì)乙?；诖x的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮著主要作用，乙酰基團可由HDAC催化而去除，導致DNA變得緊密結(jié)合，進而影響臨近基因的表達。丁酸和β-羥丁酸被認為是HDAC抑制劑，在許多基因的啟動子上誘導組蛋白乙?；?，調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，其中涉及多個信號通路，如IFN-γ、TNF-α和NF-κB信號通路[21,24-26]，以及Janus激酶/信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子(JAK/STAT)和p38/胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)-MAPK信號通路[67-68]。丁酸通過抑制HDAC導致叉頭盒蛋白3(forkhead box protein 3，F(xiàn)OXP3)基因的保守非編碼序列區(qū)域中組蛋白H3的乙?；黾?，從而增強FOXP3的表達，促進調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cell，Treg細胞)的增殖分化，進而增強免疫和抗炎作用[69]。研究發(fā)現(xiàn)，GPR和HDAC調(diào)節(jié)的基因網(wǎng)絡(luò)主要與維持上皮完整性和促進動物生長有關(guān)，丁酸摩爾比例與HDAC1的mRNA表達呈負相關(guān)，梭菌屬(Clostridum)_Ⅳ細菌豐度與GPR1的mRNA表達呈正相關(guān)，表明微生物源的SCFA對上皮細胞生長和代謝的影響是由GPR和HDAC介導的[22]。丁酸通過影響GPR和HDAC發(fā)揮的調(diào)控作用已成為研究熱點。

3 丁酸對小腸的影響

小腸是消化道內(nèi)的重要器官，主要參與營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收。大量可發(fā)酵碳水化合物進入后段腸道，可引發(fā)后腸酸中毒，其特征是SCFA(包括乳酸)的產(chǎn)生速率增加、消化液pH降低以及腸上皮受損[70]。丁酸不僅是一種重要的營養(yǎng)素，為腸上皮細胞提供能量，促進腸道發(fā)育，抑制病原菌生長，并通過多種機制在上皮細胞中充當細胞介質(zhì)，參與基因調(diào)節(jié)、免疫調(diào)節(jié)、細胞分化、腸屏障調(diào)節(jié)、氧化應激、腹瀉控制等生理作用[71]。代乳粉(丁酸鈉晶體)和開食料(丁酸鈉的三酰甘油膠囊)中添加丁酸鈉均會促進新生小牛的小腸發(fā)育，其中代乳粉中添加效果更明顯[72]。新生犢牛代乳粉中添加丁酸鈉促進了腸道的發(fā)育成熟，如增加絨毛長度和寬度，增強黏膜厚度[73-74]。吳東霖等[60]總結(jié)了在幼齡反芻動物中添加丁酸的效果，發(fā)現(xiàn)丁酸能夠促進小腸細胞分裂，減少凋亡，刺激腸道絨毛發(fā)育。毒素誘導的急性肝衰竭小鼠的腸通透性顯著增加，經(jīng)過丁酸鈉處理12或24 h后，腸通透性得到顯著改善，血清內(nèi)毒素含量顯著降低[75]。Peng等[76]發(fā)現(xiàn)低濃度丁酸鈉(2 mmol/L)有利于Caco-2單層細胞的腸屏障功能，而高濃度丁酸鈉(8 mmol/L)會導致嚴重的上皮細胞凋亡并破壞腸道屏障功能，表明丁酸對腸道防御屏障的調(diào)控作用依賴于丁酸濃度。丁酸對小腸生長發(fā)育和消化吸收能力的改善作用可能受到IGF-1的調(diào)控[77]，或者與局部IGF系統(tǒng)的參與有關(guān)[73]。GLP-1和GLP-2是由遠端腸道L細胞分泌的腸源性肽，在調(diào)節(jié)血糖穩(wěn)態(tài)、維持黏膜形態(tài)以及腸道功能和完整性方面發(fā)揮作用。灌注丁酸鈉增加了血漿中GLP-1和GLP-2濃度[47]，皮下注射GLP-2顯著影響羔羊小腸上皮發(fā)育相關(guān)基因的表達，促進了小腸發(fā)育[78]。丁酸對腸道屏障功能的增強作用是由腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)的激活介導的[79]。也有報道，丁酸鈉增加胃和結(jié)腸中熱休克蛋白(heat-shock protein，HSP)27和HSP70的濃度，從而刺激胃腸道防御系統(tǒng)[77]。丁酸在腸道中具有抗炎作用，主要通過抑制上皮細胞中NF-κB的激活，而NF-κB調(diào)控著細胞中一些參與早期免疫炎癥應答的基因[80]。丁酸直接或間接作用于腸道組織發(fā)育和修復，其直接營養(yǎng)作用體現(xiàn)在細胞增殖方面，間接作用涉及激素-神經(jīng)-免疫系統(tǒng)，并且通過直接影響毒力基因表達和影響宿主細胞增殖而參與細菌毒力的下調(diào)。

丁酸在腸道屏障功能的維持方面與GPR和HDAC也有關(guān)系。高精料中補充丁酸鈉下調(diào)盲腸GPR41/43和相關(guān)炎癥細胞因子的mRNA表達，上調(diào)緊密連接蛋白[閉鎖小帶蛋白-1(ZO-1)和閉鎖蛋白(Occludin)]的mRNA表達，以及降低GPR41/43、ERK1/2和p38的蛋白表達，并改變GPR41/43基因啟動子區(qū)域中DNA甲基化和染色質(zhì)緊縮的比率，表明丁酸鈉可以減少盲腸黏膜的炎性損傷，并通過表觀遺傳修飾影響GPR41/43的表達[23]。丁酸處理經(jīng)過LPS刺激的腸巨噬細胞，導致促炎性介質(zhì)(包括一氧化氮、IL-6和IL-12)含量下降，未影響TLR下游信號通路(NF-κB和MAPK)和GPR(GPR109A和GPR43)的表達水平，而染色質(zhì)免疫沉淀分析顯示丁酸導致一氧化氮合酶(nitric oxide synthase 2，NOS2)、IL-6和IL-12b啟動子區(qū)域的組蛋白3賴氨酸9乙酰化(H3K9Ac)水平升高，表明丁酸的作用與TLR信號轉(zhuǎn)導和GPR激活無關(guān)，而是通過抑制HDAC來調(diào)控腸巨噬細胞功能[81]。基因缺失小鼠的研究表明，HDAC1和HDAC2通過調(diào)控腸上皮細胞的增殖和分化來抑制腸的炎癥反應[82]。存在于結(jié)腸隱窩底部的低中等濃度丁酸很容易在線粒體內(nèi)代謝，促進細胞增殖，而腸腔中高濃度丁酸超過了結(jié)腸細胞的代謝能力，未代謝的丁酸進入細胞核并作為HDAC抑制劑起作用，在表觀遺傳學上調(diào)節(jié)基因表達以抑制細胞增殖，并在細胞脫落至腸腔時誘導凋亡[25]。

4 丁酸對肝臟的影響

肝臟是機體重要的免疫器官，參與機體的營養(yǎng)重分配、解毒和免疫調(diào)節(jié)等。丁酸鈉處理山羊肝臟原代細胞，發(fā)現(xiàn)細胞活力顯著增加，糖代謝相關(guān)基因(葡萄糖六磷酸酶和丙酮酸激酶)的mRNA表達顯著降低，而糖異生相關(guān)蛋白(AMPK和磷酸化AMPK)的表達顯著增加[83]。丁酸鈉也可以改善毒素誘導的急性肝衰竭小鼠肝臟的病理學變化，抑制肝組織中高遷移率族蛋白B1(high mobility group box-1，HMGB1)和NF-κB p65的蛋白表達，降低血清中內(nèi)毒素和免疫細胞因子水平，從而延長存活期[75]。SARA狀態(tài)下瘤胃內(nèi)革蘭氏陰性菌裂解釋放的大量內(nèi)毒素通過受損的瘤胃上皮吸收入血，經(jīng)門靜脈進入肝臟，超過肝臟的清除能力時會造成肝臟的炎性損傷。SARA被認為是引起肝臟膿腫的誘發(fā)因素[2]。丁酸鈉能夠緩解飼喂高精料導致的肝臟功能損傷和細胞凋亡程度，體現(xiàn)在門靜脈和肝靜脈中LPS以及外周血中炎性因子含量降低，TNF-α和促凋亡基因(Caspase-3、Caspase-8、Bax)的mRNA表達下調(diào)，以及NF-κB(p65和磷酸化p65)、Caspase-3、Bax和細胞色素C的蛋白表達下調(diào)[37]。類似研究顯示，高谷物飼糧中添加丁酸鈉，瘤胃、門靜脈和肝臟中LPS以及外周血中促炎細胞因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)含量降低，肝臟的抗氧化能力和抗氧化酶活性增強，核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2)基因的mRNA和蛋白表達水平以及Nrf2目標基因的mRNA表達水平均升高，提示丁酸鈉可以通過部分激活Nrf2依賴性基因來改善SARA的氧化狀態(tài)[36]。SARA發(fā)生期間，飼糧中添加丁酸鈉降低瘤胃中iE-DAP(大多數(shù)革蘭氏陰性細菌和某些革蘭氏陽性細菌的細胞壁肽聚糖的常見成分)濃度，同時抑制炎癥基因的mRNA表達，以及下調(diào)含核苷酸結(jié)合寡聚化域蛋白1(nucleotide-binding oligomerization domain-containing protein 1，NOD1)和磷酸化MAPK的蛋白表達，進而緩解高精料引起的iE-DAP誘導的炎癥和肝臟破壞[84]。丁酸鈉存在通過GPR41受體調(diào)節(jié)山羊肝臟細胞功能的機制[83]。丁酸鈉也能降低SARA山羊肝臟中HADC3的蛋白表達和炎癥因子水平，提示HDAC可能在丁酸緩解肝臟炎癥中起作用[84]。因此，丁酸具有緩解SARA對肝臟損害，提高機體免疫機能的潛力。

5 小 結(jié)

丁酸作為微生物發(fā)酵產(chǎn)物之一，影響著瘤胃液pH和微生物區(qū)系以及發(fā)酵/代謝產(chǎn)物。同時，丁酸作為瘤胃和腸上皮細胞的首選能量來源，促進上皮的生長與發(fā)育，增強營養(yǎng)素的吸收和胃腸道的屏障功能，進而有助于維持瘤胃液pH以及胃腸道和血液中低水平的炎癥因子。分子水平上，丁酸通過改變瘤胃上皮中相關(guān)基因和蛋白的表達，促進乳頭的生長發(fā)育，增強VFA吸收和改善瘤胃液pH，以及保護上皮的完整性和屏障功能。同樣，丁酸通過下調(diào)腸上皮和肝臟中NF-κB、TNF-α和促凋亡基因的表達，上調(diào)緊密連接蛋白等的表達，提高免疫機能，減少炎性損傷和細胞凋亡程度。丁酸誘導的一些基因參與了GPR介導的信號傳導，通過激活GPR，或者通過表觀遺傳修飾影響GPR表達，進而引起多種轉(zhuǎn)錄因子的活化，調(diào)控代謝路徑和減少炎癥反應。丁酸與代謝產(chǎn)物β-羥丁酸作為HDAC抑制劑在基因表達的表觀遺傳調(diào)控中發(fā)揮作用，涉及細胞功能(包括細胞形態(tài)變化、細胞周期停滯和凋亡)、信號轉(zhuǎn)導、機體免疫。因此，丁酸不僅作為細胞的能量，也作為信號分子參與多個信號通路，如IFN-γ、TNF-α和NF-κB信號通路，以及JAK/STAT和p38/ERK MAPK信號通路，緩解高精料飼糧(易誘發(fā)SARA)帶來的風險。但是，高濃度丁酸不利于微生物發(fā)酵，也會降低上皮細胞的選擇通透性，破壞胃腸道的屏障功能，而且在長期的低pH環(huán)境下?lián)p害會更嚴重。

隨著高通量測序技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)以及生物信息學的快速發(fā)展和廣泛利用，生命科學領(lǐng)域已進入以多組學(基因組/轉(zhuǎn)錄組學、宏基因組/轉(zhuǎn)錄組學、蛋白質(zhì)組學、代謝組學、免疫組學、飼料組學等)為特征的大數(shù)據(jù)時代，極大地提高了人們對宿主基因和蛋白表達、微生物群落組成和功能的認知，有助于探討微生物與宿主之間的關(guān)系。如利用16S rRNA基因測序和代謝組發(fā)現(xiàn)，飼喂高谷物飼糧時瘤胃微生物的多樣性降低[43,85]，瘤胃出現(xiàn)大量丁酸產(chǎn)生菌[43,51]，瘤胃中氨基酸(賴氨酸、亮氨酸、纈氨酸)、VFA(丁酸和丙酸)以及有毒和炎性化合物(腐胺、甲胺、乙醇胺和脂多糖)含量增加[42-43]，瘤胃-肝臟-血清中的代謝變化主要與氨基酸代謝有關(guān)[85]。RNA-seq研究表明，丁酸誘導多數(shù)基因的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生變化[21,24,66]，通過激活GPR或者作為HDAC抑制劑影響多個信號通路[21-22,24]。結(jié)合16S rRNA基因測序，認為微生物-GPR軸和微生物-HDAC軸可能是介導SCFA生理作用的主要途徑[22]。因此，組學技術(shù)的利用，尤其是多部位、多組學結(jié)果的聯(lián)合分析有利于全面認識微生物與宿主之間的關(guān)系，有助于揭示丁酸在胃腸道代謝和機體免疫中的調(diào)控機理。