樊宗芳，宋潔蕾，桂富榮,2，和淑琪*

1云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院，云南省生物資源保護與利用國家重點實驗室，云南 昆明 650201；2云南省高原特色農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)研究院，云南 昆明 650201

西花薊馬Frankliniellaoccidentalis(Pergande)又稱苜蓿薊馬，屬纓翅目Thysanoptera薊馬科Thripidae花薊馬屬(張桂芬等,2011)，是一種全球性外來入侵物種，具有寄主范圍廣、生活場所隱秘、個體小、生殖力強、生長發(fā)育快、易對農(nóng)藥產(chǎn)生抗性等特點，會對蔬菜、花卉等造成毀滅性危害(Reitzetal.，2020，2011)?；ㄋE馬F.intonsa(Trybom)是西花薊馬的本地近緣種，在云南廣泛分布，可危害花卉、蔬菜、水稻等作物(Qianetal.,2017)。除直接取食危害外，西花薊馬和花薊馬均是番茄斑萎病毒屬病毒的主要傳播媒介(Jones,2005; Ullmanetal.,2002; Whitfieldetal.,2005)，并且所致?lián)p失遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過直接取食危害(Reitz,2009; Zhangetal.,2019)。

目前，薊馬類害蟲的防治仍以化學(xué)防治為主，混配殺蟲劑的大量使用加速了薊馬類害蟲的抗藥性發(fā)展，致使常用藥劑效果顯著下降，防治困難加劇(付步禮等,2014)。研究表明，西花薊馬較花薊馬對高濃度CO2、藥劑脅迫適應(yīng)能力更強(胡昌雄等,2018; 劉建業(yè)等,2017；Heetal.,2017)。充分了解西花薊馬與本地近緣種花薊馬對常用殺蟲劑的敏感性差異，有利于詮釋入侵薊馬種類與本地薊馬種類之間的種群動態(tài)關(guān)系，因地制宜選擇合適的殺蟲劑，延緩抗性發(fā)展速度。

外界環(huán)境變化時昆蟲體內(nèi)酶系會被各種外源或內(nèi)源化合物誘導(dǎo)，使昆蟲能夠迅速找到最適的生存對策(李燦等,2007)。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化物酶(peroxidase，POD)和過氧化氫酶(catalase，CAT)是昆蟲體內(nèi)3種重要的保護酶，昆蟲可通過改變體內(nèi)保護酶的活性增強其耐藥性和抗逆性(賈變桃等,2016)。此外，羧酸酯酶(carboxylesterase，CarE)、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase，GST)和乙酰膽堿酯酶(acetylcholine esterase，AChE)是昆蟲體內(nèi)3種重要的代謝酶系，能夠代謝大量的外源毒素，是昆蟲適應(yīng)逆境脅迫及植物防御的重要方式(Tiwarietal.,2011)。

本研究測定了5種不同作用機理的殺蟲劑對入侵物種西花薊馬及本地近緣種花薊馬的室內(nèi)毒力，比較了2種薊馬體內(nèi)保護酶和解毒酶的活性差異，旨在為合理選擇高效殺蟲劑，科學(xué)防治該類害蟲及進一步研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

西花薊馬和花薊馬均采自云南省昆明市呈貢縣斗南鎮(zhèn)花卉苗圃培育基地(102°46′56.15″E，24°54′14.63″N)。四季豆PhaseolusvulgarisL.(種子購于南京金盛達(dá)種子有限公司)置于室內(nèi)八角瓶中種植。飼養(yǎng)條件：人工氣候箱溫度(25±1)℃、相對濕度65%±5%、光周期16 L∶8 D，連續(xù)飼養(yǎng)30代以上，期間未接觸任何殺蟲劑。

1.2 供試藥劑及試劑盒

60 g·L-1乙基多殺菌素懸浮劑(美國陶氏益農(nóng)公司)、70%吡蟲啉水分散粒劑(江蘇東寶農(nóng)化股份有限公司)、5%甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽微乳劑(甲維鹽，深圳諾普信農(nóng)化股份有限公司)、1.8%阿維菌素乳油(河北威遠(yuǎn)生化農(nóng)藥有限公司)、25%噻蟲嗪水分散粒劑[先正達(dá)(中國)投資有限公司]。

保護酶及解毒酶活性測定試劑盒均購于南京建成生物工程公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 5種藥劑對西花薊馬和花薊馬的毒力測定 參照NY/T 1154.16-2013《農(nóng)藥室內(nèi)生物測定試驗準(zhǔn)則》，將供試藥劑按等差或等比數(shù)列稀釋成5個濃度，每個濃度4個重復(fù)，以清水為對照。采用浸漬法進行毒力測定：培養(yǎng)皿(d=9 cm)用不同濃度的藥液浸泡1 h，自然晾干；四季豆豆莢(長度5 cm)用藥液浸泡30 s，自然晾干后放入對應(yīng)濃度的培養(yǎng)皿內(nèi)，每皿1根，并分別接入羽化2 d的西花薊馬或花薊馬成蟲各50頭，培養(yǎng)皿用保鮮膜封口，用昆蟲針在保鮮膜上扎40～50個孔，以保證氣體流通，置于人工氣候箱中。48 h后記錄試蟲死亡數(shù)(用毛筆輕觸蟲體無反應(yīng)記為死亡)。

1.3.2 酶源制備 取羽化2 d的西花薊馬和花薊馬成蟲，分別用5種殺蟲劑的亞致死濃度(LC25)處理48 h，收集處理后存活的西花薊馬和花薊馬各0.2000 g(約12500頭)，加入9倍量生理鹽水，在冰浴條件下勻漿，將勻漿液于4 ℃、7500 r·min-1離心10 min，取上清液為SOD、POD、CAT、GST和AChE的測定酶源；收集處理后存活的西花薊馬和花薊馬各0.2000 g(約12500頭)，加入2 mL試劑盒中的試劑一，在冰浴條件下勻漿，將勻漿液置于4 ℃、12000 r·min-1離心30 min，取上清液為CarE測定酶源。

1.3.3 酶活性測定 SOD、POD、CAT、GST、AChE和CarE活性測定參照檢測試劑盒說明書進行。每個處理重復(fù)4次。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 25.0軟件Probit模塊擬合毒力回歸方程，并計算殺蟲劑亞致死濃度(LC25)和致死中濃度(LC50)，同一藥劑對2種薊馬的毒力比值(西花薊馬LC50/花薊馬LC50)采用TDR(toxicity difference ratio)表示(Lu & Gao,2009)；采用獨立樣本t檢驗(t-test)分析同一藥劑處理不同物種以及處理和對照的差異顯著性；采用one-way ANOVA(Duncan′s)分析不同藥劑處理同一物種的差異顯著性，顯著水平設(shè)定為P=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 5種農(nóng)藥對西花薊馬及花薊馬的室內(nèi)毒力

由表1可知，乙基多殺菌素、甲維鹽、吡蟲啉和噻蟲嗪對西花薊馬的毒力均低于花薊馬(乙基多殺菌素：t=5.712,P<0.05；甲維鹽：t=6.137,P<0.01；吡蟲啉：t=3.874，P<0.05；噻蟲嗪：t=12.866，P<0.001)，毒力差異比(TDR)均大于2.0，其中乙基多殺菌素對2種薊馬的TDR最高，達(dá)9.66。相反，阿維菌素對西花薊馬的毒力顯著高于花薊馬(t=-6.295，P<0.05)，TDR為0.03。此外，5種殺蟲劑對同一種薊馬的毒力也存在一定差異，5種殺蟲劑對西花薊馬和花薊馬的毒力大小依次為：乙基多殺菌素>甲維鹽>阿維菌素>吡蟲啉>噻蟲嗪。

表1 5種殺蟲劑對西花薊馬和花薊馬的毒力

2.2 5種殺蟲劑對西花薊馬與花薊馬保護酶活性的影響

清水對照的西花薊馬SOD活性顯著高于花薊馬SOD活性，且是花薊馬的1.32倍(圖1A)。5種殺蟲劑的亞致死劑量(LC25)對西花薊馬SOD活性均呈顯著誘導(dǎo)作用。其中，阿維菌素對西花薊馬SOD活性誘導(dǎo)作用最強，為326.40 U·mg-1，是對照的9.37倍；而對于花薊馬，乙基多殺菌素、甲維鹽和阿維菌素對其SOD活性有顯著誘導(dǎo)作用，吡蟲啉和噻蟲嗪對SOD活性影響不顯著，其中，乙基多殺菌素對花薊馬SOD活性誘導(dǎo)作用最強，為245.35 U·mg-1，是對照的9.32倍。阿維菌素、吡蟲啉和噻蟲嗪處理后西花薊馬SOD活性高于花薊馬SOD活性(P<0.05)，分別是花薊馬的1.53、1.73和1.49倍；乙基多殺菌素和甲維鹽處理后，西花薊馬體內(nèi)SOD活性則顯著低于花薊馬SOD活性。

清水處理的西花薊馬體內(nèi)POD活性略低于花薊馬POD活性(P>0.05)，是花薊馬的0.67倍(圖1B)。乙基多殺菌素、甲維鹽、阿維菌素和吡蟲啉對西花薊馬和花薊馬POD活性呈顯著誘導(dǎo)作用，其中，吡蟲啉對西花薊馬和花薊馬誘導(dǎo)作用最強，分別為298.67和246.79 U·mg-1，是對照的37.10和20.57倍；噻蟲嗪對西花薊馬POD活性呈誘導(dǎo)作用，而對花薊馬POD活性呈抑制作用(P>0.05)。而經(jīng)甲維鹽和阿維菌素處理后，2個物種之間POD活性差異不顯著；乙基多殺菌素、吡蟲啉和噻蟲嗪處理后西花薊馬體內(nèi)POD活性顯著高于花薊馬POD活性，分別為花薊馬POD活性的1.34、1.21和2.55倍。

清水對照的西花薊馬體內(nèi)CAT活性顯著低于花薊馬CAT活性，是花薊馬的0.70倍(圖1C)。阿維菌素和噻蟲嗪對西花薊馬體內(nèi)CAT活性有顯著誘導(dǎo)作用，而甲維鹽對西花薊馬體內(nèi)CAT活性有顯著抑制作用，乙基多殺菌素和吡蟲啉對其沒有顯著影響；對于花薊馬，阿維菌素對CAT活性有顯著的誘導(dǎo)作用，而吡蟲啉和噻蟲嗪則顯著抑制CAT活性，乙基多殺菌素和甲維鹽對其沒有顯著影響；其中阿維菌素對西花薊馬和花薊馬CAT活性誘導(dǎo)作用最強，分別為22.69和38.56 U·mg-1，是對照的1.42和1.69倍。甲維鹽和阿維菌素處理后，西花薊馬CAT活性顯著低于花薊馬CAT活性，僅為花薊馬CAT的0.58、0.34和0.59倍，吡蟲啉和噻蟲嗪處理的西花薊馬CAT活性顯著高于花薊馬CAT活性，分別是花薊馬的5.20和2.57倍。

圖1 5種殺蟲劑對西花薊馬和花薊馬體內(nèi)保護酶活性的影響

2.3 5種殺蟲劑對西花薊馬與花薊馬解毒酶活性的影響

清水處理的西花薊馬體內(nèi)CarE活性略低于花薊馬CarE活性(P>0.05)，僅為花薊馬的0.97倍(圖2A)。乙基多殺菌素、甲維鹽、阿維菌素和吡蟲啉對西花薊馬和花薊馬體內(nèi)CarE活性均呈顯著誘導(dǎo)作用，而噻蟲嗪對2種薊馬的CarE活性沒有顯著影響，其中，阿維菌素對西花薊馬和花薊馬CarE活性誘導(dǎo)作用最強，分別為12.53和11.99 U·mg-1，是對照的3.61和3.37倍。乙基多殺菌素、甲維鹽和阿維菌素處理后西花薊馬體內(nèi)CarE活性略高于花薊馬CarE活性，分別是花薊馬的1.05、1.10和1.05倍；而吡蟲啉處理后西花薊馬CarE活性略低于花薊馬CarE活性(P>0.05)。

清水處理的西花薊馬體內(nèi)GST活性略低于花薊馬GST活性(P>0.05)，僅為花薊馬的0.93倍(圖2B)。乙基多殺菌素、甲維鹽和阿維菌素對西花薊馬和花薊馬體內(nèi)GST活性均呈顯著誘導(dǎo)作用，而吡蟲啉和噻蟲嗪對2種GST活性沒有顯著影響，其中，乙基多殺菌素對西花薊馬和花薊馬薊馬的GST活性誘導(dǎo)作用最強，分別為77527.59和66927.39 U·mg-1，是對照的1.56和1.26倍。5種殺蟲劑處理后西花薊馬GST活性均高于花薊馬GST活性(P>0.05)。

清水處理的西花薊馬體內(nèi)AChE活性略低于花薊馬AChE活性(P>0.05)，是花薊馬的0.88倍(圖2C)。乙基多殺菌素、吡蟲啉和噻蟲嗪對2種薊馬AChE活性均呈顯著誘導(dǎo)作用，而甲維鹽和阿維菌素對兩種薊馬AChE活性沒有顯著影響，其中，乙基多殺菌素對西花薊馬和花薊馬AChE誘導(dǎo)作用最強，分別為2.34和2.22 U·mg-1，是對照的3.44和2.88倍。乙基多殺菌素、阿維菌素和吡蟲啉處理的西花薊馬AChE活性均高于花薊馬AChE活性，分別是花薊馬的1.05、1.49和1.54倍，而噻蟲嗪處理的西花薊馬AChE活性略低于花薊馬AChE活性(P>0.05)，僅為花薊馬的0.90倍。

圖2 5種殺蟲劑對西花薊馬和花薊馬體內(nèi)CarE(A)、GST(B)、AChE(C)活性的影響

本研究結(jié)果表明，不同殺蟲劑對不同薊馬體內(nèi)保護酶(SOD、POD、CAT)和解毒酶(CarE、GST、AChE)活性的誘導(dǎo)或抑制作用不同。乙基多殺菌素僅抑制西花薊馬的CAT活性，對其他酶活性均呈顯著誘導(dǎo)作用，但對花薊馬體內(nèi)的保護酶和解毒酶均呈誘導(dǎo)作用。甲維鹽抑制2種薊馬的CAT活性，但對其他酶活性均有誘導(dǎo)作用。阿維菌素、吡蟲啉和噻蟲嗪對西花薊馬體內(nèi)保護酶和解毒酶活性均有誘導(dǎo)作用；而阿維菌素抑制花薊馬體內(nèi)AChE活性，吡蟲啉抑制花薊馬體內(nèi)CAT活性，噻蟲嗪對花薊馬體內(nèi)POD、CAT和GST活性具有抑制作用。

3 討論

外來物種成功入侵新的棲境后，往往較本地物種具有明顯的生理或生態(tài)優(yōu)勢(Qianetal.,2018)，能夠更快適應(yīng)不良的環(huán)境變化(如提高農(nóng)藥的耐受性等)，從而占據(jù)更多的可利用資源，并在與本地物種的競爭中獲勝(Byers,2002; Petcheyetal.,1999)。本研究在室內(nèi)測定了不同藥劑對入侵種西花薊馬和本地近緣種花薊馬成蟲的毒力，結(jié)果表明：乙基多殺菌素對西花薊馬的毒力最高(LC50=0.28 mg·L-1)，與張治科等(2019)所測結(jié)果類似。乙基多殺菌素是微生物源殺蟲劑，對環(huán)境友好，可將其作為防治薊馬的優(yōu)先選擇藥劑。西花薊馬對5種殺蟲劑的敏感性普遍低于花薊馬，表明西花薊馬較花薊馬具有更強的耐藥性。Zhaoetal.(2017)和Reitzetal.(2020)研究表明，經(jīng)殺蟲劑介導(dǎo)后，西花薊馬較本地薊馬表現(xiàn)出更強的種間競爭優(yōu)勢。

昆蟲體內(nèi)的保護酶(SOD、CAT和POD)相互協(xié)調(diào)，參與細(xì)胞內(nèi)自由基的產(chǎn)生與清除，其中，SOD的功能是催化超氧陰離子自由基(O2-)歧化生成過氧化氫(H2O2)，而CAT和POD具有分解H2O2的能力(Ahmad & Pardini，1990)，3種保護酶相互協(xié)調(diào)使自由基維持在一個較低的水平，從而避免自由基毒害(李周直等，1994)。在外界刺激物(如化學(xué)農(nóng)藥、不良環(huán)境因素等)的作用下，昆蟲體內(nèi)保護酶活性會發(fā)生相應(yīng)變化，從而維持正常的生理代謝(查黎春，2011)。本研究中，不同殺蟲劑處理對2種薊馬體內(nèi)的保護酶活性的影響不盡相同。乙基多殺菌素和甲維鹽顯著誘導(dǎo)西花薊馬和花薊馬體內(nèi)SOD和POD活性，但西花薊馬體內(nèi)SOD活性顯著低于花薊馬體內(nèi)SOD活性，說明乙基多殺菌素和甲維鹽處理后西花薊馬相較于花薊馬產(chǎn)生更少的H2O2，從而避免了H2O2的毒害；乙基多殺菌素處理后，西花薊馬體內(nèi)POD活性顯著高于花薊馬，說明西花薊馬通過誘導(dǎo)POD活性分解體內(nèi)的H2O2，從而降低其對機體的氧化損傷；而經(jīng)甲維鹽脅迫后，西花薊馬體內(nèi)POD活性略低于花薊馬，推測該差異是2種薊馬本身差異造成的；經(jīng)乙基多殺菌素和甲維鹽處理后，2種薊馬體內(nèi)CAT可能不參與對H2O2的分解。吡蟲啉和噻蟲嗪對西花薊馬SOD活性呈顯著誘導(dǎo)作用，而對花薊馬SOD無顯著影響，同時吡蟲啉顯著誘導(dǎo)2種薊馬POD活性，且西花薊馬POD活性顯著高于花薊馬POD活性，而噻蟲嗪對2種薊馬POD活性無顯著影響；吡蟲啉和噻蟲嗪均對西花薊馬CAT活性有誘導(dǎo)作用，但顯著抑制花薊馬的CAT活性，說明西花薊馬通過升高體內(nèi)POD和CAT活性來分解體內(nèi)大量H2O2，從而減輕其毒害作用。阿維菌素對2種薊馬體內(nèi)保護酶活性均呈顯著誘導(dǎo)作用，且西花薊馬SOD活性顯著高于花薊馬SOD活性，但西花薊馬體內(nèi)POD和CAT活性低于花薊馬，說明阿維菌素對西花薊馬的氧化損傷高于花薊馬，這可能是西花薊馬對阿維菌素的敏感性強于花薊馬的原因之一。

昆蟲的解毒酶系(AChE、CarE和GST)在對農(nóng)藥的代謝中起重要作用，解毒能力增強是昆蟲對農(nóng)藥產(chǎn)生抗性的主要原因之一(楊慧等，2020)；昆蟲解毒酶系的活性可以被各種外源、內(nèi)源化合物誘導(dǎo)，這使得昆蟲在受到環(huán)境脅迫時體內(nèi)酶能迅速作出反應(yīng)，從而存活下來(王智卿和劉長明，2010)。本研究中，對照西花薊馬解毒酶(CarE、AChE、GST)活性略低于花薊馬解毒酶活性，而經(jīng)乙基多殺菌素、甲維鹽和阿維菌素處理后，西花薊馬CarE活性則略高于花薊馬CarE活性；經(jīng)5種殺蟲劑脅迫后，西花薊馬GST活性均高于花薊馬；乙基多殺菌素、阿維菌素和吡蟲啉處理后，西花薊馬AChE活性高于花薊馬AChE活性，說明西花薊馬可通過升高體內(nèi)解毒酶活性來應(yīng)對殺蟲劑脅迫，也說明入侵種西花薊馬較本地種花薊馬具有更強的解毒代謝能力。

昆蟲受到化學(xué)藥劑脅迫后，體內(nèi)酶活性的變化是一個復(fù)雜的過程，受不同藥劑類型、藥劑處理濃度和時間、昆蟲齡期等因素的影響(何發(fā)林等，2019; 張玨鋒等，2018)。本研究僅比較了2種薊馬在不同殺蟲劑LC25劑量下處理48 h后保護酶、解毒酶活性的變化，不同處理時間及不同處理濃度對其影響尚需進一步研究。