陳進(jìn)芳，翁育才

海南醫(yī)學(xué)院 第二附屬醫(yī)院 藥學(xué)部，海南 ?？?570311

女貞子被《神農(nóng)本草經(jīng)》列為上品，來源于木犀科植物女貞Ligustrum lucidumAit.的干燥成熟果實(shí)，味甘、苦，性涼，具有滋補(bǔ)肝腎、明目烏發(fā)的功效，用于眩暈耳鳴、腰膝酸軟、須發(fā)早白、目暗不明等癥[1]?，F(xiàn)代化學(xué)成分研究表明，女貞子中主要含有環(huán)烯醚萜苷類、苯乙醇類、黃酮類、三萜類等多種活性成分[2-3]。目前,從環(huán)烯醚萜苷類化合物中分離出來30 多種化合物，其中含量較高的有特女貞苷、女貞苷、女貞苷G13 和橄欖苦苷等裂環(huán)環(huán)烯醚萜苷類，這類化合物具有抗氧化、免疫增強(qiáng)、腫瘤抑制、調(diào)血脂等作用[4-6]，《中國人民共和國藥典》2020 年版一部也以特女貞苷為含量測定指標(biāo)；苯乙醇類中的紅景天苷和酪醇為女貞子發(fā)揮療效的重要有效成分，具有抗菌、抗炎、抗肝損傷等多種生物活性[7-8]；黃酮類化合物木犀草苷是女貞子發(fā)揮調(diào)血脂作用的主要成分，有效率高達(dá)90%[9]。臨床常用其炮制品，女貞子歷代炮制方法有：宋代“飯上蒸”（《瘡瘍經(jīng)驗(yàn)全書》）；明代有酒浸蒸曬（《本草通玄》）、酒拌黑豆蒸9 次（《炮炙大法》）；清代有蜜酒拌蒸（《醫(yī)方集解》）、鹽水拌炒（《得配本草》）等；現(xiàn)代炮制多采用凈制、酒制、鹽制[10-12]。女貞子經(jīng)過不同炮制工序后，其所含化學(xué)成分會(huì)發(fā)生變化，進(jìn)而影響臨床療效。目前，尚無關(guān)于特女貞苷、紅景天苷、女貞苷、女貞苷G13、木犀草苷、酪醇和橄欖苦苷7種化學(xué)成分經(jīng)上述3種炮制方法炮制后含量的變化研究。故本研究采用多波長切換高效液相色譜法（HPLC）對(duì)經(jīng)不同炮制方法炮制后女貞子中特女貞苷、紅景天苷、女貞苷、女貞苷G13、木犀草苷、酪醇和橄欖苦苷含量進(jìn)行測定，為女貞子飲片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高和臨床療效提供參考。

1 材料

1.1 儀器

2695/2996 型高效液相色譜儀，包括真空脫氣機(jī)、四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、UV 2489 型檢測器、Empower 2.0 工作站；AUW220D 型電子天平（d=0.01 mg，日本島津公司）；YF-111 型高速中藥粉碎機(jī)（瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司）；KQ-500E型醫(yī)用超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

對(duì)照品特女貞苷（批號(hào)：111926-201906，純度：95.0%）、紅景天苷（批號(hào)：110818-201708，純度：98.8%）、女貞苷（批號(hào)：111918-201703，純度：94.4%）、木犀草苷（批號(hào)：111720-201810，純度：93.5%）、酪醇（批號(hào)：111676-201802，純度：95.9%）均購自中國食品藥品檢定研究院；對(duì)照品女貞苷G13（批號(hào)：PRF181216，純度＞97.0%）、橄欖苦苷（批號(hào)：PRF1701127，純度＞95.0%）購自成都普思生物科技股份有限公司；乙腈、甲醇、甲酸均為色譜純（美國默克公司）；水為娃哈哈純凈水。

女貞子購自山東百味堂中藥飲片有限公司（批號(hào)：190921），經(jīng)海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院藥學(xué)部方草主任藥師鑒定為木犀科植物女貞Ligustrum lucidumAit.的干燥成熟果實(shí)。

2 方法與結(jié)果

2.1 炮制方法

2.1.1 凈女貞子 取女貞子生品適量，除去雜質(zhì)，洗凈，干燥。平行制備3份樣品（編號(hào)為PZ01～PZ03）。

2.1.2 鹽女貞子 取凈女貞子生品適量，每100 g中噴淋1%鹽水20 mL，拌勻，悶潤至透凈。平行制備3份樣品（編號(hào)為PZ07～PZ09）。

2.1.3 酒女貞子 取凈女貞子生品適量,放入陶瓷鍋，每100 g 中加入20 g 黃酒，拌勻，密閉悶潤4 h后，保持陶瓷鍋密閉,放入不銹鋼蒸鍋，蒸24 h。平行制備3份樣品（編號(hào)為PZ04～PZ06）。

2.2 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：AgilentEclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流速：1.0 mL·min-1，柱溫：28 ℃，進(jìn)樣量：10 μL；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.15%甲酸（B），梯度洗脫（0～20 min，10%～18%A；20～30 min，18%～35%A；30～52 min，35%～69%A；52～60 min，69%～10%A）；檢測波長：224 nm（紅景天苷、酪醇）、235 nm（特女貞苷、女貞苷、女貞苷G13、橄欖苦苷）、349 nm（木犀草苷）；在上述色譜條件下[10,13-14]，基線平穩(wěn)，7 種化學(xué)成分色譜峰峰形較好，且與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，理論板數(shù)均大于5700，系統(tǒng)適用性良好，色譜圖見圖1。

圖1 混合對(duì)照品及女貞子不同炮制品HPLC圖

2.3 溶液的制備

2.3.1 混合對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱定特女貞苷、紅景天苷、女貞苷、女貞苷G13、木犀草苷、酪醇和橄欖苦苷對(duì)照品適量，用85%甲醇溶解制成特女貞苷166.13 μg·mL-1、紅景天苷90.41 μg·mL-1、女貞苷40.52 μg·mL-1、女貞苷G13 92.26 μg·mL-1、木犀草苷40.85 μg·mL-1、酪醇21.07 μg·mL-1和橄欖苦苷88.93 μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。避光保存。

2.3.2 樣品溶液的制備 分別精密稱取已粉碎（過三號(hào)篩）的凈制女貞子、酒女貞子和鹽女貞子樣品各約1.0 g，置于50 mL 具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇35 mL，稱定質(zhì)量，超聲(功率：400 W,頻率：40 kHz)提取35 min，取出，放至室溫，稱定質(zhì)量，用80%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，濾過，取續(xù)濾液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密量取2.3.1 項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL 置25 mL 棕色量瓶中，加85%甲醇定容至刻度，搖勻，得系列混合對(duì)照品溶液，在2.2 項(xiàng)下色譜條件下進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸，繪制各組分標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程和相關(guān)系數(shù)（r）。結(jié)果表明：特女貞苷、紅景天苷、女貞苷、女貞苷G13、木犀草苷、酪醇和橄欖苦苷在試驗(yàn)范圍內(nèi)成良好的線性關(guān)系；將對(duì)照品溶液逐級(jí)稀釋后，以信噪比（S/N）約為3.0 時(shí)的質(zhì)量濃度為各成分的檢測限（LOD），S/N 約為10.0 時(shí)的質(zhì)量濃度為各成分的定量限（LOQ）。結(jié)果見表1。

表1 女貞子7種成分的回歸方程及線性范圍

2.5 精密度試驗(yàn)

取2.3.1 項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6 針，記錄各成分色譜峰峰面積。結(jié)果特女貞苷、紅景天苷、女貞苷、女貞苷G13、木犀草苷、酪醇和橄欖苦苷峰面積的RSD 分別為0.88%、0.79%、0.91%、0.75%、0.65%、0.95%、0.59%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密稱取凈女貞子（編號(hào)：PZ-01）粉末適量，按2.3.2 項(xiàng)下方法制備凈女貞子供試品溶液適量，分別于室溫條件下放置0、3、6、9、12、15 h，按2.2項(xiàng)下色譜條件分析，記錄色譜圖并計(jì)算7種成分峰面積RSD。結(jié)果特女貞苷、紅景天苷、女貞苷、女貞苷G13、木犀草苷、酪醇和橄欖苦苷峰面積RSD 分別為0.69%、1.01%、0.96%、0.87%、0.77%、0.71%、1.03%。表明供試品溶液在15 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

精密取同一批凈女貞子供試品（編號(hào)：PZ-01）粉末適量，按2.3.2項(xiàng)下處理方法平行制備6份，按2.2項(xiàng)下色譜條件分析，記錄色譜圖并計(jì)算7種化學(xué)成分的峰面積RSD及平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)。結(jié)果特女貞苷、紅景天苷、女貞苷、女貞苷G13、木犀草苷、酪醇和橄欖苦苷的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為3.097 0、1.496 0、0.553 4、1.628 0、0.561 2、0.217 7、1.211 0 mg·g-1，其含量RSD 分別為1.44%、1.59%、0.98%、1.27%、1.25%、0.92%、1.13%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的樣品粉末約0.5 g（編號(hào)：PZ-01），共計(jì)6 份，分別置于50 mL 棕色量瓶中，精密加入2.3.1項(xiàng)下特女貞苷、紅景天苷、女貞苷、女貞苷G13、木犀草苷、酪醇和橄欖苦苷混合對(duì)照品溶液（質(zhì)量濃度分別為0.322 1、0.159 7、0.060 4、0.173 7、0.023 2、0.060 0、0.128 9 mg·mL-1）5.0 mL，按2.3.2項(xiàng)下方法制備樣品溶液，在2.2項(xiàng)下色譜條件下進(jìn)樣分析。結(jié)果特女貞苷、紅景天苷、女貞苷、女貞苷G13、木犀草苷、酪醇和橄欖苦苷的回收率為96.28%～101.57%，RSD 分別為0.72%、1.11%、1.44%、1.14%、0.86%、0.77%和0.84%。結(jié)果見表2。

表2 女貞子7種成分的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.9 樣品測定

分別稱取凈女貞子、鹽女貞子和酒女貞子各3份，按2.3.2項(xiàng)下的方法制備樣品溶液，在2.2項(xiàng)下的色譜條件下分別平行進(jìn)樣3 針，記錄色譜圖，按外標(biāo)法計(jì)算特女貞苷、紅景天苷、女貞苷、女貞苷G13、木犀草苷、酪醇和橄欖苦苷的含量。結(jié)果見表3、圖2。結(jié)果顯示，女貞子中7 種化學(xué)成分經(jīng)過3 種炮制工藝后，含量均有變化。

表3 女貞子各成分含量測定結(jié)果

圖2 女貞子不同炮制方式7種化學(xué)成分含量變化趨勢

3 討論

3.1 含量測定方法的考察

筆者在190～400 nm 對(duì)混合對(duì)照品溶液進(jìn)行紫外吸收掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，特女貞苷、女貞苷、女貞苷G13 和橄欖苦苷在235 nm 處有最大吸收，紅景天苷和酪醇在224 nm 處有最大吸收，木犀草苷在349 nm 處有最大吸收，故采用波長切換分段檢測各種成分；試驗(yàn)考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-磷酸（0.1%、0.15%、0.3%）、乙腈-磷酸（0.1%、0.15%、0.3%）、乙腈-甲酸（0.1%、0.15%、0.3%）5 種流動(dòng)相體系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乙腈-0.15%甲酸溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，基線平穩(wěn)且7 種化學(xué)成分的色譜峰分離度良好，峰形及峰純度均符合含量測定要求；試驗(yàn)同時(shí)考察了不同柱溫（25、28、30 ℃）、不同品牌色譜柱（Agilent Eclipse XDB-C18、Wondasil C18、Shimadzu VP-ODS）對(duì)色譜峰的影響，最終確定本研究的色譜條件。

3.2 不同炮制工藝7種化學(xué)成分含量結(jié)果分析

表3 及圖2 表明，特女貞苷、紅景天苷、女貞苷、女貞苷G13、木犀草苷、酪醇和橄欖苦苷7種化學(xué)成分在女貞子經(jīng)過凈制及鹽制2 種炮制工藝后，含量變化不明顯。而酒女貞子除木犀草苷含量無明顯變化外，所含化學(xué)成分發(fā)生了質(zhì)變與量變，筆者通過現(xiàn)有的檢驗(yàn)?zāi)芰νㄟ^HPLC 圖比對(duì)出在紅景天苷和酪醇色譜峰中間多出1 個(gè)小峰，通過峰面積外標(biāo)法計(jì)算含量，紅景天苷在酒女貞子中含量最高，酪醇含量明顯上升，而特女貞苷、女貞苷、女貞苷G13 及橄欖苦苷含量降低明顯，下降率分別達(dá)到63.72%、77.65%、73.35%、66.74%。筆者初步分析，這與女貞子中環(huán)烯醚萜苷類多酚化合物的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)相關(guān)，在特女貞苷及女貞苷G13 分子中，環(huán)烯醚萜部分通過其裂環(huán)上的酯鍵與紅景天苷相連，橄欖苦苷、女貞苷分子中，環(huán)烯醚萜部分通過酯鍵與酪醇或羥基酪醇等苯乙醇類化合物相連[15-16]，其性質(zhì)均不穩(wěn)定，長期高溫悶熱酯鍵水解斷裂，加速了特女貞苷、女貞苷、女貞苷G13 及橄欖苦苷的分解，而導(dǎo)致其含量的下降；降解產(chǎn)物酪醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)上升，平級(jí)上升率為66.03%。其化學(xué)轉(zhuǎn)化機(jī)制見圖3。女貞子中7 種化學(xué)成分的具體轉(zhuǎn)化有待筆者進(jìn)一步通過實(shí)驗(yàn)和質(zhì)譜去驗(yàn)證。中藥的化學(xué)成分是影響中藥的理化性質(zhì)和發(fā)揮臨床療效的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，本實(shí)驗(yàn)研究比較了女貞子經(jīng)3種不同炮制工序后7種化學(xué)成分變化，為女貞子臨床應(yīng)用采用不同炮制品提供參考，同時(shí)也為制定女貞子炮制工藝技術(shù)提供應(yīng)用基礎(chǔ)。

圖3 女貞子炮制過程中主要成分的轉(zhuǎn)化