杜佳雪，劉紹能

1.中國中醫(yī)科學(xué)院 廣安門醫(yī)院，北京 100053；

2.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029

胃食管反流?。╣astroesophageal reflux disease，GERD）指胃內(nèi)容物反流入食管，引起不適癥狀和（或）并發(fā)癥的一種疾病[1]。目前，GERD 主要分為非糜爛性反流?。╪on-erosive reflux disease，NERD）、反流性食管炎（reflux esophagitis，RE）和Barrett食管（Barrett esophagus，BE）三大臨床類型。典型和常見的GERD 癥狀為燒心和反流，其他少見或不典型的相關(guān)癥狀包括上腹痛、上腹不適、胸痛、噯氣、腹脹、咽部異物感、吞咽痛、吞咽困難等，此外還有食管外癥狀，如慢性咳嗽、咽喉炎、哮喘等[2]。GERD 在中醫(yī)中應(yīng)歸屬于“吐酸”“嘔苦”“吞酸”“嘈雜”“食管癉”等范疇，主要證型有肝胃郁熱證、膽熱犯胃證、氣郁痰阻證、瘀血阻絡(luò)證、中虛氣逆證、脾虛濕熱證。

旋覆代赭湯首載于《傷寒論·辨太陽病脈證并治》：“傷寒發(fā)汗，若吐若下，解后心下痞硬，噫氣不除者，旋覆代赭湯主之?！盵3]旋覆代赭湯為和胃降逆法的代表方劑，方中旋覆花、代赭石下氣降逆、消痰止嘔，半夏、生姜助其散結(jié)降逆、止嘔化痰之效，人參、大棗、甘草益氣和中，全方升降相因，共奏和胃降逆、調(diào)理脾胃升降之功[4]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，旋覆代赭湯具有抗炎、保護(hù)食管黏膜、促進(jìn)胃動力、抑制胃酸分泌、抗胃潰瘍、鎮(zhèn)吐等作用。因此廣泛用于治療消化系統(tǒng)疾病，如反流性食管炎、反流性胃炎、功能性消化不良、頑固性呃逆、食管癌、反流性咳嗽、反流性喉炎等[5-6]。旋覆代赭湯主治“心下痞硬，噫氣不除”之證。動物實驗顯示，旋覆代赭湯對胃黏膜具有明顯的保護(hù)和修復(fù)作用，其作用機(jī)制可能與阻滯H2受體，抑制組胺對胃酸分泌的影響有關(guān)[7]。臨床觀察表明，旋覆代赭湯治療GERD療效顯著，能夠有效改善中醫(yī)證候、改善患者食管動力、改善患者胃黏膜組織，值得廣泛推廣[8-9]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是在系統(tǒng)生物學(xué)與計算機(jī)技術(shù)高速發(fā)展的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，基于“疾病-基因-靶點-藥物”相互作用網(wǎng)絡(luò)，系統(tǒng)綜合地分析藥物對疾病網(wǎng)絡(luò)的干預(yù)與影響，揭示藥物多分子協(xié)同作用于人體的機(jī)制[10-11]，與中醫(yī)學(xué)的整體觀念和中藥及其復(fù)方多成分、多靶點、多途徑協(xié)同作用的原理相符[12]。生物信息學(xué)主要研究生物系統(tǒng)中的信息現(xiàn)象、信息流及其相互作用和調(diào)控規(guī)律[13]。本研究基于旋覆代赭湯多成分、多靶點、多途徑作用的研究思路，使用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和生物信息學(xué)技術(shù)，分析GERD 的差異表達(dá)基因，構(gòu)建旋覆代赭湯治療GERD 的化合物-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)，初步闡述旋覆代赭湯治療GERD 的作用機(jī)制，為后續(xù)研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 旋覆代赭湯活性成分的篩選及靶點預(yù)測

利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP，https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）檢索旋覆代赭湯的化合物成分，根據(jù)口服利用度（oral availability，OB）≥30% 且類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18 篩選藥物活性成分，并收集其預(yù)測靶點?；赥CMID 數(shù)據(jù)庫（http://www.megabionet.org/tcmid/）和BATMAN 數(shù)據(jù)庫（http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）檢索旋覆代赭湯藥物的活性成分，并設(shè)置閾值Score≥20。運用STITCH 數(shù)據(jù)庫（http://stitch.embl.de/）預(yù)測旋覆代赭湯活性成分的潛在靶點。通過STRING數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org）檢索收集的藥物靶點蛋白，設(shè)置物種為人（homo sapiens），獲取靶點蛋白的官方名稱并篩除非人類蛋白。

1.2 GERD靶點的收集

在GEO 數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中下載GSE9768 數(shù)據(jù)集，該數(shù)據(jù)集由利茲大學(xué)分子流行病學(xué)實驗室使用GPL570 平臺測序，將Barrett 食管細(xì)胞系暴露于酸性環(huán)境（pH 4.5）中，分別在2、6 h 提取RNA，包括5 個2 h 提取的樣本和6 個6 h 提取的樣本。利用Perl 語言對數(shù)據(jù)集基因進(jìn)行注釋，利用R語言中l(wèi)imma包對數(shù)據(jù)集進(jìn)行差異分析，設(shè)置閾值 Fold Change≥2，P＜0.05。從GeneCards 數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/）、TTD 數(shù)據(jù)庫（http://db.idrblab.net/ttd/）、DisGeNET數(shù)據(jù)庫（https://www.disgenet.org/）上檢索關(guān)鍵詞“gastroesophageal reflux”，收集疾病靶點，將GSE9768 數(shù)據(jù)集的差異表達(dá)基因與數(shù)據(jù)庫收集的疾病靶點合并去重后作為GERD的疾病靶點。

1.3 靶點蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

對藥物靶點和疾病靶點取交集后，將交集靶點導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行靶點PPI 分析，設(shè)置置信度為最高（0.9）?；趶腟TRING數(shù)據(jù)庫獲得的蛋白間相互作用關(guān)系，在Cytoscape 3.7.2軟件中構(gòu)建靶點PPI網(wǎng)絡(luò)，使用CytoNCA插件對網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析，設(shè)置拓?fù)鋮?shù)閾值為介度中心性（degree centrality，DC）中位數(shù)2 倍值、介度中心性（betweenness centrality，BC）中位數(shù)、緊密中心性（closeness centrality，CC）中位數(shù)，篩選滿足上述參數(shù)的靶點蛋白作為旋覆代赭湯治療GERD的關(guān)鍵靶點。

1.4 化合物-關(guān)鍵靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

在Cytoscape 3.7.2 軟件中構(gòu)建化合物-關(guān)鍵靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)，使用CytoNCA 插件對網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析，設(shè)置拓?fù)鋮?shù)閾值為DC 中位數(shù)2 倍值、BC中位數(shù)、CC 中位數(shù)，篩選滿足上述參數(shù)的活性成分作為旋覆代赭湯治療GERD的關(guān)鍵藥效分子。

1.5 基因本體（gene ontology，GO）富集分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析

使用DAVID 數(shù)據(jù)庫對交集靶點進(jìn)行GO 富集分析，利用Bioconductor 中的R 包clusterprofile 對交集靶點進(jìn)行KEGG 通路富集分析，設(shè)置閾值P＜0.05，根據(jù)富集分析結(jié)果在Cytoscape 3.7.2 軟件中構(gòu)建化合物-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果

2.1 旋覆代赭湯的活性成分和預(yù)測靶點

利用TCMSP、TCMID、BATMAN、STITCH 數(shù)據(jù)庫共收集到旋覆代赭湯382 個活性成分和2364 個潛在靶點，其中半夏包含38個活性成分，大棗包含84個活性成分，代赭石包含1 個活性成分，甘草包含152 個活性成分，人參包含104 個活性成分，生姜包含42個活性成分，旋覆花包含30個活性成分。

2.2 GERD靶點

對GSE9768數(shù)據(jù)集進(jìn)行差異分析，共得到1549個差異基因，見圖1～2。通過GeneCards、TTD、DisGeNET數(shù)據(jù)庫共收集到2996 個疾病靶點，與差異基因合并去重后共收集到4371個GERD的疾病靶點。

圖1 GSE9768數(shù)據(jù)集差異基因分析熱圖

圖2 GSE9768數(shù)據(jù)集差異分析火山圖

2.3 靶點蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)

旋覆代赭湯靶點和GERD 疾病靶點的816 個交集靶點PPI 網(wǎng)絡(luò)及經(jīng)過篩選后的關(guān)鍵靶點PPI 網(wǎng)絡(luò)如圖3 所示，靶點蛋白PPI 網(wǎng)絡(luò)中共有665 個節(jié)點和3833 條邊，關(guān)鍵靶點PPI 網(wǎng)絡(luò)中共有204 個節(jié)點和2258條邊，圖3中節(jié)點直徑和顏色深度與節(jié)點DC 值成正比。網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋵W(xué)分析結(jié)果如表1 所示，網(wǎng)絡(luò)DC 中位數(shù)2 倍值為14，BC 中位數(shù)為297.122 62，CC 中位數(shù)為0.032 832 28，據(jù)此篩選出164 個關(guān)鍵靶點，其中DC最大的6個靶點為E1A結(jié)合蛋白P300（EP300，88）、磷脂酰肌醇3-激酶CA（PIK3CA，86）、腫瘤蛋白p53（TP53，80）、蛋白激酶B1（Akt1，71）、CREB 結(jié)合蛋白（CREBBP，72）、信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白3（STAT3，71）。

表1 旋覆代赭湯治療GERD靶點蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)部分拓?fù)鋵W(xué)分析

圖3 旋覆代赭湯治療GERD靶點蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)及經(jīng)過篩選后的關(guān)鍵靶點PPI網(wǎng)絡(luò)

2.4 化合物-關(guān)鍵靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)

旋覆代赭湯治療GERD 的化合物-關(guān)鍵靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)如圖4 所示，網(wǎng)絡(luò)共有476 個節(jié)點和2385 條邊，包括1 個疾病節(jié)點、7 個藥物節(jié)點、304 個化合物節(jié)點、164 個關(guān)鍵靶點節(jié)點。網(wǎng)絡(luò)DC 中位數(shù)2 倍值為12，BC 中位數(shù)為109.961 202 5，CC 中位數(shù)為0.360 396 4，據(jù)此篩選出36個關(guān)鍵藥效分子（表2）。其中DC 值較高的有白樺脂醇、水菖蒲酮、槲皮素、姜酮、3-甲基-6，7，8-三氫吡咯[1,2-A]嘧啶-2-酮、三磷酸腺苷、延胡索乙素、葫蘆巴堿、β-谷甾醇。

表2 旋覆代赭湯治療GERD的關(guān)鍵藥效分子拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)

圖4 旋覆代赭湯治療GERD的化合物-關(guān)鍵靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)

2.5 GO富集分析和化合物-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)

對交集靶點進(jìn)行的GO 富集分析和KEGG 通路富集分析，結(jié)果見圖5～6。GO 富集分析共富集到生物過程（biological processes，BP）條目806 個、細(xì)胞組分（cellular component，CC）條目81 個和分子功能（molecular function，MF）條目131 個，包括細(xì)胞增殖的陽性調(diào)節(jié)（positive regulation of cell proliferation）、絲裂原活化蛋白激酶級聯(lián)（MAPK cascade）、血管生成（angiogenesis）、炎癥反應(yīng)（inflammatory response）、細(xì)胞因子活動（cytokine activity）等。KEGG 通路富集分析共富集到183 條通路，包括內(nèi)分泌抵抗（endocrine resistance）、核轉(zhuǎn)錄因子-κB 信號通路（NF-κB signaling pathway）、含血清素的神經(jīng)突觸（serotonergic synapse）、胃酸分泌（gastric acid secretion）、FoxO 信號通路（FoxO signaling pathway）等。

圖5 旋覆代赭湯治療GERD靶點的GO富集分析

旋覆代赭湯治療GERD 的化合物-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)如圖7 所示，網(wǎng)絡(luò)中共有647 個節(jié)點和5295 邊，包括7 個藥物節(jié)點、284 個化合物節(jié)點、156 個關(guān)鍵靶點節(jié)點、183 個通路節(jié)點。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)顯示，旋覆代赭湯通過多成分、多靶點、多途徑發(fā)揮治療GERD的作用。

圖6 旋覆代赭湯治療GERD靶點的KEGG通路富集分析

圖7 旋覆代赭湯治療GERD的化合物-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)

3 討論

GERD 是抗反流屏障功能減弱、食管清除能力下降等引起的反酸、燒心[14-15]。近年來，隨著生活方式的改變，GERD 的發(fā)病率呈逐漸升高趨勢[16]，在我國患病率約12.5%[17]。中醫(yī)藥治療GERD的臨床療效確定、價格低廉、復(fù)發(fā)率低[18]，具有一定的特色和優(yōu)勢。旋覆代赭湯出自《傷寒論》，主要功效為和胃降逆、下氣消痰，主治胃虛痰阻、氣逆不降之證，對于GERD具有一定的臨床療效。

化合物-關(guān)鍵靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析結(jié)果顯示，白樺脂醇、姜酮、槲皮素、延胡索乙素、葫蘆巴堿等活性成分DC值較高，作用靶點較多，可能在旋覆代赭湯治療GERD 的過程中發(fā)揮重要作用。動物實驗表明，GERD 的發(fā)生并不是從食管的化學(xué)性損傷開始的，而是由于深層組織發(fā)生了炎癥和免疫反應(yīng)，導(dǎo)致表面組織發(fā)生了損傷[19]。白樺脂醇是一種三萜類化合物，Laavola 等[20]研究發(fā)現(xiàn)，白樺脂醇及其衍生物能夠選擇性地抑制誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）的表達(dá)，還可抑制細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-6（IL-6）、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）、環(huán)氧化酶-2（COX-2）等炎癥因子的表達(dá)。延胡索乙素是一種生物堿，李毓等[21]研究表明，延胡索乙素能明顯抑制胃黏膜基礎(chǔ)胃酸分泌，被壁細(xì)胞攝取后可能進(jìn)入泌酸小管，通過降低質(zhì)子梯度而影響壁細(xì)胞的泌酸功能。Yoshinari 等[22]研究表明，飲食中添加葫蘆巴堿可以抑制腫瘤壞死因子-α（TNF-α）形成，使得血紅蛋白糖化和脂質(zhì)積累，下調(diào)還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶和線粒體電子傳遞系統(tǒng)的基因表達(dá)，葫蘆巴堿能夠抑制或減緩機(jī)體的氧化應(yīng)激。槲皮素是一種天然的黃酮類化合物，具有良好的抗癌[23]、抗炎[24]、抗氧化[25]活性，可以抑制由炎癥因子脂多糖所引起的中性粒細(xì)胞自發(fā)性凋亡的延遲，同時槲皮素也可降低中性粒細(xì)胞對炎癥因子的敏感性，從而達(dá)到抗炎的目的[26]。Butt 等[27]的研究發(fā)現(xiàn)，姜酮等香料類生物活性物質(zhì)的高抗氧化活性可以在細(xì)胞水平上激發(fā)自由基清除能力，從而緩解各種代謝綜合征，此外，香料類生物活性物質(zhì)能夠增強(qiáng)免疫和減少炎癥。

對靶點蛋白PPI 網(wǎng)絡(luò)的分析顯示，EP300、PIK3CA、TP53、Akt1、CREBBP、STAT3 等靶點蛋白DC 值較高，意味著這些蛋白與其他蛋白作用較多，可能在旋覆代赭湯治療GERD 的過程中發(fā)揮重要作用。EP300 和CREBBP 是屬于KAT3 家族的組蛋白/蛋白賴氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶，其作為轉(zhuǎn)錄活化因子能夠通過修飾組蛋白和非組蛋白核蛋白的賴氨酸殘基，增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄[28]。CREBBP 和EP300的失活突變會導(dǎo)致基因組整體乙酰化水平降低和基因調(diào)控異常，潛在的促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生[29]。TP53作為與人類腫瘤相關(guān)性最高的抑癌基因，一直以來受到廣泛的關(guān)注。TP53基因編碼蛋白質(zhì)為p53，作為轉(zhuǎn)錄因子，p53 誘導(dǎo)下游蛋白p21、BAX 和GADD4 等表達(dá)，在細(xì)胞凋亡、周期變化、DNA 修復(fù)、細(xì)胞代謝及自噬過程中都起著重要的作用[30-32]。Akt 是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶[33]。PIK3CA基因?qū)儆谠┗虻囊环N，可表達(dá)于正常的人體組織中，通常不易被檢測到，在正常細(xì)胞中起調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和凋亡等作用，在突變時可呈過度表達(dá)，促使PI3K 催化活性增強(qiáng)及蛋白合成量增加，激活下游靶點Akt。激活后的Akt 具有生物活性，能持續(xù)刺激下游一系列靶蛋白，從而抑制凋亡基因的表達(dá)，引起細(xì)胞周期變短，從而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[34]。STAT3 可通過介導(dǎo)炎癥介質(zhì)的細(xì)胞外信號調(diào)控腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞等的生物學(xué)行為，是慢性炎癥促進(jìn)腫瘤發(fā)生及腫瘤相關(guān)性炎癥形成過程中不可或缺的關(guān)鍵性分子[35]。此外，近期有研究報道，瞬時感受器電位香草酸受體1（transient receptor potential vanilloid 1，TRPV1）能夠直接或間接參與多種消化道疾病的病理生理過程，如疼痛發(fā)生、內(nèi)臟高敏感性、炎癥反應(yīng)等，GERD 患者食管黏膜TRPV1 表達(dá)量增加，且與患者的癥狀積分相關(guān)，提示TRPV1 受體在GERD 患者癥狀的產(chǎn)生中起著重要的作用[36-37]。本研究發(fā)現(xiàn)，麻黃堿、甘草次酸、甘草萜醇、樺木酸等活性成分均能夠作用于TRPV1，可能是旋覆代赭湯治療GERD的重要機(jī)制之一。

GO 富集分析結(jié)果顯示，旋覆代赭湯對GERD 的治療作用可能主要通過調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡、周期等，涉及氧化應(yīng)激反應(yīng)、血管生成、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞因子活動等。KEGG 通路富集分析結(jié)果主要包括內(nèi)分泌抵抗、NF-κB 信號通路、含血清素的神經(jīng)突觸、胃酸分泌、FoxO 信號通路等。Nomura 等[38]研究發(fā)現(xiàn)，代謝綜合征和肥胖是已知的GERD 危險因素，常在甲狀腺功能障礙和垂體功能減退等內(nèi)分泌疾病患者中發(fā)現(xiàn)。5-羥色胺（5-hydroxy tryptamine，5-HT）是調(diào)節(jié)胃腸道運動、分泌及感覺功能的重要神經(jīng)遞質(zhì)，90%存在于消化道黏膜[39]。崔秀芳等[40]臨床研究表明，胃食管反流病患者中5-HT 水平較高，且5-HT 水平與患者腹痛有關(guān)。張婷[41]研究發(fā)現(xiàn)，5-HT通過作用于5-HT4R，對離體食管黏膜肌條具有舒張作用，對于離體食管下括約肌條具有收縮作用。NF-κB 是一類關(guān)鍵性的核轉(zhuǎn)錄因子，與免疫細(xì)胞的活化、炎性分子轉(zhuǎn)錄的調(diào)控、T 和B 淋巴細(xì)胞的發(fā)育、細(xì)胞凋亡、應(yīng)激性反應(yīng)等有關(guān)[42]。FoxO 家族是轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，其上游受PI3K/PKB 磷酸化級聯(lián)通路的調(diào)節(jié)，下游調(diào)節(jié)的靶基因多與細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、衰老及代謝有關(guān)，F(xiàn)oxO 的磷酸化/非磷酸化狀態(tài)與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能有密切關(guān)系[43]。由于FoxO 的促凋亡和抗增殖作用，其被認(rèn)為是腫瘤抑制因子，在抗腫瘤中起著至關(guān)重要的作用[44-45]。

綜上所述，本研究基于中藥多成分、多靶點、多途徑作用的研究思路，以生物信息學(xué)及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)為基礎(chǔ)，篩選出Barrett 食管細(xì)胞系接觸膽汁酸不同時間的差異基因，構(gòu)建了化合物-關(guān)鍵靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)、靶點PPI網(wǎng)絡(luò)和化合物-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)，對關(guān)鍵藥效分子和關(guān)鍵靶點進(jìn)行了分析。研究發(fā)現(xiàn)，旋覆代赭湯中的白樺脂醇、姜酮、槲皮素、延胡索乙素、葫蘆巴堿等活性成分，能夠作用于EP300、PIK3CA、TP53、Akt1、CREBBP、STAT3、TRPV1等靶點，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞因子活動、胃酸分泌、胃腸道運動等生物過程達(dá)到治療GERD 的目的。本研究初步闡述了旋覆代赭湯治療GERD 的作用機(jī)制，為后續(xù)研究提供了參考。但中藥的化合物成分及潛在靶點并未全部錄入，因此諸多機(jī)制尚待實驗研究驗證。