段吉平，段瓊，2a，王鐵戰(zhàn)，馬春艷，劉永利*，馮麗

1.河北省藥品檢驗(yàn)研究院，河北 石家莊 050011；

2.河北醫(yī)科大學(xué)，河北 石家莊 050017

當(dāng)藥Swertiae Herba 為龍膽科獐牙菜屬瘤毛獐牙菜Swertia pseudochinensisHara 的干燥全草[1]，于夏、秋季節(jié)采挖，在河北、內(nèi)蒙古藥用時曾被稱為“肝炎草”?！吨腥A人民共和國藥典》2020 年版中記載其味苦，性寒，歸肝、胃、大腸經(jīng)，用于濕熱黃疸、脅痛、痢疾腹痛、食欲不振[2]。其在《內(nèi)蒙古中草藥》[3]、《中華本草》[4]、《全國中草藥匯編》[5]、《河北植物志》（第二卷）[6]中均有記載。目前，對當(dāng)藥的研究相對較少，化學(xué)成分方面也鮮見報道。本實(shí)驗(yàn)采用超高效液相色譜-四級桿-飛行時間質(zhì)譜法（UPLC-Q-TOF-MS）對當(dāng)藥進(jìn)行化學(xué)成分分析，同時對多類別的成分進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定及確認(rèn)，為當(dāng)藥化學(xué)成分和藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究及多元質(zhì)量評價方法的建立提供參考。

1 材料

1.1 試藥

當(dāng)藥藥材購自安國藥材市場，經(jīng)河北省藥品檢驗(yàn)研究院牛小蓮主任藥師鑒定為龍膽科獐牙菜屬瘤毛獐牙菜Swertia pseudochinensisHara的干燥全草。

對照品龍膽苦苷（批號：770-200105）、當(dāng)藥苷（批號：111742-200501）、獐牙菜苦苷（批號：0785-200203）、芒果苷（批號：111607-201503）、齊墩果酸（批號：110709-201808）、甜菜堿（批號：110894-200503）和槲皮素（批號：100081-201610）均購自中國食品藥品檢定研究院，純度均大于99%。

甲醇（分析純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司）；質(zhì)譜用甲酸（Fisher 公司）；乙腈和甲醇（色譜純，Merck公司）。

1.2 儀器

LC-TripleTOF?5600+型液質(zhì)聯(lián)用儀（SCIEX 公司），配備Analyst?TF 1.6 質(zhì)譜操作軟件、PeakView 2.0 質(zhì)譜圖分析軟件；AG245 型電子天平（Mettler Toledo公司）；KQ-400KDE型超聲清洗儀（昆山超聲儀器有限公司）。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱為菲羅門Kinetex XB-C18100A（100 mm×2.1 mm，2.6 μm）。流動相為0.1% 甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～4 min，15%B；4～7 min，15%～30%B；7～10 min，30%～40%B；10～11 min，40%～50%B；11～30 min，50%～70%B；30～40 min，70%～100%B；40～42 min，100%B；42.1～45 min，15%B）。柱溫：20 ℃，流速：0.3 mL·min-1，進(jìn)樣量：1 μL。

2.2 質(zhì)譜條件

采用電噴霧離子源（ESI），正離子和負(fù)離子掃描模式。正離子模式下電噴霧電壓為5500 V，氣簾氣（CUR）為30 psi（1 psi≈6.79 kPa，下同），去簇電壓（DP）為80 V，碰撞能量（CE）為10 V；負(fù)離子模式下電噴霧電壓為4500 V，CUR 為30 psi，DP為80 V，CE為10 V。掃描質(zhì)量數(shù)為m/z100～1000。

2.3 溶液的制備

2.3.1 對照品溶液制備 取7 種對照品適量，分別加甲醇制成質(zhì)量濃度為10 μg·mL-1的單一對照品溶液。

2.3.2 供試品溶液制備 取當(dāng)藥適量，粉碎，過三號篩，混勻，取0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理15 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.4 化學(xué)成分分析

按2.1 和2.2 項(xiàng)下分析條件，對當(dāng)藥樣品進(jìn)行正、負(fù)離子模式分析，使用PeakView 2.0 質(zhì)譜圖分析軟件對所得到的樣品進(jìn)行處理并對色譜峰進(jìn)行同位素及MS/MS 碎片分析。首先，與對照品圖譜中各已知成分的相對保留時間（tR）、準(zhǔn)分子離子、二級質(zhì)譜碎片等進(jìn)行比對，再結(jié)合現(xiàn)有文獻(xiàn)中同屬植物的化學(xué)物質(zhì)建立樣品的Session 篩選庫[7]，對樣品中的色譜峰進(jìn)行解析，以滿足質(zhì)量誤差＜5×10-6、同位素分布正確且有二級碎片的化合物作為目標(biāo)物質(zhì)。逐一分析物質(zhì)的同位素信息和MS/MS碎片碎裂規(guī)律，并結(jié)合Formula Finder 分析結(jié)果，推斷可能的候選化合物[8-15]。

3 結(jié)果

3.1 色譜峰的鑒定

當(dāng)藥樣品正、負(fù)離子模式下得到的總離子流圖（TIC）見圖1。共確認(rèn)29 個化合物，包括7 個環(huán)烯醚萜類、13 個酮類、4 個黃酮類、2 個三萜類、2 個生物堿類和1 個核苷類成分。其中10 個為當(dāng)藥中未見報道的成分，見表1。

表1 當(dāng)藥中確認(rèn)的29個成分信息

續(xù)表1

3.2 各類化合物分析鑒定

3.2.1 環(huán)烯醚萜類化合物 從當(dāng)藥中鑒定出的環(huán)烯醚萜類成分主要有獐牙菜苦苷、龍膽苦苷、當(dāng)藥苷、苦當(dāng)藥苷、苦龍苷、馬錢苷酸和日本獐牙菜苷7 個成分。環(huán)烯醚萜類成分主要具有特征的二氫吡喃環(huán)順式連接1 個五元環(huán)的單元結(jié)構(gòu)，而當(dāng)藥中主要存在環(huán)戊烷型和裂環(huán)烯醚萜苷2 種類型。在所采用的色譜系統(tǒng)中加入了甲酸，故環(huán)烯醚萜類物質(zhì)準(zhǔn)分子離子峰存在[M+HCOO]-及[M-H]-2 種形式。當(dāng)藥中的環(huán)烯醚萜類結(jié)構(gòu)均存在-C6H10O5碎片丟失，同時因裂環(huán)烯醚萜苷類化合物具有半縮醛結(jié)構(gòu)，化學(xué)性質(zhì)活潑，在糖苷鍵斷裂后繼而發(fā)生逆狄爾斯-阿德爾（RDA）裂解，失去-CO2、-H2O 等碎片，同時可能發(fā)生-CH3的丟失。以當(dāng)藥苷為例，m/z403.123 5[M+HCOO]-與m/z357.119 2[M-H]-同時存在于系統(tǒng)中，但[M+HCOO]-響應(yīng)明顯強(qiáng)于[M-H]-。在丟失-C6H10O5碎片后，繼而發(fā)生RDA 裂解，脫去-CO2，得到m/z151.075 8[M-C6H10O5-CO2-H]-。

3 號色譜峰保留時間為3.70 min，根據(jù)PeakView 2.0 質(zhì)譜圖軟件分析化學(xué)式為C16H24O10，理論質(zhì)量數(shù)為376.136 95[M]，在負(fù)離子檢測模式下實(shí)際測得質(zhì)量數(shù)為m/z375.131 63[M-H]-。其進(jìn)一步脫葡萄糖基產(chǎn)生m/z213.076 1[M-C6H10O5-H]-，由于羧基的不穩(wěn)定性，[M-C6H10O5-H]-脫去羧基得到m/z169.087 0[M-C6H10O5-CO2-H]-，再脫去中性小分子H2O，得到m/z151.075 3 [C9H11O2]-。該化合物與文獻(xiàn)報道的馬錢苷酸碎片信息一致[17]，推測其為馬錢苷酸。從其MS/MS 圖中所得到的碎片離子信息可解析其裂解方式，見圖2。

圖2 馬錢苷酸裂解途徑

圖3 當(dāng)藥中的11個單酮及酮苷

圖4 當(dāng)藥呫噸酮裂解途徑

圖5 3-O-去甲基紫藥雙呫噸酮苷裂解途徑

具有O苷鍵的酮苷中，因糖苷鍵的不穩(wěn)定性，首先生成帶1個負(fù)電荷的酮苷元。12號色譜峰保留時間為7.00 min，根據(jù)PeakView 2.0質(zhì)譜圖軟件分析化學(xué)式為C26H30O16，理論質(zhì)量數(shù)為598.153 39[M]，在負(fù)離子檢測模式下實(shí)際測得為m/z597.146 11[M-H]-。母離子脫去-C12H20O10，生成的碎片離子為m/z273.041 1[M-C12H20O10-H]-。m/z273.041 1[M-C12H20O10-H]-在丟失-CH3碎片后，繼而丟失-CO，產(chǎn)生m/z258.017 7[M-C12H20O10-CH3-H]-及m/z230.022 7 [MC12H20O10-CH3-CO-H]-的碎片。推測該化合物可能為紫藥雙呫噸酮苷。

3.2.3 黃酮類化合物 當(dāng)藥中主要鑒定出4 個黃酮類化合物，包括當(dāng)藥黃素、異牡荊素、異葒草素和槲皮素。在負(fù)離子掃描條件下，黃酮類成分易中性丟失-CO、-CO2，并可能在糖基的部分發(fā)生RDA裂解。10號色譜峰保留時間為6.16 min，根據(jù)PeakView 2.0質(zhì)譜圖軟件分析化學(xué)式為C22H22O11，理論質(zhì)量數(shù)為462.116 21[M]，在負(fù)離子檢測模式下實(shí)際測得質(zhì)量數(shù)為m/z461.108 94[M-H]-。母離子發(fā)生RDA反應(yīng)，生成了m/z341.068 8[M-120-H]-的碎片，隨后又丟失-CO及-CH3，得到m/z313.037 2[M-120-CO-H]-和m/z298.050 2[M-120-CO-CH3-H]-。推測該化合物為當(dāng)藥黃素。

3.2.4 三萜類化合物 28 號色譜峰保留時間為27.60 min，根據(jù)PeakView 2.0 質(zhì)譜圖軟件分析化學(xué)式為C30H48O3，其一級和二級質(zhì)譜圖與齊墩果酸對照品一致。齊墩果酸理論質(zhì)量數(shù)為m/z456.360 3[M]，在負(fù)離子檢測模式下實(shí)際測得質(zhì)量數(shù)為m/z455.353 07[M-H]-，母離子經(jīng)過脫羧反應(yīng)、失去活潑氫和1 分子H2O，形成了共軛結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定碎片離子m/z407.334 4[M-H-HCOOH-2H]-和m/z391.304 3[MHCOOH-H2O-H]-碎片離子。

29 號色譜峰保留時間為29.50 min，根據(jù)PeakView 2.0 質(zhì)譜圖軟件分析化學(xué)式為C30H48O，理論質(zhì)量數(shù)為424.370 52[M]。在正離子檢測模式下測得質(zhì)量數(shù)為m/z425.377 79[M+H]+。母離子發(fā)生RDA裂解，生成m/z301.258 3[M-124]+的碎片，推測其結(jié)構(gòu)為蒲公英賽-14-烯-3-酮。

3.2.5 生物堿類化合物 1 號色譜峰保留時間為0.74 min，根據(jù)PeakView 2.0質(zhì)譜圖軟件分析化學(xué)式為C5H11NO2，其保留時間、一級和二級質(zhì)譜圖與甜菜堿對照品一致。甜菜堿理論質(zhì)量數(shù)為m/z117.078 98[M]，在正離子模式下，實(shí)際測得質(zhì)量數(shù)為m/z118.086 26[M+H]+，母離子發(fā)生化學(xué)鍵斷裂及重排失去m/z59.073 5[N(CH3)3]+和m/z60.021 1 [CH3COOH]+的碎片，得到m/z59.076 2[M-N(CH3)3+H]+和m/z58.070 4[M-CH3COOH+H]+的碎片離子。

8 號色譜峰保留時間為5.30 min，根據(jù)PeakView 2.0質(zhì)譜圖軟件分析化學(xué)式為C10H9NO2，理論質(zhì)量數(shù)為175.063 33[M]，在正離子模式下，實(shí)際測得質(zhì)量數(shù)為m/z176.070 61[M+H]+。母離子發(fā)生化學(xué)鍵斷裂及重排失去HCHO，得到m/z146.060 0[MHCHO+H]+，隨后[M-HCHO+H]+丟失CO，得到m/z118.066 2 的碎片離子，推測結(jié)構(gòu)為龍膽堿，裂解途徑見圖6。

圖6 龍膽堿的裂解途徑

3.2.6 核苷類化合物 29 號色譜峰保留時間為1.22 min，根據(jù)PeakView 2.0 質(zhì)譜圖軟件分析化學(xué)式為C10H13N5O4，理論質(zhì)量數(shù)為267.096 75[M]，在正離子模式下，實(shí)際測得質(zhì)量數(shù)為m/z268.104 41[M+H]+，母離子發(fā)生化學(xué)鍵斷裂及重排失去C5H9O4，得到m/z136.062 4的碎片離子。推測結(jié)構(gòu)為腺苷。

4 討論

本研究應(yīng)用UPLC-Q-TOF-MS、Analyst?TF 1.6 Software 質(zhì)譜操作軟件和PeakView 2.0 質(zhì)譜圖分析軟件對當(dāng)藥的化學(xué)成分進(jìn)行分析，建立了獐牙菜屬植物的物質(zhì)篩選庫，對樣品中色譜峰進(jìn)行解析，分析物質(zhì)的同位素信息和MS/MS 碎片信息，與對照品圖譜中各已知成分的保留時間、準(zhǔn)分子離子、二級質(zhì)譜碎片等進(jìn)行比對，再結(jié)合現(xiàn)有文獻(xiàn)中同屬植物的化學(xué)物質(zhì)[7]，對樣品中的色譜峰進(jìn)行解析。最終確認(rèn)了當(dāng)藥中的7個環(huán)烯醚萜類、13個酮類、4個黃酮類、2 個三萜類、2 個生物堿類和1 個核苷類成分。其中馬錢苷酸、龍膽堿、紫藥雙呫噸酮苷、日本獐牙菜苷、3-O-去甲基紫藥雙呫噸酮苷、槲皮素、龍膽賽因、狹葉獐牙菜素A、腺苷和蒲公英賽-14-烯-3-酮為首次在當(dāng)藥中報道。