李曉玲，蘇法銘，陳永華，劉美蓮，陳曉銘

甲狀腺癌作為內(nèi)分泌系統(tǒng)和頭頸部常見的惡性腫瘤之一，其病理類型包括甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma, PTC)、濾泡癌、髓樣癌和未分化癌，其中PTC最為常見，約占甲狀腺癌的89.4%[1]。盡管PTC預(yù)后相對(duì)較好，但其早期易出現(xiàn)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[2]，而淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和被膜侵襲等是導(dǎo)致PTC患者發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的重要危險(xiǎn)因素[3]。近年，早期預(yù)測(cè)和診斷PTC分子標(biāo)志物的研究受到越來越多學(xué)者的關(guān)注。尋找相關(guān)分子標(biāo)志物可靠、可行的檢測(cè)手段，對(duì)PTC的診斷具有重要的臨床意義。本文采用免疫組化法探討SphK1和CD56在PTC組織中的表達(dá)及其在頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的意義，旨在為臨床早期診斷PTC及判斷其預(yù)后提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料收集2017年12月1日～2019年3月31日廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院確診的PTC患者86例，其中無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者41例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者45例，由兩位高年資病理醫(yī)師復(fù)閱切片確診，同時(shí)收集各病例的臨床資料。所用SphK1兔抗人多克隆抗體、CD56兔抗人多克隆抗體購(gòu)自武漢博士德生物公司，二抗及其他試劑均購(gòu)自福州邁新公司。

1.2 方法標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定、石蠟包埋，常規(guī)切片，HE染色，光鏡下觀察，免疫組化染色采用MaxVision法。將磷酸鹽緩沖液為一抗作為陰性對(duì)照，比較上述分子標(biāo)志物在有、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PTC組和癌旁甲狀腺組織中的表達(dá)差異。

1.3 結(jié)果判斷免疫組化染色結(jié)果由兩位病理科醫(yī)師采用雙盲法獨(dú)立閱片。SphK1表達(dá)定位于胞質(zhì)，CD56表達(dá)定位于胞膜和(或)胞質(zhì)。根據(jù)染色強(qiáng)度評(píng)分：無(wú)陽(yáng)性染色為0分，弱染色為1分，中等染色為2分，強(qiáng)染色為3分。根據(jù)腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性范圍評(píng)分：陽(yáng)性細(xì)胞范圍<25%為1分，25%～49%為2分，50%～75%為3分，>75%為4分。將兩項(xiàng)評(píng)分相乘得出染色指數(shù)(staining index, SI)來判斷SphK1和CD56在切片標(biāo)本組織中的表達(dá)水平。將SI=4～6中等陽(yáng)性()及SI>6強(qiáng)陽(yáng)性()定義為高表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 臨床特征86例PTC中，男性22例，女性64例，年齡21～63歲，平均(47.19±13.58)歲；無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者41例，其中男性13例、女性28例，<45歲22例、≥45歲19例，腫瘤單發(fā)18例、多發(fā)23例，腫瘤直徑≥1 cm者26例、<1 cm者15例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者45例，其中男性9例，女性36例，<45歲32例、≥45歲13例，腫瘤單發(fā)15例、多發(fā)30例，腫瘤直徑≥1 cm者34例、<1 cm者11例。兩組患者臨床特征差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 各組織中SphK1的表達(dá)SphK1在癌旁甲狀腺組織、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PTC組織中的高表達(dá)率分別為20.93%、70.73%、68.89%。SphK1在無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PTC組織中的表達(dá)高于癌旁甲狀腺組織(P<0.05)；SphK1在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PTC組織中的表達(dá)高于癌旁甲狀腺組織(P<0.05)；SphK1在有、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PTC組織中的表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表1，圖1)。

圖1 A.癌旁甲狀腺濾泡中SphK1呈陰性，MaxVision法；B.無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移PTC組織中SphK1呈陽(yáng)性，定位于細(xì)胞質(zhì)，MaxVision法；C.有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PTC組織中SphK1呈陽(yáng)性，定位于細(xì)胞質(zhì)，MaxVision法 圖2 A.PTC及其癌旁甲狀腺濾泡；B.無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PTC中CD56呈細(xì)胞膜/細(xì)胞質(zhì)灶性弱陽(yáng)性，其癌旁甲狀腺濾泡細(xì)胞膜/細(xì)胞質(zhì)呈陽(yáng)性，MaxVision法；C.有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PTC組織中CD56細(xì)胞膜/細(xì)胞質(zhì)呈陰性/缺失，其癌旁甲狀腺濾泡細(xì)胞膜/細(xì)胞質(zhì)呈陽(yáng)性，MaxVision法

表1 各組織中SphK1的表達(dá)水平

2.3 各組織中CD56的表達(dá)CD56在癌旁組織、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移PTC組織中的高表達(dá)率分別為65.12%、26.83%、33.33%。CD56在無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移PTC組織中的表達(dá)低于癌旁甲狀腺組織(P<0.05)；CD56在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移PTC組織中的表達(dá)低于癌旁甲狀腺組織(P<0.05)；CD56在有、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PTC組織中的表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表2，圖2)。

表2 各組織中CD56的表達(dá)水平

2.4 PTC中SphK1和CD56表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系SphK1、CD56表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤數(shù)量及腫瘤大小均無(wú)相關(guān)性(P>0.05，表3)。

表3 PTC中SphK1和CD56表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

3 討論

甲狀腺癌是內(nèi)分泌系統(tǒng)和頭頸部常見的惡性腫瘤之一，在實(shí)際臨床工作中，診斷金標(biāo)準(zhǔn)仍有賴于光鏡下組織病理學(xué)改變。然而光鏡下部分形成假乳頭或伴有乳頭狀增生的結(jié)節(jié)性甲狀腺腫與PTC鑒別困難，易誤、漏診。隨著人們生活方式的改變，PTC有低齡化趨勢(shì)，雖然PTC相比其他惡性腫瘤的預(yù)后一般較好[4]，但發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PTC患者預(yù)后不良。有研究表明年齡較小的PTC患者比年齡較大的PTC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移更具易感性[5]。尋找早期發(fā)現(xiàn)和診斷PTC及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的方法，減少誤、漏診，尤其是年齡較小者，是延長(zhǎng)患者預(yù)期壽命和改善疾病預(yù)后的關(guān)鍵。分子標(biāo)志物在分子層面上參與疾病的發(fā)生、發(fā)展，而疾病在分子層面上的改變往往早于臨床表現(xiàn)，故分子標(biāo)志物具有早期發(fā)現(xiàn)或預(yù)測(cè)疾病發(fā)生、發(fā)展的潛在價(jià)值。

SphK1作為鞘磷脂的活性代謝產(chǎn)物1-磷酸鞘氨醇(S1P)在體內(nèi)生物合成過程中的限速酶，參與體內(nèi)磷脂代謝、炎癥反應(yīng)及心血管與神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理生理過程[6]，其主要表達(dá)于正常脾臟、腦與胸腺中，與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[7]。SphK1通過調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡而參與腫瘤的進(jìn)程。Li等[8]采用免疫組化法檢測(cè)175例胃癌中SphK1的表達(dá)，其中115例表達(dá)較高，而相鄰的癌旁胃組織中表達(dá)較低或未檢測(cè)到。Kim等[9]通過免疫組化法檢測(cè)287例子宮頸癌組織和5例正常子宮頸組織中SphK1的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)183例子宮頸癌組織中SphK1高表達(dá)，而正常子宮頸組織SphK1均陰性。目前有關(guān)SphK1在PTC組織中表達(dá)的報(bào)道較少，Do等[10]采用免疫組化EnVision法檢測(cè)SphK1的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)81例正常甲狀腺組織均陰性，16例結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織中4例呈微弱陽(yáng)性，而110例PTC組織中34例陽(yáng)性較強(qiáng)，SphK1在PTC組織的表達(dá)水平高于結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織。本實(shí)驗(yàn)中無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PTC組織中SphK1高表達(dá)率分別為70.73%和68.89%，癌旁甲狀腺組織為20.93%，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析提示有、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PTC組織中SphK1的表達(dá)均高于癌旁甲狀腺組織，表明SphK1在PTC癌組織中表達(dá)水平增高。Do等[10]另對(duì)SphK1表達(dá)和PTC是否并發(fā)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SphK1的表達(dá)相較于年齡(≥43歲或<43歲)、性別、腫瘤單發(fā)或多發(fā)、腫瘤直徑(≥1.0 cm或<1.0 cm)、甲狀旁腺是否受累和BRAF基因是否突變來說，其是唯一能作為PTC并發(fā)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，SphK1在已并發(fā)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PTC組織(45.3%)中的表達(dá)高于無(wú)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PTC組織(0.9%)。孫雪玲等[11]研究亦發(fā)現(xiàn)SphK1可能參與PTC的發(fā)生、發(fā)展和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，提示其可能成為甲狀腺腫瘤良、惡性診斷和早期淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的重要生物學(xué)因子。然而本組中SphK1在無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移PTC組織中的高表達(dá)率(70.73%)和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移PTC組織(68.89%)相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示SphK1表達(dá)與PTC是否并發(fā)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)確切相關(guān)性。

CD56作為免疫球蛋白超家族中的神經(jīng)細(xì)胞黏附分子，表達(dá)于正常甲狀腺濾泡上皮及神經(jīng)元、星形細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞，主要用于神經(jīng)母細(xì)胞瘤、髓母細(xì)胞瘤和視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤等腫瘤的診斷。但其在甲狀腺腫瘤診斷中的應(yīng)用報(bào)道不一。多個(gè)研究[12-14]提示，甲狀腺良性病變中CD56陽(yáng)性率更高，而在PTC中常呈灶性弱表達(dá)或表達(dá)缺失，在癌旁正常組織中則呈高表達(dá)。陳英等[15]認(rèn)為CD56在診斷PTC中可發(fā)揮重要作用，特別是濾泡亞型PTC與其他濾泡性腫瘤鑒別。許超等[16]報(bào)道PTC中CD56表達(dá)減弱及缺失與病理特征的惡化、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的發(fā)生密切相關(guān)。劉芳芳等[17]收集719例非高危型甲狀腺微小乳頭狀癌(papillary thyroid microcarcinoma, PTMC)，分析臨床病理因素與淋巴結(jié)癌轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系，并與PTC進(jìn)行比較，采用免疫組化法檢測(cè)4種腫瘤標(biāo)志物CK19、HMBE-1、Galectin-3和CD56的表達(dá)，結(jié)果顯示CD56的陽(yáng)性率分別為25.6%(85/232)和20.0%(70/350)，提示腫瘤標(biāo)志物CD56單獨(dú)表達(dá)不能作為否定PTMC和PTC的診斷依據(jù)。張哲等[18]提示CK19、MC陽(yáng)性聯(lián)合CD56、TPO陰性可提高PTC診斷的準(zhǔn)確性和特異性。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CD56在PTC中的表達(dá)并進(jìn)行分析，結(jié)果顯示PTC無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組和PTC有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組CD56的高表達(dá)率分別為26.83%和33.33%，明顯低于癌旁良性甲狀腺組織(65.12%)，提示CD56在PTC中低表達(dá)，但在有、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移PTC兩組中的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

綜上，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示SphK1過表達(dá)和CD56弱表達(dá)或缺失可提高PTC診斷的準(zhǔn)確性，對(duì)減少其漏診及誤診有一定幫助，但兩者對(duì)PTC是否并發(fā)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移并無(wú)明確診斷或預(yù)測(cè)價(jià)值。