婁 寧，楊 帆，王莉芝，蔡仁萍，解麗梅

肺癌是發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤，近年來其發(fā)病率呈上升趨勢，患者長期預(yù)后差，5年生存率不足20%[1-2]，大多數(shù)患者就診時腫瘤已進展為中晚期，部分患者甚至發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，而腫瘤血管生成是肺癌浸潤和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素[3]。近年來發(fā)現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄因子21(transcription factor 21, TCF21)參與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移，如在結(jié)腸癌、腎癌等組織中作為潛在的抑癌基因通過抑制腫瘤血管生成發(fā)揮生物學(xué)作用[3-4]，然而其在肺癌中的作用機制尚未見報道。本實驗通過分析肺腺癌組織中TCF21、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)表達與微血管密度(microvessel density, MVD)及預(yù)后的相關(guān)性，旨在對其致病機制、疾病預(yù)后等方面的研究提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料收集2016年1月～2017年12月山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬萊鋼醫(yī)院病理科存檔的91例肺腺癌及癌旁組織(距離腫瘤邊緣>2 cm)，均經(jīng)病理學(xué)明確診斷。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)術(shù)前未接受任何治療(過放、化療、免疫治療或靶向治療)；(2)臨床和病理資料保存完整；(3)未合并其他類型的惡性腫瘤?；颊咂骄挲g62.1歲(范圍37～79歲)；其中男性55例，女性36例；年齡≤60歲者41例，>60歲者50例。腫瘤直徑≥3 cm者46例，<3 cm者45例。TNM分期：Ⅰ+Ⅱ期34例，Ⅲ+Ⅳ期57例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者43例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者48例。所有標(biāo)本的使用均經(jīng)患者知情同意，本實驗經(jīng)山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬萊鋼醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 免疫組化標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，常規(guī)HE染色。免疫組化：確診的肺腺癌石蠟標(biāo)本，4 μm厚連續(xù)切片，65 ℃烤2.5 h，二甲苯脫蠟，梯度乙醇復(fù)水，待微波爐內(nèi)的枸櫞酸鈉(pH 6.5)緩沖液沸騰后，抗原修復(fù)10 min，室溫下復(fù)溫。3%過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，山羊血清封閉非特異性位點，加入一抗，4 ℃恒溫過夜。用PBS溶液代替一抗作為陰性對照。室溫復(fù)溫、洗滌后加入二抗、辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素，DAB顯色，蘇木精復(fù)染、脫水、透明、封膠。TCF21(購自華安生物公司)以細胞核呈棕黃色為陽性，VEGF、CD34(購自北京中杉金橋公司)以細胞質(zhì)呈棕黃色為陽性。染色結(jié)果由兩位病理醫(yī)師采用雙盲法各自獨立評判，采用半定量法結(jié)合染色強度和染色范圍評判表達結(jié)果。根據(jù)陽性細胞百分數(shù)計分：≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。根據(jù)細胞染色強度計分：無陽性著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。將上述兩項得分結(jié)果相乘：0～2分為陰性，3～12分為陽性。

1.3 MVD計數(shù)采用Weidner法，用CD34標(biāo)記腫瘤微血管內(nèi)皮細胞，陽性呈淺棕色至深棕色。首先于顯微鏡低倍鏡下在腫瘤間質(zhì)內(nèi)尋找微血管密集區(qū)域，然后用高倍鏡計數(shù)5個視野的微血管數(shù)，取其平均值為MVD值。計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)：任何可被染成棕黃色呈陽性的血管內(nèi)皮細胞或內(nèi)皮細胞簇，與鄰近血管、腫瘤細胞或其他組織之間存在明顯分隔的視為1個微血管。所有切片均采用雙盲法閱片。

1.4 隨訪91例患者隨訪3～36個月，22例存活，5例失訪，64例死亡，隨訪截至2020年12月31日。

2 結(jié)果

2.1 肺腺癌及癌旁正常組織中TCF21、VEGF的表達肺腺癌分化較好時常可見腺樣結(jié)構(gòu)(圖1)。TCF21表達于細胞核，著色為淡黃色(圖2)、棕褐色(圖3)等。VEGF主要表達于細胞質(zhì)，著色為棕褐色(圖4)、淡黃色(圖5)等。TCF21、VEGF在肺腺癌組織中的陽性率分別為45.1%(41/91)和60.4%(55/91)；在癌旁正常組織中的陽性率分別為90.0%(27/30)和0；TCF21在肺腺癌組織中的陽性率明顯低于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；VEGF在肺腺癌組織中的陽性率明顯高于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 TCF21、VEGF表達及MVD與肺腺癌臨床病理特征的關(guān)系TCF21、VEGF表達及MVD與肺腺癌分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期相關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與患者性別、年齡、腫瘤直徑均無相關(guān)性，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，表1)。

表1 肺腺癌中TCF21、VEGF表達及MVD與臨床病理特征的關(guān)系

2.3 肺腺癌組織中TCF21、VEGF表達及MVD值的相關(guān)性91例肺腺癌組織中TCF21陽性41例，陰性50例；VEGF陽性55例，陰性36例；兩者均陽性10例，均陰性5例，TCF21陽性+VEGF陰性者31例，TCF21陰性+VEGF陽性者45例。Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示，肺腺癌組織中TCF21與VEGF的表達呈負相關(guān)(r=-0.668，P<0.05)。TCF21表達與MVD值呈負相關(guān)(r=-0.542，P<0.05)；VEGF表達與MVD值呈正相關(guān)(r=0.468，P<0.05)。TCF21陽性組MVD值顯著低于陰性組，VEGF陽性組MVD值明顯高于陰性組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表2)。

表2 肺腺癌中TCF21和VEGF表達與MVD值的關(guān)系

2.4 肺腺癌組織中TCF21、VEGF表達及MVD值與患者預(yù)后的關(guān)系應(yīng)用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，TCF21陰性組患者的生存期明顯低于陽性組，Log-rank檢驗顯示，兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=10.733，P=0.001)。VEGF陰性組患者的生存期明顯高于陽性組，Log-rank檢驗顯示，兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=11.380，P=0.001)。MVD值取中位數(shù)，高于中位數(shù)為高表達，低于中位數(shù)為低表達，MVD高表達組患者的生存期明顯低于低表達組，Log-rank檢驗顯示，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=19.017，P<0.001，圖6)。

圖6 Kaplan-Meier生存曲線分析：A．TCF21表達與肺腺癌患者預(yù)后的關(guān)系；B．VEGF表達與肺腺癌患者預(yù)后的關(guān)系；C．MVD表達與肺腺癌患者預(yù)后的關(guān)系

3 討論

TCF21屬于堿性螺旋-環(huán)-螺旋(basic helix-loop-helix proteins, BHLH)家族的a類成員，被認為是一種腫瘤抑制因子。鄧俊宇[5]的研究結(jié)果顯示，TCF21在結(jié)直腸癌組織中低表達，在結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展中可能起腫瘤轉(zhuǎn)移抑制作用。張輝等[6]應(yīng)用RNA干擾技術(shù)沉默腎癌Caki-1細胞中TCF21基因的表達，KISS-1蛋白表達顯著下調(diào)，進而抑制腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移。另有研究發(fā)現(xiàn)食管癌組織中TCF21 mRNA和蛋白表達均低于癌旁正常組織，TCF21低表達與TNM分期密切相關(guān)且患者預(yù)后較差[7]。本實驗結(jié)果顯示，TCF21在肺腺癌組織中的表達水平明顯低于癌旁組織，與上述研究結(jié)果吻合。然而在肺腺癌組織中VEGF表達水平及MVD值明顯高于癌旁正常組織，與TCF21表達呈負相關(guān)，提示TCF21低表達可能與肺腺癌發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，是一個腫瘤抑制因子，可能與其抑制腫瘤血管生成有關(guān)。本實驗結(jié)果顯示，TCF21表達水平與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期相關(guān)。生存曲線顯示，肺腺癌組織中TCF21低表達，患者生存率下降。這表明TCF21表達與肺腺癌患者預(yù)后呈負相關(guān)，其主要機制可能與抑制血管生成有關(guān)。

腫瘤血管生成機制一直是腫瘤轉(zhuǎn)移研究的關(guān)鍵因素之一[8-9]。近年來文獻報道，VEGF是血管生成的有效誘導(dǎo)劑，通過激活其下游信號分子，可影響血管內(nèi)皮細胞的增殖、遷移、侵襲，從而促進血管生成，促進腫瘤進展[10]。CD34可標(biāo)記新生血管內(nèi)皮細胞，常作為腫瘤MVD的標(biāo)志物，目前已將MVD作為評估腫瘤血管形成的重要標(biāo)準(zhǔn)。癌組織中TCF21低表達，是否與腫瘤血管生成相關(guān)尚未見報道，本實驗進一步深入探討。TCF21在膽管癌組織或細胞系中顯著下調(diào)，促進了腫瘤的生長或體內(nèi)腫瘤相關(guān)的血管生成，導(dǎo)致VEGF過表達和分泌。在細胞試驗中，TCF21的高表達顯著降低了內(nèi)皮細胞的活力、遷移和管的形成。因此，TCF21可抑制膽管癌腫瘤血管生成[11]。過表達TCF21可抑制質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人乳腺癌細胞系MDA-MB-231的侵襲、遷移和血管生成，促進腫瘤細胞凋亡，VEGF蛋白表達明顯降低。因此TCF21可能抑制細胞的血管生成和凋亡[12]。本實驗相關(guān)性分析結(jié)果表明，TCF21表達與VEGF表達及MVD值呈負相關(guān)。低表達的TCF21可能促進腫瘤組織中血管的生成，其可能是腫瘤血管生成的抑制因子，這與文獻報道的結(jié)果一致。腫瘤血管生成是腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)，VEGF表達及MVD值與肺腺癌患者年齡、性別及腫瘤直徑無相關(guān)性，與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期相關(guān)，與Li等[11]的結(jié)果一致。

TCF21可能在肺腺癌的血管生成中發(fā)揮重要作用，為肺腺癌的治療提供新的預(yù)測指標(biāo)和靶點；TCF21、VEGF、CD34均與患者預(yù)后有相關(guān)性，聯(lián)合檢測可作為肺腺癌惡性程度的評判指標(biāo)。