張 磊，蔣冬先，黃 潔，欒麗娟，管瑛瑛，徐 磊，宿杰阿克蘇，侯英勇

食管癌是我國主要的致死癌癥之一，據(jù)報道2014年超過19.3萬患者死于食管癌[1]。約90%新發(fā)食管癌病例的組織學類型是食管鱗狀細胞癌[2]。近年來雖然手術(shù)、放療、化療等治療手段不斷改善，但食管鱗狀細胞癌患者的預后并未改善，5年生存率約30%[3]。目前亟需尋找與食管鱗狀細胞癌患者預后相關(guān)的分子標志物。

細胞角蛋白7(CK7)是Ⅱ型細胞角蛋白，常用作上皮來源腫瘤標志物，如肺腺癌、乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌和腎細胞癌[4-8]。在鱗狀細胞癌中，CK7表達較少。最近有研究[9]發(fā)現(xiàn)，食管鱗狀細胞癌的部分區(qū)域存在CK7表達，且CK7表達與食管鱗狀細胞癌患者預后存在一定的相關(guān)性。目前尚缺乏關(guān)于CK7表達在食管鱗狀細胞癌的大規(guī)模分析。本文采用免疫組化ELPS法檢測512例食管鱗狀細胞癌中CK7的表達，分析其表達與臨床病理特征及患者預后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料收集2007年1月～2010年12月在復旦大學附屬中山醫(yī)院行食管癌根治術(shù)的512例患者的臨床病理資料?；颊咝g(shù)前均未接受放、化療。所有病例均經(jīng)兩名資深病理醫(yī)師再次復片確診為食管鱗狀細胞癌。收集的臨床病理資料包括：患者年齡、性別、吸煙史、腫瘤部位及腫瘤大小、分化情況、脈管及神經(jīng)束侵犯和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等。pTNM分期依據(jù)第8版美國癌癥聯(lián)合委員會(American Joint Committee on Cancer, AJCC)pTNM分期標準。

1.2 免疫組化采用免疫組化ELPS法檢測512例食管鱗狀細胞癌組織中CK7的表達。操作步驟嚴格遵照試劑盒說明書進行，一抗CK7單克隆抗體(克隆號OV-TL 12/30，DAKO公司)稀釋比1 ∶300，使用通靈免疫組化儀，組織切片常規(guī)脫蠟、水化，PBS緩沖液沖洗，一、二抗孵育，DAB顯色，蘇木精襯染，乙醇脫水干燥，中性樹膠封固。以食管固有腺體著色為陽性內(nèi)對照、淋巴細胞為陰性內(nèi)對照，腫瘤組織陽性判斷標準：CK7定位于細胞膜和細胞質(zhì)，陽性著色呈棕黃色顆粒，陽性細胞數(shù)≥10%為陽性。

1.3 隨訪所有患者均通過電話或者復查隨訪。無瘤生存期(disease free survival, DFS)指從患者手術(shù)之日起至出現(xiàn)復發(fā)、轉(zhuǎn)移、死于食管癌的時間或最后一次隨訪時間?？偵嫫?overall survival, OS)定義為手術(shù)后至患者死亡的時間或最后一次隨訪時間。

1.4 統(tǒng)計學分析采用SPSS 26.0軟件進行統(tǒng)計學分析。利用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，Log-rank法進行顯著性檢驗。預后影響因素的單因素及多因素分析采用Cox比例風險回歸模型。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 食管鱗狀細胞癌的臨床病理特征512例食管鱗狀細胞癌中，男性420例，女性92例，男女比約為4.6 ∶1；年齡34～83歲(中位年齡61歲)。198例(38.6%)患者有吸煙史。腫瘤平均直徑為3.3 cm，主要位于食管中下段。腫瘤高、中和低分化病例分別為20、288和204例。脈管和神經(jīng)束侵犯率分別為22.3%和35.0%。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率為46.3%。Ⅰ+Ⅱ期患者283例，Ⅲ+Ⅳa期患者229例。

2.2 食管鱗狀細胞癌中CK7的表達126例(24.6%)食管鱗狀細胞癌中CK7蛋白陽性，免疫組化染色范圍10%～100%(圖1)。CK7表達與患者年齡、性別、吸煙史、腫瘤大小及腫瘤部位、脈管和神經(jīng)束侵犯無相關(guān)性(P>0.05)。在低分化腫瘤中，CK7陽性率較高(32.4%)。無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中CK7的陽性率(21.1%)低于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(28.7%)，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.046)。Ⅰ+Ⅱ期組中CK7的陽性率(20.8%)低于Ⅲ+Ⅳ期組(29.3%)，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.028，表1)。

圖1 A.食管鱗狀細胞癌細胞呈巢團狀、梁索狀浸潤生長；B.食管鱗狀細胞癌中CK7陰性,ELPS法；C.食管鱗狀細胞癌中CK7陽性,ELPS法；D.食管鱗狀細胞癌CK7彌漫陽性，ELPS法

表1 食管鱗狀細胞癌中CK7表達與臨床病理特征的關(guān)系

2.3 食管鱗狀細胞癌中CK7表達與患者預后的相關(guān)性512例食管鱗狀細胞癌中，患者1、3和5年的總體生存率分別為87.9%、54.2%和44.3%。Kaplan-Meier生存分析顯示，CK7陰性和陽性組患者的中位DFS分別為41、24個月，中位OS分別為47、33個月，CK7陽性患者預后明顯比CK7陰性患者差(DFS：P=0.016；OS：P=0.020)(圖2A、B)。Cox單因素生存分析發(fā)現(xiàn)，腫瘤分化、脈管侵犯、神經(jīng)束侵犯、pTNM分期和CK7陽性與患者的DFS和OS相關(guān)；多因素生存分析顯示，pTNM分期是影響食管鱗狀細胞癌患者預后的獨立危險因素(表2，圖2C、D)。進一步分析CK7陽性分別在Ⅰ+Ⅱ期組和Ⅲ+Ⅳ期組患者中的預后意義，結(jié)果顯示，在Ⅰ+Ⅱ期食管鱗狀細胞癌中，CK7陽性患者的DFS和OS較短(DFS：P=0.047；OS：P=0.023)，提示部分患者預后差。在Ⅲ+Ⅳ期食管鱗狀細胞癌中，CK7陽性患者的DFS和OS與CK7陰性患者差異無顯著性(DFS：P=0.631；OS：P=0.824)(圖2E、F)。

圖2 CK7表達、pTNM分期與食管鱗狀細胞癌患者預后的相關(guān)性：A.CK7陽性患者的DFS較短；B.CK7陽性患者的OS較短；C.Ⅲ+Ⅳ期患者的DFS較短；D.Ⅲ+Ⅳ期患者的OS較短；E.Ⅰ+Ⅱ期食管鱗狀細胞癌中CK7陽性患者DFS較短，在Ⅲ+Ⅳ期食管鱗狀細胞癌中，CK7陽性患者的DFS與CK7陰性患者，差異無顯著性；F.在Ⅰ+Ⅱ期食管鱗狀細胞癌中，CK7陽性患者OS較短，在Ⅲ+Ⅳ期食管鱗狀細胞癌中，CK7陽性患者的OS與CK7陰性患者差異無顯著性有更惡性的生物學行為。需要進一步的研究來挖掘其具體的分子作用機制。

表2 食管鱗狀細胞癌患者預后影響因素的單因素和多因素Cox分析

3 討論

CK7常作為腺上皮的標志物，在鱗狀上皮中的研究較少。目前有關(guān)CK7在食管鱗狀細胞癌中的表達研究有限。2008年Yamada等[10]檢測126例日本食管鱗狀細胞癌中CK7的陽性率為22%。2013年Oue等[11]檢測225例日本食管鱗狀細胞癌患者的CK7陽性率為9%。2018年Xu等[12]檢測610例中國食管鱗狀細胞癌患者的CK7陽性率為10%。同年楊召陽等[9]檢測190例中國食管鱗狀細胞癌患者的CK7陽性率為15.3%。以往研究中CK7蛋白陽性率差異較大。以上兩項日本的研究中，均選擇10%腫瘤細胞陽性作為Cut off值。兩項中國的研究中，分別選擇25%和1%作為Cut off值。選擇不同的Cut off值，將影響CK7在食管鱗狀細胞癌中陽性率的判讀。本實驗發(fā)現(xiàn)，存在CK7著色的食管鱗狀細胞癌組織中，陽性腫瘤細胞的比例為10%～100%，個別病例陽性腫瘤細胞的比例為1%～5%。故本實驗選擇10%作為Cut off值，CK7蛋白陽性率為24.6%。

本實驗結(jié)果顯示，CK7表達與腫瘤分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和pTNM分期相關(guān)。在腫瘤分化差、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、pTNM分期較高的患者中，CK7陽性率較高。這些結(jié)果提示CK7蛋白陽性的腫瘤細胞存在較高的惡性程度。在正常食管黏膜中，CK7表達于黏膜固有層和黏膜下層的食管腺，不表達于表面鱗狀上皮[4]。部分食管鱗狀細胞癌細胞表達CK7，意味著細胞表達模式的改變，可能反映腫瘤的不同表型擁CK7表達與食管癌患者預后差存在相關(guān)性。以往研究認為CK7表達的預后意義在不同的TNM分期中存在差異。Yamada等[10]的研究結(jié)果顯示，在78例Ⅰ+Ⅱ期食管鱗狀細胞癌中，CK7陽性患者的總生存率較低；在48例Ⅲ+Ⅳ期食管鱗狀細胞癌中，CK7陽性患者和陰性患者的總生存率差異無顯著性。Oue等[11]的研究結(jié)果顯示，在101例0+Ⅰ期食管鱗狀細胞癌中，CK7表達與患者的DFS和OS無相關(guān)性；在124例Ⅰ+Ⅱ期食管鱗狀細胞癌中，CK7陽性患者的DFS和OS較差。Xu等[12]的研究結(jié)果顯示，在92例Ⅰ+Ⅱ期食管鱗狀細胞癌中，CK7陽性患者的OS較短，Ⅲ+Ⅳ期食管鱗狀細胞癌中CK7表達的預后意義未進行比較。楊召陽等[9]的研究未比較不同臨床分期中CK7預后的差異。本實驗比較分析了512例Ⅰ+Ⅱ和Ⅲ+Ⅳ期食管鱗狀細胞癌中的CK7表達預后差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在283例Ⅰ+Ⅱ期患者中，CK7陽性患者的DFS和OS較差，在229例Ⅲ+Ⅳ期患者中，CK7表達與患者生存無相關(guān)性。進一步驗證了CK7蛋白表達的預后意義主要體現(xiàn)在較早期的食管癌中，具體的分子機制尚需深入探究。食管癌的發(fā)生、發(fā)展是多因素共同作用的過程，在疾病進展過程中不斷出現(xiàn)分子改變[13-14]。較晚期食管癌由于改變了分子的積累和相互作用，異常分子的生物學作用更加復雜[13]，異常分子之間的作用相互影響，單個分子的預后價值有限。

綜上，本實驗分析了食管鱗狀細胞癌中CK7的表達，發(fā)現(xiàn)其與腫瘤分化差、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、高臨床分期相關(guān)。在Ⅰ+Ⅱ期食管鱗狀細胞癌中，CK7表達與患者預后差相關(guān)。該結(jié)果有助于對Ⅰ+Ⅱ期患者進行預后的危險度分級，可能有助于這部分患者將來得到更合理的治療方式。