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        胃癌組織中miR-107、AXIN2的表達(dá)及與預(yù)后的相關(guān)性

        2021-09-06 02:53:24張肖麗張?jiān)聲?/span>李炳慶
        關(guān)鍵詞:結(jié)果顯示生存率分化

        張肖麗,張?jiān)聲?,?萍,李炳慶,陳 健

        胃癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一。其治療首選手術(shù)切除,部分患者預(yù)后差,易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移,病死率高[1],因此,研究胃癌發(fā)生、發(fā)展機(jī)制及與預(yù)后的相關(guān)因素,具有重要意義。微小RNA-107(microRNA-107, miR-107)與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。鄒德勝等[2]的研究結(jié)果表明,miR-107在結(jié)直腸癌患者血清中的表達(dá)水平升高,且與結(jié)直腸癌的TNM分期相關(guān)。趙軻等[3]的研究結(jié)果表明,非小細(xì)胞肺癌組織中miR-107呈高表達(dá),且與病理分化、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及TNM分期呈正相關(guān)。軸抑制蛋白2(axis inhibition protein 2, AXIN2)是Wnt/β-catenin信號(hào)通路的重要調(diào)節(jié)因子,參與細(xì)胞增殖、分化、遷移、凋亡以及腫瘤的發(fā)生等生物學(xué)功能[4]。AXIN2在乳腺癌等多種腫瘤中均有表達(dá),與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[5]。目前,關(guān)于miR-107與AXIN2同時(shí)在胃癌中的研究報(bào)道不多。本文采用免疫組化SP法檢測(cè)miR-107和AXIN2在胃癌組織中的表達(dá),探討miR-107和AXIN2表達(dá)與胃癌患預(yù)后的關(guān)系,為臨床和病理醫(yī)師提供參考。

        1 材料與方法

        1.1 臨床資料收集2015年1月~2017年5月在我院就診并行手術(shù)治療的65例胃癌患者的組織標(biāo)本,同時(shí)取相應(yīng)癌旁正常胃黏膜組織標(biāo)本(距癌灶邊緣至少5 cm)作為對(duì)照。所有入組病例經(jīng)病理學(xué)診斷,并排除其他系統(tǒng)的惡性腫瘤,術(shù)前均未行任何抗腫瘤治療,每份標(biāo)本的臨床和病理資料均完整。65例患者:TNM分期Ⅰ+Ⅱ期39例,Ⅲ+Ⅳ期26例;高分化12例,中分化28例,低分化25例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者31例,無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者34例;侵及漿膜27例,未侵及漿膜38例。術(shù)后對(duì)所有患者進(jìn)行電話或門診隨訪,隨訪日期截至2020年5月。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),患者均知情同意并簽署知情同意書。

        1.2 主要試劑與儀器RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒購(gòu)自大連TAKARA公司。miR-107、AXIN2及內(nèi)參基因U6、β-actin序列設(shè)計(jì)引物,由上海生物工程公司合成。AXIN2兔抗人多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司,SP、DAB顯色試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋公司。

        1.3 方法

        1.3.1樣品采集及保存 胃癌及正常胃黏膜組織標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定,石蠟包埋,切片,用于免疫組化染色。

        1.3.2qRT-PCR法檢測(cè)胃癌組織中miR-107和AXIN2 mRNA的表達(dá) 取收集的組織標(biāo)本100 mg,研缽研碎后加TRIzol液,按照RNA提取試劑盒說(shuō)明書提取總RNA,使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄得到cDNA,置于-20 ℃保存?zhèn)溆?。采用qRT-PCR法檢測(cè)miR-107的表達(dá)。miR-107、AXIN2及內(nèi)參基因U6、β-actin,引物序列見表1。PCR反應(yīng)條件:95 ℃,75 s;95 ℃,15 s;60 ℃,35 s;95 ℃,15 s;合計(jì)38個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。反應(yīng)結(jié)束后,miR-107和AXIN2 mRNA表達(dá)水平采用2-△△CT分析法進(jìn)行計(jì)算。

        表1 qRT-PCR引物序列

        1.3.3免疫組化 免疫組化染色采用SP法,操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。石蠟切片二甲苯脫蠟,加熱誘導(dǎo)抗原修復(fù),3%過氧化氫去除內(nèi)源性過氧化物酶活性,10%山羊血清封閉后,加入AXIN2兔抗人多克隆抗體(稀釋比1 ∶100),于4 ℃過夜,DAB顯色后蘇木精復(fù)染。梯度乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹脂封固。

        1.3.4結(jié)果判斷 顯微鏡下觀察,每例標(biāo)本隨機(jī)觀察5個(gè)高倍視野,每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞,計(jì)算每個(gè)視野陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比。按陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)評(píng)分:<10%為0分,11%~30%為1分,31%~50%為2分,51%~75%為3分,>75%為4分;按細(xì)胞染色強(qiáng)度評(píng)分:無(wú)著色為0分,淡黃色為1分,棕黃色為2分,棕褐色為2分。將兩項(xiàng)評(píng)分結(jié)果相乘:0~1分為陰性(-),2~3分為弱陽(yáng)性(+),4~5分為陽(yáng)性(),6分以上為強(qiáng)陽(yáng)性()。將(+~)視為陽(yáng)性。

        2 結(jié)果

        2.1 胃癌及正常胃黏膜組織中miR-107與AXIN2 mRNA的表達(dá)本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,miR-107在胃癌組織中的表達(dá)水平顯著高于癌旁正常胃黏膜組織,兩組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),AXIN2 mRNA在胃癌組織中的表達(dá)顯著低于癌旁正常胃黏膜組織,兩組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,表2)。

        表2 胃癌及癌旁正常胃黏膜組織中miR-107和AXIN2 mRNA的表達(dá)水平

        2.2 胃癌及癌旁正常胃黏膜組織中AXIN2蛋白表達(dá)本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,AXIN2蛋白表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜(圖1),胃癌組織中AXIN2蛋白陽(yáng)性率顯著低于癌旁正常胃黏膜組織(P<0.05,表3)。

        圖1 A.AXIN2蛋白在胃癌組織中呈陰性,SP法;B.AXIN2蛋白在癌旁正常胃黏膜組織中呈陽(yáng)性,SP法

        表3 胃癌及癌旁正常胃黏膜組織中AXIN2蛋白表達(dá)

        2.3 胃癌中miR-107和AXIN2表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系本組以胃癌組織中miR-107表達(dá)的平均數(shù),將胃癌患者分為高表達(dá)組(≥1.65)和低表達(dá)組(<1.65),以AXIN2蛋白免疫組化染色結(jié)果,將胃癌患者分為AXIN2高表達(dá)組(染色結(jié)果為陽(yáng)性)和AXIN2低表達(dá)組(染色結(jié)果為陰性)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-107、AXIN2表達(dá)與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及浸潤(rùn)深度有關(guān)(P<0.05),與患者性別、年齡、腫瘤大小和病變部位無(wú)關(guān)(P>0.05,表4)。

        表4 胃癌中miR-107和AXIN2表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

        2.4 miR-107和AXIN2表達(dá)與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系隨訪截至2020年5月31日,術(shù)后隨訪6~36個(gè)月,無(wú)失訪病例,隨訪期間死于胃腺癌者24例,Kaplan-Meier生存分析顯示,miR-107高表達(dá)者總生存率為24.07%,低表達(dá)者總生存率為64.48%,miR-107高表達(dá)組胃癌患者3年生存率顯著低于低表達(dá)組患者(χ2=8.486,P<0.05,圖2A)。AXIN2高表達(dá)者總生存率為64.39%,低表達(dá)者總生存率為28.73%,AXIN2高表達(dá)組胃癌患者3年生存率顯著高于低表達(dá)組患者(χ2=5.729,P<0.05,圖2B)。

        圖2 Kaplan-Meier生存分析:A.miR-107表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系;B.AXIN2表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系

        2.5 胃癌患者預(yù)后影響因素分析Cox單因素分析結(jié)果顯示,低分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、miR-107高表達(dá)、AXIN2低表達(dá)是影響胃癌患者不良預(yù)后的危險(xiǎn)因素(P<0.05)。性別、年齡、腫瘤直徑、浸潤(rùn)深度與胃癌患者預(yù)后無(wú)關(guān)(P>0.05);多因素分析結(jié)果顯示,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、miR-107高表達(dá)、AXIN2低表達(dá)是影響胃癌患者不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05,表5)。

        2.6 胃癌組織中miR-107和AXIN2 mRNA表達(dá)的相關(guān)性胃癌組織中miR-107和AXIN2 mRNA表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.607,P<0.001,圖3)。

        圖3 胃癌組織中miR-107和AXIN2 mRNA表達(dá)的相關(guān)性

        3 討論

        胃癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率和病死率呈逐年上升趨勢(shì),隨著醫(yī)療水平的提高,胃癌的診治水平有不同程度地提高,但部分患者的預(yù)后情況和生活質(zhì)量卻未得到有效改善,因此早期預(yù)判胃癌患者的預(yù)后,尋找胃癌有效的生物學(xué)靶點(diǎn)具有重要意義[6-7]。

        miR-107在細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、增殖、發(fā)育、凋亡和代謝等多種過程中發(fā)揮重要作用,其表達(dá)失衡與胃癌的發(fā)生密切相關(guān),可作為疾病診斷的分子標(biāo)志物[8-9]。余南榮等[10]的研究結(jié)果表明,miR-107在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)上調(diào),可通過靶向Notch2促進(jìn)MMP-9的表達(dá),促進(jìn)胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲。于志紅等[11]的研究結(jié)果表明,miR-107在胃癌組織中高表達(dá),miR-107可通過負(fù)向調(diào)控PCDH17促進(jìn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化,進(jìn)而增強(qiáng)胃癌細(xì)胞的遷移及侵襲能力。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在胃癌組織中miR-107表達(dá)水平高于癌旁正常胃黏膜組織,其表達(dá)與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及浸潤(rùn)深度有關(guān),提示miR-107在胃癌的發(fā)展過程中可能發(fā)揮促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲的作用,進(jìn)一步分析結(jié)果顯示,miR-107高表達(dá)組胃癌患者3年生存率顯著低于低表達(dá)組患者,提示miR-107高表達(dá)可能增強(qiáng)胃癌細(xì)胞遷移及侵襲能力,調(diào)控腫瘤發(fā)展進(jìn)而影響患者預(yù)后情況。

        AXIN2作為一種信號(hào)調(diào)控因子,與多種腫瘤,如肝癌、結(jié)腸癌、肺癌等的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[12]。張濤等[13]的研究結(jié)果表明,胰腺癌細(xì)胞株中AXIN2的表達(dá)與正常胰腺細(xì)胞相比表達(dá)下調(diào),在侵襲能力越高的癌細(xì)胞株中表達(dá)越低,提示起抑癌基因作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,胃癌組織中AXIN2蛋白陽(yáng)性率顯著低于正常胃黏膜組織,進(jìn)一步分析結(jié)果顯示,低分化胃癌組織中AXIN2表達(dá)水平顯著低于中+高分化者,有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者的AXIN2表達(dá)水平顯著低于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者,TNM分期Ⅲ+Ⅳ期者的AXIN2表達(dá)水平顯著低于Ⅰ+Ⅱ期者,侵及漿膜者的AXIN2表達(dá)水平顯著低于未侵及漿膜者,提示AXIN2與胃癌的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。生存分析顯示,AXIN2高表達(dá)組胃癌患者3年生存率顯著高于低表達(dá)組患者,提示AXIN2表達(dá)缺失的患者腫瘤分化差、預(yù)后差,易發(fā)生浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移,AXIN2可能通過調(diào)控腫瘤發(fā)展影響患者預(yù)后。

        進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、miR-107高表達(dá)、AXIN2陰性是影響胃癌患者不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,提示miR-107、AXIN2可能作為評(píng)估胃癌患者不良預(yù)后的生物標(biāo)志物。然而兩者在胃癌中的表達(dá)關(guān)系及具體作用機(jī)制尚不清楚,Zhang等[14]研究結(jié)果表明,miR-107在肝癌組織和細(xì)胞系中顯著上調(diào),AXIN2的表達(dá)受miR-107負(fù)調(diào)控,miR-107可以通過靶向AXIN2促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,胃癌組織中miR-107與AXIN2表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān),因此本實(shí)驗(yàn)推測(cè)miR-107可能靶向作用于AXIN2促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖,共同參與胃癌的發(fā)生、發(fā)展。

        綜上所述,胃癌組織中miR-107高表達(dá),AXIN2低表達(dá),且與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、浸潤(rùn)深度和患者預(yù)后有關(guān),可能作為胃癌患者預(yù)后評(píng)估的分子標(biāo)志物。但兩者在胃癌中的具體作用機(jī)制仍需擴(kuò)大樣本量深入探討。

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