冷加燕，張婷娟，林 江，谷 雨，于 迪，馬吉春，錢 軍，周靜東

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)是一種高度異質(zhì)性血液系統(tǒng)惡性克隆性疾病，也是較為常見的成人白血病類型[1]。AML發(fā)病涉及細(xì)胞遺傳學(xué)與分子生物學(xué)的巨大異質(zhì)性導(dǎo)致患者預(yù)后差異較大[2]。根據(jù)中國成人AML治療指南，依據(jù)初診時(shí)不同染色體及基因突變可將AML患者分為預(yù)后良好、中等、不良組[3]。此外，表觀遺傳學(xué)涉及的基因表達(dá)異常在AML中亦扮演重要角色，并且與患者預(yù)后密切相關(guān)[4]。許多研究揭示AML中BAALC、MN1、ERG等基因過表達(dá)與患者預(yù)后不良相關(guān)[5]。尋找更多影響AML預(yù)后的分子標(biāo)志，對AML預(yù)后精準(zhǔn)評估并指導(dǎo)患者個(gè)體化及精準(zhǔn)治療具有重要臨床意義。

DLX4基因位于17q21.33，是一種轉(zhuǎn)錄因子，在調(diào)控人體組織器官、造血系統(tǒng)形成中起重要作用[6-7]。DLX4基因目前公認(rèn)有2個(gè)異構(gòu)體，其中轉(zhuǎn)錄本較長的稱為BP1(NM_138281)，轉(zhuǎn)錄本較短的稱為DLX7(NM_001934)。已有文獻(xiàn)[8]報(bào)道異構(gòu)體BP1在實(shí)體腫瘤呈過表達(dá)，并且與患者預(yù)后不良相關(guān)。異構(gòu)體DLX7在AML中表達(dá)尚未見相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用RT-qPCR法檢測AML患者中DLX4異構(gòu)體的表達(dá)及甲基化情況，分析其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 材料收集2005年10月～2017年12月江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院血液科診治的153例AML患者，其中男性90例，女性63例，年齡18～93歲(中位56歲)。另收集37例骨髓捐獻(xiàn)者，其中男性21例，女性16例，年齡32～65歲(中位50歲)。所有AML患者診斷分型按WHO(2016)標(biāo)準(zhǔn)[9]。治療方案參考文獻(xiàn)報(bào)道[10]。此外，白血病細(xì)胞株K562、SHI-1、U937、THP-1、NB4、HL60、HEL及MV4-11為蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院血液科陳蘇寧教授饋贈(zèng)。SHI-1細(xì)胞株培養(yǎng)在10%含鐵胎牛血清的IMDM培養(yǎng)基中，其余細(xì)胞株培養(yǎng)在10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中。細(xì)胞培養(yǎng)生長壞境均為37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱。本實(shí)驗(yàn)通過江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，同時(shí)獲患者知情同意。

1.2 方法

1.2.1骨髓單個(gè)核細(xì)胞分離、RNA提取和DNA提取 收取對照組及所有患者骨髓10 mL，使用人淋巴細(xì)胞分離液(索萊寶公司，中國)分離出骨髓單個(gè)核細(xì)胞BMMNCs。應(yīng)用TRIzol法提取總RNA，提取方法參考Trizol試劑盒說明書。同時(shí)通過Puregene Blood Core Kit B(Qiagen公司，德國)提取DNA，方法亦參考試劑盒說明書。

1.2.2逆轉(zhuǎn)錄及RT-qPCR檢測DLX4的表達(dá) 取總RNA 400 ng，采用PrimeScript RT試劑盒(Takara公司，日本)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)條件：37 ℃ 20 min，85 ℃ 5 s。合成的cDNA保存于-20 ℃?zhèn)溆谩．悩?gòu)體BP1引物序列：上游5′-TACCCGCTTGGCTTGTCC-3′，下游5′-AACGCTGGTTTAGGTGCTG-3′，目的產(chǎn)物長度為316 bp；異構(gòu)體DLX7引物序列：上游5′-TTATGAAACTGTCCGTCCTACC-3′，下游5′-TGT GCTGGAAACGCTGGT-3′，目的產(chǎn)物長度為201 bp；選取ABL1作為內(nèi)參基因，ABL1引物序列：上游5′-TCCTCCAGCTGTTATCTGGAAGA-3′，下游5′-TCC AACGAGCGGCTTCAC-3′，引物由上海華大基因公司合成。通過AceQ qPCR SYBR Green Master Mix進(jìn)行RT-qPCR定量檢測異構(gòu)體BP1及DLX7的表達(dá)。RT-qPCR反應(yīng)在ABI 7300擴(kuò)增儀上進(jìn)行，反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 5 min(1個(gè)循環(huán))，變性95 ℃ 10 s、退火63 ℃ 30 s(BP1)以及60 ℃ 30 s(DLX7)、延伸72 ℃ 30 s、收集熒光80 ℃ 30 s(40個(gè)循環(huán))。異構(gòu)體BP1及DLX7相對表達(dá)量計(jì)算方法參考文獻(xiàn)報(bào)道[11]。

1.2.3亞硫酸鹽處理及MSP法檢測異構(gòu)體BP1啟動(dòng)子甲基化 取gDNA 1 μg，采用EpiTech Bisulfite Kit(Qiagen公司，德國)試劑盒參照說明書進(jìn)行硫化修飾，修飾后的標(biāo)本置于-80 ℃保存?zhèn)溆?。異?gòu)體BP1啟動(dòng)子甲基化MSP引物序列：甲基化上游5′-TAGATCGGTTTGGAGTATGC-3′，甲基化下游5′-AACGTCCCGAATTAACTACC-3′；未甲基化上游5′-AGGTAGATTGGTTTGGAGTATGT-3′，未甲基化下游5′-TTAAACATCCCAAATTAACTACC-3′，甲基化及未甲基化目的產(chǎn)物長度均為131 bp。通過EpiTaq HS(for bisulfite-treated DNA)(Takara公司，日本)進(jìn)行MSP定性檢測BP1啟動(dòng)子甲基化態(tài)勢。MSP反應(yīng)條件：預(yù)變性98 ℃ 10 s(1個(gè)循環(huán))，變性98 ℃ 10 s、退火59 ℃ 30 s以及60 ℃ 30 s(DLX7)、延伸72 ℃ 30 s、酶滅活72 ℃ 7 min(40個(gè)循環(huán))。MSP產(chǎn)物通過2%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。

1.2.4BSP法檢測異構(gòu)體BP1啟動(dòng)子甲基化 異構(gòu)體BP1啟動(dòng)子甲基化BSP引物序列：上游5′-GG GAGATTGTAAATGTAGATTTTTTG-3′，下游5′-AT ACCCCCCATAACTTTCCC-3′，目的產(chǎn)物長度均為415 bp，含有27個(gè)CpG位點(diǎn)。通過EpiTaq HS(for bisulfite-treated DNA)(Takara公司，日本)進(jìn)行BSP定性擴(kuò)增BP1啟動(dòng)子。BSP反應(yīng)條件：預(yù)變性98 ℃ 10 s(1個(gè)循環(huán))，變性98 ℃ 10 s、退火59 ℃ 30 s、延伸72 ℃ 30 s、酶滅活72 ℃ 7 min(40個(gè)循環(huán))。BSP產(chǎn)物通過2%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證并切膠回收，并使用AxyPrep DNA Gel Recovery Kit(Axygen公司，美國)純化。純化后產(chǎn)物通過pMD 19-T Vector Kit(Takara公司，日本)連接，后導(dǎo)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞(Vazyme公司，中國)克隆。最后選擇至少10個(gè)單克隆送華大基因公司行Sanger法測序。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 22.0及GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。兩組連續(xù)性變量間的差異分析使用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，分類變量之間的差異分析采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法。DLX4表達(dá)在AML中的診斷價(jià)值采用ROC曲線及ROC曲線下面積(AUC)進(jìn)行評價(jià)。采用Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AML患者及細(xì)胞株中DLX4基因異構(gòu)體的表達(dá)RT-qPCR檢測37例對照組中異構(gòu)體BP1表達(dá)的平均水平為0.028(中位值0，范圍0～1.000)，153例AML患者中異構(gòu)體BP1表達(dá)的平均水平為0.324(中位值0，范圍0～8.905)，與對照組相比，異構(gòu)體BP1在AML中表達(dá)上調(diào)，差異有顯著性(P<0.001，圖1A)。此外，7例AML細(xì)胞株和1例慢性粒細(xì)胞白血病(chronic myelogenous leukemia, CML)急粒變細(xì)胞株中BP1表達(dá)水平比對照組平均水平(0.028)均有不同程度增高(圖1B)。

37例對照組中異構(gòu)體DLX7表達(dá)的平均水平為1.234(中位0.265，范圍0.012～7.804)，153例AML患者中異構(gòu)體DLX7表達(dá)的平均水平為0.275(中位0.008，范圍0～6.150)，異構(gòu)體DLX7在AML中表達(dá)比對照組下調(diào)(P<0.001，圖1C)。此外，7例AML細(xì)胞株和1例CML急粒變細(xì)胞株中DLX7表達(dá)水平比對照組平均水平(1.234)均有不同程度降低(圖1D)。

圖1 AML患者及細(xì)胞株中DLX4各異構(gòu)體的表達(dá)水平：A.異構(gòu)體BP1在AML患者中的表達(dá)；B.異構(gòu)體BP1在AML細(xì)胞株中的表達(dá)；C.異構(gòu)體DLX7在AML患者中的表達(dá)；D.異構(gòu)體DLX7在AML細(xì)胞株中的表達(dá)

2.2 DLX4基因異構(gòu)體啟動(dòng)子CpG島在AML患者及細(xì)胞株中的甲基化態(tài)勢為進(jìn)一步探索DLX4異構(gòu)體差異性表達(dá)的影響因素，對DLX4基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)DLX4兩個(gè)異構(gòu)體BP1和DLX7前啟動(dòng)子區(qū)域均存在較大的CpG島(圖2A)。本組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)AML及CML患者中異構(gòu)體DLX7啟動(dòng)子CpG島存在高甲基化現(xiàn)象，并且可能影響異構(gòu)體DLX7表達(dá)導(dǎo)致其表達(dá)下調(diào)[12-13]。本實(shí)驗(yàn)首先通過MSP法對AML細(xì)胞株進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)7例AML細(xì)胞株和1例CML急粒變細(xì)胞株均呈完全未甲基化態(tài)勢(圖2B)。隨機(jī)選擇2例AML細(xì)胞株通過BSP法亦證實(shí)其低甲基化狀態(tài)(圖2B)。另實(shí)驗(yàn)還通過MSP法對AML進(jìn)行檢測，結(jié)果亦發(fā)現(xiàn)AML均呈完全未甲基化態(tài)勢，7例AML患者代表性結(jié)果詳見圖2C。隨機(jī)選擇8例AML通過BSP法亦證實(shí)其低甲基化狀態(tài)(圖2C)。

圖2 DLX4基因結(jié)構(gòu)模式圖及BP1啟動(dòng)子區(qū)域CpG島在AML中的甲基化態(tài)勢：A.DLX4基因結(jié)構(gòu)模式圖；B.AML細(xì)胞株中BP1啟動(dòng)子區(qū)域CpG島甲基化態(tài)勢，其中1～8分別為K562、SHI-1、U937、THP-1、NB4、HL60、HEL、NB4，9為未甲基化質(zhì)控，10為甲基化質(zhì)控，11為雙陰性質(zhì)控，BSP散點(diǎn)圖為HL60及THP-1細(xì)胞株；C.AML患者中BP1啟動(dòng)子區(qū)域CpG島甲基化態(tài)勢，其中1～7為隨機(jī)挑選的7例AML，8為未甲基化質(zhì)控，9為甲基化質(zhì)控，10為雙陰性質(zhì)控；BSP散點(diǎn)圖為隨機(jī)挑選的8例AML患者

2.3 DLX4基因異構(gòu)體表達(dá)的鑒別診斷意義采用ROC曲線評估DLX4異構(gòu)體表達(dá)是否可作為AML診斷的潛在分子標(biāo)志，結(jié)果發(fā)現(xiàn)異構(gòu)體BP1表達(dá)可用于鑒別實(shí)驗(yàn)組和對照組的參考標(biāo)志(AUC=0.699，95%CI：0.619～0.779，P<0.001，圖3A)。異構(gòu)體DLX7表達(dá)更能用于鑒別實(shí)驗(yàn)組和對照組的參考標(biāo)志(AUC=0.834，95%CI：0.776～0.893，P<0.001，圖3B)。此外，為進(jìn)一步明確BP1及DLX7表達(dá)聯(lián)合在AML中的潛在診斷價(jià)值，實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步通過Logistic回歸分析擬合新變量，同時(shí)通過ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)，異構(gòu)體BP1及DLX7表達(dá)聯(lián)合用于鑒別實(shí)驗(yàn)組和對照組的效能更為有價(jià)值(AUC=0.883，95%CI：0.821～0.945，P<0.001，圖3C)。

圖3 AML患者中DLX4各異構(gòu)體表達(dá)的ROC分析：A.AML患者中異構(gòu)體BP1表達(dá)的ROC分析；B.AML患者中異構(gòu)體DLX7表達(dá)的ROC分析；C.AML患者中異構(gòu)體BP1和DLX7聯(lián)合表達(dá)的ROC分析

2.4 DLX4基因異構(gòu)體表達(dá)與AML臨床及實(shí)驗(yàn)室參數(shù)的相關(guān)性選取使ROC曲線的敏感度、特異性最優(yōu)的異構(gòu)體BP1表達(dá)水平(0.007)(敏感度為46.4%，特異性為97.3%)及DLX7表達(dá)水平(0.012)(敏感度為52.9%，特異性為100%)為臨界值。針對異構(gòu)體BP1，高表達(dá)組和低表達(dá)組在患者性別、年齡、血小板計(jì)數(shù)、血紅蛋白含量、骨髓原始細(xì)胞比例及核型危險(xiǎn)度分組中差異均無顯著性(P>0.05)，但異構(gòu)體BP1高表達(dá)組患者的白細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著高于異構(gòu)體BP1低表達(dá)組(P=0.001)。此外，兩組患者在FAB分型分布上差異有顯著性(P=0.021)。在基因突變中，異構(gòu)體BP1高表達(dá)組患者FLT3-ITD突變率顯著高于異構(gòu)體BP1低表達(dá)組患者(P=0.039，表1)。

針對異構(gòu)體DLX7，高表達(dá)組和低表達(dá)組在患者性別、年齡、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、血小板計(jì)數(shù)、血紅蛋白含量、骨髓原始細(xì)胞比例、FAB分類、核型危險(xiǎn)分組、基因突變中差異均無顯著性(P>0.05，表1)。

2.5 DLX4基因異構(gòu)體表達(dá)與AML患者預(yù)后的相關(guān)性實(shí)驗(yàn)分析了DLX4異構(gòu)體表達(dá)與患者接受誘導(dǎo)化療后完全緩解率的關(guān)系(隨訪130例)。異構(gòu)體BP1過表達(dá)患者完全緩解率低于異構(gòu)體BP1高表達(dá)組患者，僅在非M3組患者中差異有顯著性(P=0.047)；異構(gòu)體DLX7高低表達(dá)組患者之間差異無顯著性(P>0.05，表1)。

表1 AML患者中DLX4各異構(gòu)體表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

Kaplan-Meier法進(jìn)一步分析DLX4異構(gòu)體表達(dá)對患者生存的影響(隨訪130例)。異構(gòu)體BP1高表達(dá)患者總生存期低于異構(gòu)體BP1低表達(dá)患者，在非M3患者及正常核型AML患者中差異有顯著性(P=0.007、0.035，圖4)。因異構(gòu)體BP1高表達(dá)和FLT3-ITD突變有相關(guān)性，且FLT3-ITD過表達(dá)提示患者預(yù)后不良。實(shí)驗(yàn)剔除FLT3-ITD突變患者，通過生存分析進(jìn)一步證實(shí)異構(gòu)體BP1過表達(dá)對患者預(yù)后不良的影響(P=0.004、0.024，圖4)。異構(gòu)體DLX7通過生存分析發(fā)現(xiàn)：無論是全部AML、非M3 AML及正常核型AML中，兩組之間差異均無顯著性(P>0.05，圖4)。

圖4 AML患者中DLX4各異構(gòu)體表達(dá)對患者預(yù)后的影響

3 討論

越來越多的報(bào)道揭示DLX4基因在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用。如Zhang等[14]報(bào)道DLX4可以通過上調(diào)TWIST促進(jìn)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化從而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移。此外，亦有報(bào)道證實(shí)DLX4異構(gòu)體BP1通過促進(jìn)細(xì)胞增殖及侵襲參與ER-乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展[15]。Haria等[16]研究結(jié)果顯示，DLX4可以通過刺激NF-κB活性誘導(dǎo)CD44表達(dá)促進(jìn)卵巢癌的轉(zhuǎn)移。此外，敲減DLX4表達(dá)可促進(jìn)絨毛膜癌細(xì)胞的凋亡[17]。Ling等[18]研究發(fā)現(xiàn)，DLX4可上調(diào)YB-1影響細(xì)胞增殖、周期及侵襲，參與鼻咽癌的形成。臨床相關(guān)研究結(jié)果亦證實(shí)DLX4或異構(gòu)體BP1在腫瘤中的表達(dá)與患者預(yù)后密切相關(guān)，并且可能作為預(yù)后判斷的分子標(biāo)志物[19-21]。綜合以上結(jié)果揭示，DLX4在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起促癌作用。然而，亦有較多研究發(fā)現(xiàn)DLX4在腫瘤中存在高甲基化現(xiàn)象，并且與預(yù)后密切相關(guān)[22-23]，這些結(jié)果提示DLX4可能扮演抑癌作用，其與之前報(bào)道DLX4發(fā)揮促癌作用結(jié)論矛盾。對DLX4的基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，DLX4基因存在2個(gè)異構(gòu)體，CDS較長者稱之為BP1，CDS較短者稱之為DLX7，而多數(shù)報(bào)道并未嚴(yán)格區(qū)分兩者。本實(shí)驗(yàn)分別設(shè)計(jì)2個(gè)異構(gòu)體的特異性引物在AML患者及細(xì)胞株中的表達(dá)進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)異構(gòu)體BP1在AML中呈過表達(dá)態(tài)勢，與先前報(bào)道一致[24]。然而，異構(gòu)體DLX7在AML中呈低表達(dá)態(tài)勢，既往未見相關(guān)報(bào)道。針對DLX4的2個(gè)異構(gòu)體功能，擬進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。此外，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步分析了DLX4的2個(gè)異構(gòu)體表達(dá)的臨床意義，ROC曲線分析揭示異構(gòu)體BP1及DLX7表達(dá)，尤其是兩者聯(lián)合變量，可能對AML輔助診斷有一定幫助；預(yù)后分析揭示BP1過表達(dá)與AML患者低緩解率及低生存期相關(guān)，與實(shí)體腫瘤報(bào)道類似。由于異構(gòu)體DLX7表達(dá)與AML患者預(yù)后無相關(guān)性，因此異構(gòu)體BP1在AML形成中可能扮演促癌作用，異構(gòu)體DLX7可能扮演抑癌作用，并且異構(gòu)體BP1過表達(dá)可能作為AML患者預(yù)后判斷的生物學(xué)標(biāo)志物。

甲基化作為最為常見的表觀遺傳學(xué)方式之一，在調(diào)控基因表達(dá)方面起重要作用。鑒于已有文獻(xiàn)報(bào)道揭示DLX4存在高甲基化現(xiàn)象，同時(shí)DLX4的2個(gè)異構(gòu)體表達(dá)態(tài)勢相反。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步分析DLX4基因結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)異構(gòu)體BP1及DLX7前啟動(dòng)子區(qū)域均有較大的CpG島，既往報(bào)道DLX4甲基化研究區(qū)域主要是針對異構(gòu)體DLX7啟動(dòng)子內(nèi)CpG島，并且影響基因表達(dá)。我們既往通過定量MSP及BSP的方法亦證實(shí)AML及CML患者中異構(gòu)體DLX7啟動(dòng)子CpG島存在高甲基化現(xiàn)象，并且與DLX7表達(dá)呈負(fù)相關(guān)[12-13]。此外，對異構(gòu)體DLX7啟動(dòng)子高甲基化AML細(xì)胞株行去甲基化處理可恢復(fù)DLX7的表達(dá)[12-13]。由此揭示，異構(gòu)體DLX7在AML中表達(dá)下調(diào)可能是因?yàn)镈LX7啟動(dòng)子CpG島高甲基化所致。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步針對AML中異構(gòu)體BP1啟動(dòng)子CpG島進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)異構(gòu)體BP1啟動(dòng)子CpG島呈完全未甲基化。由此可見，AML中異構(gòu)體BP1表達(dá)上調(diào)不是因?yàn)锽P1啟動(dòng)子甲基化改變所致。目前已有報(bào)道表明實(shí)體腫瘤中異構(gòu)體BP1過表達(dá)可能因其基因拷貝數(shù)擴(kuò)增所致[25]。此外，針對其他基因相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)多態(tài)性可能影響基因表達(dá)參與AML的發(fā)生[26]。然而，AML中異構(gòu)體BP1過表達(dá)原因目前尚不完全明確，有待進(jìn)一步分析。

綜上所述，AML中DLX4的2個(gè)異構(gòu)體BP1及DLX7表達(dá)態(tài)勢不同。異構(gòu)體BP1呈過表達(dá)，與其啟動(dòng)子甲基化無關(guān)，可作為AML患者預(yù)后不良的生物學(xué)標(biāo)志物；DLX7呈低表達(dá)，可能受其啟動(dòng)子高甲基化影響，與AML患者預(yù)后無關(guān)。