王 然, 朱傳雪, 岳俊陽, 劉永勝

(合肥工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,安徽 合肥 230601)

0 引 言

巢湖位于安徽省中部,隸屬長江水系下游湖泊,是我國五大淡水湖之一。由于近年來工業(yè)、農(nóng)業(yè)及生活廢水的大量排放,使得巢湖水體中氮、磷等元素嚴重超標,富營養(yǎng)化程度加劇,從而導(dǎo)致湖水中藻類生物(主要是藍藻)的異常繁殖,形成水華現(xiàn)象[1-2]。已有研究顯示巢湖藍藻水華的分布具有明顯的季節(jié)性,并且極易受到天氣和風(fēng)向的影響,但主要集聚于西部水域的湖濱帶[3]。每年夏季,巢湖大面積暴發(fā)的藍藻水華不僅造成水體功能下降和水質(zhì)性缺水,而且還會散發(fā)強烈的異味,嚴重影響周邊的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和居民的身心健康[4]。

目前,用于巢湖藍藻治理的主要技術(shù)包括物理方法、化學(xué)方法和生物方法三大類[5-7]。其中,物理方法(如人工打撈)仍然是水華集中暴發(fā)時的主要除藻手段,卻無法從根本上緩解水華現(xiàn)狀。生物方法因其靈敏長效、環(huán)境友好、生態(tài)安全性高而被認為是一種最具前景的預(yù)防治理途徑,但能夠成熟應(yīng)用的技術(shù)還不多,往往處于初始研究階段。因此對巢湖藍藻水華集中暴發(fā)時優(yōu)勢種群的分離、鑒定和生長特性研究至關(guān)重要。

微囊藻屬于藍藻門色球臻科徽囊藻屬,是一類全球性分布的藍藻,也是淡水水華中常見的優(yōu)勢藻類[8-9]。巢湖藍藻水華中,微囊藻在數(shù)量和發(fā)生頻率上均占優(yōu)勢,并且呈現(xiàn)季節(jié)性特征。文獻[10]研究表明在夏、秋兩季微囊藻在水華藍藻中占絕對優(yōu)勢,其生物量可達7.96×108個/L。微囊藻是小型且沒有鞘包裹的球狀細胞,但在自然水體中,微囊藻細胞通常會相互聚集在一起,形成肉眼可見的群體菌落。根據(jù)其在水華發(fā)生過程中是否產(chǎn)生毒素,微囊藻可分為產(chǎn)毒微囊藻和非產(chǎn)毒微囊藻兩類。其中,產(chǎn)毒微囊藻釋放的微囊藻毒素(microcystin,MC)會影響水體中動物和植物的正常生長,甚至能夠通過飲用水和食物鏈等途徑進入人體,引發(fā)肝炎等疾病,嚴重威脅人類的身心健康[11-15]。

本文通過將巢湖水華暴發(fā)時水華區(qū)域的藍藻進行分離、純化鑒定得到巢湖藍藻中的優(yōu)勢菌株銅綠微囊藻,并研究了銅綠微囊藻的產(chǎn)毒特點及在光照、溫度和pH值等不同條件下的生長特性,以探索不同生態(tài)條件對巢湖水華的影響。為預(yù)測巢湖水華爆發(fā)時間及多發(fā)水域,并改善巢湖水體的富營養(yǎng)化現(xiàn)狀,減輕水華污染提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藍藻的收集

藍藻采集于巢湖水華暴發(fā)時西湖岸周邊的巢湖水體(北緯N31°34′46″,東經(jīng)E117°18′39″),取樣地點如圖1所示,圖1紅色箭頭指示為取樣地點。

圖1 藍藻水體采樣地點示意圖

1.1.2 培養(yǎng)基的配置

本文共使用了3種不同的培養(yǎng)基,包括BG-11、MA和Knop培養(yǎng)基,3種培養(yǎng)基的pH值分別為7.0、8.0、7.5。培養(yǎng)基配方分別見表1～表3所列。其中,表1中母液質(zhì)量濃度應(yīng)稀釋100倍使用。若配置固體培養(yǎng)基,則在相應(yīng)的液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加1.5%的瓊脂。所有培養(yǎng)基都經(jīng)121 ℃高溫高壓條件下滅菌20 min,而后冷卻備用。

表1 BG-11培養(yǎng)基 單位:g/L

表2 MA培養(yǎng)基 單位:mg/L

表3 Knop培養(yǎng)基

1.2 方法

1.2.1 藻類的分離和純化培養(yǎng)

對采集自巢湖藍藻水華暴發(fā)時的水樣進行離心(5 000 r/min),使湖水、浮渣和藻細胞分層,除去湖水和浮渣,并利用低濃度碳酸氫鈉溶液重懸藻細胞沉淀以洗滌藻類,棄去上清,反復(fù)多次至上清透亮為止。最后,用無菌水對獲得的藻細胞重懸,并進行梯度稀釋后,置于BG-11固體培養(yǎng)基上進行分離培養(yǎng)。對于菌落形態(tài)一致,生長占優(yōu)勢的單一菌落進行富集培養(yǎng),而對有雜菌共生、尚未純化的菌落繼續(xù)稀釋劃線,直至菌落形態(tài)一致。

1.2.2 菌種細胞形態(tài)觀察

肉眼觀察液體培養(yǎng)基中藻的形態(tài)、顏色和生長情況等;同時觀察固體培養(yǎng)基上生長的菌落形態(tài),包括菌落生長速度、形狀、大小、表面質(zhì)地、隆起程度、透明度、邊緣和顏色等;借助光學(xué)顯微鏡觀察有無細胞核或其他細胞器等藻類形態(tài),以大致區(qū)分到“門”,并拍照記錄。

1.2.3 菌種分子水平鑒定

利用聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)技術(shù),分別使用細菌通用引物16S rRNA/23S rRNA和藻藍蛋白基因間隔序列ITS的特異引物對分離到的純種藻細胞進行目的基因的擴增,引物信息見表4所列。然后,對PCR擴增產(chǎn)物進行測序,并將測序結(jié)果提交NCBI核酸序列數(shù)據(jù)庫進行Blast比對。下載比對得分最高的9條結(jié)果記錄,并保存為“fasta”格式文件,用MEGA 10.0[16]制作基因進化樹,進一步對分離到的藻細胞進行分類。

表4 引物信息

1.2.4mcyB目的基因的克隆

使用Primer5軟件,設(shè)計微囊藻合成酶基因(Mcy)中的關(guān)鍵DNA片段mcyB的上下游引物,見表4所列,并進行體外聚合酶鏈式擴增反應(yīng)(PCR),分離純化PCR產(chǎn)物,并連接到PEASY-Blunt載體上,挑取單克隆進行陽性鑒定,最后送測序。

1.2.5 藻細胞計數(shù)

藻細胞的數(shù)量采用XB-K-25型血球計數(shù)板進行計數(shù)。在血球計數(shù)板的兩邊各滴加10 μL的藻細胞溶液,置于Olympus顯微鏡視野下對其中25個、大格400個小格進行計數(shù),采用每邊各計1次,取平均值記錄(計數(shù)方法為記上不記下、記左不記右,單位為104個/mL)。

1.2.6 統(tǒng)計分析

本文采用Microsoft Excel 2013軟件對實驗中所測數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析和圖表制作。所有處理均重復(fù)3次,分析結(jié)果以(平均值±標準差)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 巢湖藍藻優(yōu)勢菌種的分離、純化和鑒定

2.1.1 藍藻的分離純化和形態(tài)觀察

采取稀釋劃線法,經(jīng)不斷反復(fù)純化轉(zhuǎn)接,共獲得3個單一菌落,根據(jù)時間依次編號為CH1、CH2和CH3。通過光學(xué)顯微鏡觀察(放大40倍),3株藻細胞均呈深綠色,形狀為球形,群體內(nèi)細胞大小相似,原生質(zhì)體為灰綠色,未見細胞核,如圖2所示。將獲得的菌株回接到液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)數(shù)天后,藻細胞溶液呈現(xiàn)均勻分布的綠色,且靜置生長始終無沉淀形成。本實驗觀察到的結(jié)果符合銅綠微囊藻(M.aeruginosa)的形態(tài)特征和生長情況。

圖2 CH1、CH2和CH3在顯微鏡下的形態(tài)

2.1.2 銅綠微囊藻的分子鑒定

使用16S通用引物、16S rRNA-23S rRNA引物和藻藍蛋白基因間隔序列ITS的特異引物分別對3株藻細胞進行體外PCR擴增后送測序。所獲得序列經(jīng)DNAMAN比對完全一樣,統(tǒng)一取名為CHSEQ,并提交NCBI數(shù)據(jù)庫進行序列比對,進一步確定這3株藻細胞均為銅綠微囊藻(M.aeruginosa)。下載序列比對得分最高的9條結(jié)果記錄,使用MEGA軟件(版本10.0)構(gòu)建進化樹,如圖3所示。

圖3 基于藻藍蛋白基因間隔區(qū)序列的系統(tǒng)發(fā)育分析

從圖3可以看出,本實驗所獲得的CHSEQ序列與銅綠微囊藻M.aeruginosaUAM-VMA-7處于同一分支,表明它們的序列同源性最高。

2.2 銅綠微囊藻的生長特性研究

2.2.1 銅綠微囊藻標準曲線的制定

將生長至對數(shù)期的銅綠微囊藻進行梯度稀釋,并用分光光度計逐一測量,同時在顯微鏡下進行計數(shù),以不同藻細胞的數(shù)量及其吸光度值作標準曲線,如圖4所示。通過計算,得出銅綠微囊藻的細胞數(shù)和吸光值之間換算的標準曲線方程式為:

圖4 銅綠微囊藻吸光度與個數(shù)換算標準曲線

y=3 144.7x+2.234 7。

2.2.2 培養(yǎng)基對銅綠微囊藻生長的影響

本文分別使用BG-11、MA和Knop 3種不同培養(yǎng)基對銅綠微囊藻進行培養(yǎng)。12 d后統(tǒng)計不同培養(yǎng)基中單位體積的藻細胞數(shù)如圖5所示。由圖5可知,BG-11培養(yǎng)基中,藻細胞在第3天即進入對數(shù)生長期,同時對數(shù)期內(nèi)藻細胞增長率為217.3%;而MA和Knop培養(yǎng)基中,藻細胞則分別在第4天和第6天進入對數(shù)生長期,且增長率僅為143.4%和150.8%。此外,在BG-11培養(yǎng)基中,銅綠微囊藻的細胞數(shù)最終可達到每單位體積1.6×107個,而MA和Knop培養(yǎng)基中藻細胞數(shù)最終為每單位體積1.0×107和8.0×106個。由此表明BG-11培養(yǎng)基更適于銅綠微囊藻的生長。

圖5 不同培養(yǎng)基對銅綠微囊藻生長的影響

2.2.3 光照時間對銅綠微囊藻生長的影響

由于一天內(nèi)最大光照時長為16 h,本實驗比較了光照6、8、10、12、14、16 h對銅綠微囊藻生長的影響,如圖6所示。由圖6可知，銅綠微囊藻在6 ～16 h的不同光照時長下藻細胞增長率分別為31.6%、47.1%、91.5%、109.9%、125.0%、132.4%。表明光照時間與銅綠微囊藻的生長呈現(xiàn)正相關(guān),光照時間的延長會促進銅綠微囊藻的生長,當光照時間達16 h時,銅綠微囊藻生長速度最快。因而在探究溫度條件的實驗中采用光照16 h。

圖6 光照時間對銅綠微囊藻生長的影響

2.2.4 培養(yǎng)溫度對銅綠微囊藻生長的影響

固定光照時間為16 h,比較培養(yǎng)溫度分別為20、25、30、35 ℃對銅綠微囊藻生長的影響如圖7所示。由圖7可知，銅綠微囊藻的最適生長溫度為30 ℃,平均增長率達到162.5%。

圖7 溫度對銅綠微囊藻生長的影響

2.2.5 光照和溫度對銅綠微囊藻生長的影響

為了比較光照和溫度對銅綠微囊藻生長的協(xié)同作用,設(shè)計了光照(12、14、16 h)及溫度(20、25、30 ℃)的兩因素三水平試驗,結(jié)果如圖8所示。統(tǒng)計培養(yǎng)基中單位體積藻細胞數(shù),由圖8可知，藻細胞在培養(yǎng)條件為光照時長16 h、溫度30 ℃時增速最快。

圖8 溫度、光照對銅綠微囊藻生長的影響

2.2.6 pH值對銅綠微囊藻生長的影響

通過向培養(yǎng)基中加入鹽酸或氫氧化鈉,調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值由5.0到9.0變化,比較培養(yǎng)基中單位體積銅綠微囊藻細胞數(shù)，如圖9所示。由圖9可知,隨著培養(yǎng)基pH值的增加,銅綠微囊藻藻細胞的平均增長速率分別為0、16.5%、118.5%、103.5%和53.9%。由此可知,pH值為7.0的培養(yǎng)條件更適合銅綠微囊藻生長。在此條件下藻細胞密度最大,為1.5×107個/mL。而在pH值為5.0的條件下,藻細胞增速幾乎為0,說明銅綠微囊藻的生長基本被抑制。

圖9 不同pH值培養(yǎng)基對銅綠微囊藻生長的影響

2.2.7 銅綠微囊藻對不同抗生素的抗性

向BG-11培養(yǎng)基中分別加入卡納霉素(Kana)、利福平(Rif)、四環(huán)素(Tet)、氨芐霉素(Amp)和慶大霉素(Gen)5種抗生素,比較銅綠微囊藻的生長情況如圖10所示。

圖10 不同抗生素對銅綠微囊藻生長的影響

由圖10可知,銅綠微囊藻對抗生素比較敏感,5種抗生素均能不同程度地抑制其生長。但是研究發(fā)現(xiàn),銅綠微囊藻對四環(huán)素的抗性較強,比空白組而言被抑制率僅為5.75%,而其余4種抗生素抑制率則高達95.08%～99.86%。

2.3 銅綠微囊藻生長曲線的測定

依據(jù)2.2節(jié)中的結(jié)果,選用BG-11培養(yǎng)基培養(yǎng)銅綠微囊藻,將培養(yǎng)基pH值調(diào)至7.0,于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)光照16 h/d,每隔24 h測定1次藻細胞個數(shù),連續(xù)測定12 d直到生物量增長小于5%,繪制生長曲線如圖11所示。由圖11可知,銅綠微囊藻符合典型的細菌生長曲線,并在培養(yǎng)第2天進入對數(shù)期,在第11天進入穩(wěn)定期。

圖11 銅綠微囊藻生長曲線

2.4 銅綠微囊藻的毒性鑒定

用TOX1P/TOX1M引物對分離所得的銅綠微囊藻進行擴增,電泳檢測結(jié)果如圖12所示,由圖12可知,1 500 bp區(qū)域可擴增出條帶,經(jīng)測序比對發(fā)現(xiàn),與mcyB基因序列一致,說明從巢湖分離的微囊藻屬的銅綠微囊藻含mcyB基因,具有產(chǎn)生微囊藻毒素的能力。

圖12 mcyB基因片段的克隆

3 討 論

本實驗通過稀釋涂布平板法從巢湖藍藻水華暴發(fā)時的水體中分離到3株單一菌落,經(jīng)細胞形態(tài)和特異基因鑒定,表明所分離的3株菌落為同一種銅綠微囊藻株系。進一步對分離得到的銅綠微囊藻單一藻株進行生長特性的研究,確定了該銅綠微囊藻的最適生長條件為pH=7.0、溫度30 ℃下光照16 h,這與巢湖藍藻水華暴發(fā)的主要因素相一致。在自然水體中,溫度和光照的變化是影響水生生物生長繁殖的重要生態(tài)因子。銅綠微囊藻作為暖水性種藻類,它的最適生長溫度在30 ℃左右。而巢湖處于北緯30°左右,水溫季節(jié)性變化明顯,但在夏季6—10月其水溫基本能夠維持在20～30 ℃,這也是巢湖藍藻集中暴發(fā)、迅速生長的時期[17]。同時,光照影響藻類的垂直分布，研究表明,不同藻類對于光照強度的要求不同,銅綠微囊藻對光強需求較高,一般生活在水體表層,并且光照時間越長越有利于其生長。

溫度和光照作為藻類生長繁殖的重要影響因子,它們在現(xiàn)實水體中往往是協(xié)同發(fā)揮作用[18]。在夏季,巢湖水體不僅溫度高,而且光照強度大、時間長。本實驗通過設(shè)定溫度梯度(20、25、30 ℃)和光照時間梯度(12、14、16 h)兩因素試驗,發(fā)現(xiàn)同一溫度條件下,光照時長對銅綠微囊藻的生長具有顯著影響。當培養(yǎng)溫度為銅綠微囊藻的適宜生長溫度(25～30 ℃)時,光照時長每增加2 h,藻細胞數(shù)可增加2.5×106個/mL;而培養(yǎng)溫度為20 ℃時,光照時長每增加2 h僅能增加藻細胞數(shù)9.7×105個/mL。很多研究表明,在低溫(20 ℃以下)和高溫(35 ℃以上)條件下,銅綠微囊藻的光合作用相關(guān)酶類的酶活性降低,且光合系統(tǒng)Ⅱ的電子傳遞速率下降,導(dǎo)致其光合利用率下降,最終使得單位時間光照下藻細胞的生長能力較低[19-21]。

此外,每年巢湖水質(zhì)調(diào)查結(jié)果表明,巢湖水pH值在7.5～8.2之間,呈現(xiàn)弱堿性。本實驗結(jié)果顯示銅綠微囊藻的最適生長pH值為7.0～8.0,而當pH值降至酸性條件時,銅綠微囊藻的生長量會急劇降低,這也進一步闡明了銅綠微囊藻作為巢湖水華優(yōu)勢藻種的原因[22]。在銅綠微囊藻對抗生素抗性的研究中,發(fā)現(xiàn)常見抗生素幾乎能顯著抑制藻細胞的生長,唯有四環(huán)素沒有明顯的效果。文獻[23]研究發(fā)現(xiàn),由于生活中抗生素的濫用以及污水處理廠無法將其有效去除,巢湖水域呈現(xiàn)嚴重的抗生素污染現(xiàn)狀,尤其是四環(huán)素類抗生素,其在水體中的殘留量最高,已達3.5～42.3 ng/L。隨著逐年物種進化,巢湖銅綠微囊藻極可能對四環(huán)素類抗生素產(chǎn)生了很強的抗性,這與本實驗的研究結(jié)果一致。

文獻[24]通過基因分型和代謝物化學(xué)分型深入探究了微囊藻的種群多樣性和不同種微囊藻藻毒素(MC)產(chǎn)生的變化,揭示了種群差異的根源是基因水平差異。一般地,藻細胞中MC的產(chǎn)生與否是由微囊藻合成酶基因(Mcy)決定。本實驗通過PCR技術(shù)以Mcy基因內(nèi)部的關(guān)鍵DNA片段mcyB對所獲得的銅綠微囊藻藻株進行擴增和測序,發(fā)現(xiàn)結(jié)果呈現(xiàn)陽性,說明該藻株中含有Mcy基因,具有產(chǎn)生MC的潛在危險。文獻[25]經(jīng)固相萃取和高效液相色譜檢測,也證實巢湖水體中的銅綠微囊藻菌株可產(chǎn)生毒性最強的MC-LR,與本實驗的分子生物學(xué)實驗結(jié)果一致。

4 結(jié) 論

本文通過一系列實驗對巢湖藍藻的優(yōu)勢菌種銅綠微囊藻的生長特性進行了研究,表明銅綠微囊藻的生長和繁殖主要受到外部環(huán)境(如溫度、光照和pH值等)的影響。其中,溫度和光照對銅綠微囊藻生長的影響具有明顯的協(xié)同效應(yīng)。在抗生素干擾實驗室中,發(fā)現(xiàn)銅綠微囊藻對四環(huán)素類抗生素具有極強的抗性,或許與近年來巢湖水體中大量積累的四環(huán)素有關(guān)。因此,在巢湖水治理過程中應(yīng)加大管控力度,減少抗生素類物質(zhì)的殘留,避免藍藻抗性的產(chǎn)生。另外,通過分子生物學(xué)手段,成功克隆到微囊藻合成酶基因的片段mcyB,證實巢湖銅綠微囊藻具有產(chǎn)毒能力,會對巢湖周邊居民的身體健康產(chǎn)生危害。了解巢湖銅綠微囊藻的基本生長特性,將有助于政府及相關(guān)部門科學(xué)地、有針對性地防治巢湖水華。