張恩啟, 譚永毅, 云俊文, 孫甲玲, 聶 婧, 牛向麗

(合肥工業(yè)大學 食品與生物工程學院,安徽 合肥 230601)

萬壽菊(TageteserectaL.)是原產(chǎn)于墨西哥的一種一年生菊科草本植物,適應性較強,適于春天播種,夏天開放。其莖直立,具有較小的根部以及含腺體的葉片。頂部生長單生花序,花梗長而中空,花色有乳白、黃、橙黃和橘紅等[1-2]。中國是萬壽菊種植面積最大的國家之一,在我國山東、云南、東北等地均有色素萬壽菊品種種植,用于植物天然色素提取[3]。同時,由于萬壽菊花色絢麗多變,它也是一種重要的觀賞植物,花色是觀賞植物的一個重要特性。一般來說,類胡蘿卜素、類黃酮及花青素是花中的主要色素成分[4],其含量、比例與花色密切相關(guān)。此外,在一些花中由于含有葉綠素而使花色呈現(xiàn)更多變化。萬壽菊花中主要色素成分為類胡蘿卜素,但在花的發(fā)育早期,尤其在一些淺色系萬壽菊花中由于葉綠素的存在,使其花色多彩漸變,進一步增加了萬壽菊的觀賞性。

葉綠素是參與植物光合作用的重要色素,同樣也是組成觀賞林木的色素成分之一。葉綠素的生物合成自L-谷酰胺-tRNA開始,共需15 步反應,涉及相應15種酶[5-6]。其中,原卟啉原氧化酶(protoporphyrinogen oxidase,PPO)將原卟啉原Ⅸ氧化成為原卟啉Ⅸ,是四吡咯生物合成的最后一個酶。隨后原卟啉Ⅸ再與鎂螯合最終生成葉綠素[7]。目前對植物PPO基因的研究主要以擬南芥為主[8],在其他植物物種中的報道并不多,特別是萬壽菊的相應催化酶基因序列。本文依據(jù)轉(zhuǎn)錄組組裝數(shù)據(jù)結(jié)果,進一步對萬壽菊PPO(TageteserectaPPO,TePPO)基因進行克隆、測序和生物信息學分析、表達分析,探討其在萬壽菊花色形成中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料

1.1.1 植物材料

萬壽菊(TageteserectaL.)栽培品種‘marvel yellow’(黃色花)、‘marvel orange’(桔黃色花)購于泛美種子公司,種植于合肥工業(yè)大學植物培養(yǎng)室。

1.1.2 試劑藥品

Trizol購于Invitrogen公司;高保真Pfu DNA 聚合酶、dNTPs、DNA marker、反轉(zhuǎn)錄酶、實時熒光定量聚合酶鏈式反應(real time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)試劑盒均購于北京全式金生物技術(shù)有限公司;質(zhì)粒提取試劑盒、DNA純化試劑盒均購于天根生化科技有限公司;T4 DNA Ligase購于Thermo Scientific公司;引物設(shè)計采用Primer Premier 5.0軟件,由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司合成;其他試劑均為國外原裝或國產(chǎn)分析純。

1.1.3 載體與菌株

pEASY-Blunt克隆載體、大腸桿菌(Escherichia coli)菌株DH5α,均由本實驗室保存。

1.2 實驗方法

1.2.1 RNA 提取、反轉(zhuǎn)錄

將所采集的萬壽菊組織樣品液氮研磨,進行總RNA 提取,并對RNA的純度、濃度進行檢測。取總RNA 2 μg進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.2.2TePPO基因擴增

根據(jù)萬壽菊轉(zhuǎn)錄組組裝注釋結(jié)果,設(shè)計TePPO基因巢式PCR引物[9],分別為:

TePPOF1 5’-ACACAAAAATAGCAATGTGGATA-3’

TePPOR1 5’-TTTCACTCTTCATTTACTGTTCCT-3’;

TePPOF2 5’-CAATCAAGATGACACAATGACAAT-3’

TePPOR2 5’-GTCCTTATGAAGCTCGAACCA-3’。

以上述反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板,對TePPO基因進行擴增,擴增后的PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離檢測。

1.2.3TePPO基因克隆

利用DNA純化試劑盒對擴增產(chǎn)物進行純化;然后將純化后的擴增產(chǎn)物與克隆載體pEASY-Blunt進行連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞,涂布于帶有卡那霉素的培養(yǎng)皿中37 ℃培養(yǎng);挑取單克隆進行菌落PCR鑒定;取陽性克隆菌液進行質(zhì)粒提取、送樣測序,比對測序序列結(jié)果。

1.2.4TePPO基因生物信息學分析

利用蛋白組學分析平臺(ExPASy,https://www.expasy.org/)對TePPO編碼蛋白的理化性質(zhì)進行分析。使用同源建模方法[10](SWISS-MODEL)對TePPO蛋白三維結(jié)構(gòu)進行預測。同時,將TePPO基因序列在NCBI數(shù)據(jù)庫進行對比,利用MEGA 7.0軟件,使用Neighbor Joining遺傳算法構(gòu)建基因進化樹進行進化分析。

1.2.5 葉綠素量的測定

分別取黃色、桔黃色萬壽菊品種‘marvel yellow’、‘marvel orange’的不同發(fā)育時期的花組織樣品0.10～0.15 g(以直徑5 mm花蕾開始定為DP0,取隨后第10、15、21天的萬壽菊花組織,分別記為DP10、DP15、DP21),立即以液氮冷卻并快速研磨。然后加入丙酮5 mL,4 ℃避光浸提24 h,提取葉綠素。過濾、定容至合適濃度后以紫外可見分光光度計測定645、663 nm吸光值[11]。根據(jù)經(jīng)驗公式計算總?cè)~綠素的量。具體公式為:葉綠素的量=(20.2A645+8.02A663)×稀釋倍數(shù)/質(zhì)量。

1.2.6TePPO基因表達分析

分別以萬壽菊‘marvel yellow’、‘marvel orange’的葉片和DP10、DP15、DP21花組織樣品所反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板,以已知在萬壽菊不同組織中穩(wěn)定表達的TIF6 (translation initiation factor 6) 作為內(nèi)參基因[12],利用熒光定量PCR對TePPO表達水平進行檢測。其中TePPO基因定量PCR引物為:

TePPORTF 5’-TATGTGTGTGGGGATTATCGGAC-3’

TePPORTR 5’-ATCTTTCAACAACGCCTCTGC-3’;

TIF6基因引物為:

TIF6 F 5’-TAAGACCTGGTGGTGGAAATAGA-3’

TIF6 R 5’-CAGCACCATGAGGACGAAGA-3’。

2 結(jié)果與分析

2.1 TePPO基因克隆結(jié)果

以萬壽菊未成熟花組織的反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板,利用特異性巢式PCR引物對TePPO基因進行擴增,瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖1所示,由圖1可知，獲得與預期大小(1 699 bp)基本一致的目的條帶,且條帶清晰,沒有其他明顯的非特異擴增產(chǎn)物。將此擴增產(chǎn)物純化后與pEASY-Blunt 克隆載體連接,轉(zhuǎn)入大腸桿菌細胞，然后將菌落PCR鑒定的陽性克隆進行測序驗證。測序結(jié)果顯示克隆獲得了TePPO基因,其與轉(zhuǎn)錄組組裝序列僅有少數(shù)堿基的差異。表明轉(zhuǎn)錄組組裝結(jié)果較為準確,由此克隆分離得到TePPO基因全長序列。

M. DNA Marker 1.TePPO基因圖1 TePPO基因PCR擴增產(chǎn)物

2.2 TePPO基因生物信息學分析結(jié)果

通過蛋白組學分析平臺(ExPASy)對TePPO編碼蛋白的理化性質(zhì)分析。結(jié)果顯示,TePPO基因編碼493個氨基酸,相對分子質(zhì)量約為54 KDa;等電點為6.74;不穩(wěn)定系數(shù)為30.11,屬于穩(wěn)定蛋白;親水性平均值為-0.08,屬于親水性蛋白。通過同源建模方法預測TePPO蛋白的三維結(jié)構(gòu)，如圖2a所示。利用TePPO基因序列所構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹如圖2b所示,圖2b中,TePPO為萬壽菊(Tageteserecta)PPO基因;AtPPO為擬南芥(Arabidopsisthaliana)PPO基因;AhPPO為花生(Arachishypogaea)PPO基因;AiPPO為花生(Arachisipaensis)PPO基因;AdPPO為蔓花生(Arachisduranensis)PPO基因;ZjPPO為棗(Ziziphusjujuba)PPO基因;HaPPO為向日葵(Helianthusannuus)PPO基因;MsPPO為紫花苜蓿(Medicagosativa)PPO基因;CsPPO為亞麻芥(Camelinasativa)PPO基因;SmPPO為卷柏(Selaginellamoellendorffii)PPO基因;GhPPO為棉花(Gossypiumhirsutum)PPO基因;ZmPPO為玉米(Zeamays)PPO基因;GsPPO為大豆(Glycinesoja)PPO基因;CpPPO為西葫蘆(Cucurbitapepo)PPO基因;CmPPO為筍瓜(Cucurbitamaxima)PPO基因;MdPPO為蘋果(Malusdomestica)PPO基因。

從圖2b可以看出，TePPO與其他植物物種PPO基因具有同源性,其中與向日葵和紫花苜蓿同源基因的一致性最高。

圖2 TePPO蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)預測和系統(tǒng)進化樹分析

2.3 萬壽菊花中葉綠素量的測定結(jié)果

對萬壽菊品種‘marvel yellow’、 ‘marvel orange’的3個發(fā)育時期(DP10、DP15、DP21)的花組織進行收集并測定葉綠素的量,如圖3所示,由圖3可知,在黃色品種‘marvel yellow’的DP10、DP15、DP21花組織中,每g鮮重中葉綠素的質(zhì)量分別為23、19、8 μg;而在桔黃色品種‘marvel orange’3個對應時期花組織中每g鮮重中葉綠素的質(zhì)量分別9、5、3 μg。在黃色、桔黃色萬壽菊花發(fā)育早期(DP10、DP15),花中葉綠素的量均明顯高于成熟花(DP21);在花色呈現(xiàn)更明顯綠色的‘marvel yellow’中,其DP10、DP15、DP21花組織中葉綠素的量均顯著高于桔黃色品種‘marvel orange’3個對應時期花組織(P<0.05)。表明葉綠素參與萬壽菊的花色形成,并隨著花組織的成熟其所含葉綠素的合成減少、降解加快,從而呈現(xiàn)多色漸變。

圖3 不同發(fā)育時期萬壽菊花和葉綠素的量

2.4 TePPO基因表達分析結(jié)果

對‘marvel yellow’、 ‘marvel orange’不同發(fā)育時期(DP10、DP15、DP21)的花組織中TePPO基因的表達水平進行RT-qPCR檢測，結(jié)果如圖4所示,從圖4可以看出，與葉片相比,TePPO在花中表達水平較高,表明TePPO基因可在萬壽菊花組織中轉(zhuǎn)錄,發(fā)揮功能。TePPO基因在萬壽菊花發(fā)育早期豐度更高,隨花組織的成熟,TePPO基因轉(zhuǎn)錄表達降低。在花色中綠色更明顯、葉綠素含量更高的品種‘marvel yellow’中,不同發(fā)育時期的TePPO表達量也明顯高于‘marvel orange’品種。結(jié)合花中葉綠素量變化,萬壽菊花中TePPO基因表達水平與葉綠素量呈現(xiàn)一致的變化趨勢,基因表達與葉綠素量有較高的相關(guān)性。因此,TePPO基因的表達水平分析提示其可能參與萬壽菊花中葉綠素的合成及花色形成。

圖4 不同發(fā)育時期萬壽菊花中TePPO基因的表達水平

3 討 論

植物葉綠素的合成過程較為復雜,需要多種不同的酶催化完成,其中原卟啉原氧化酶PPO是催化最后步驟合成葉綠素的關(guān)鍵限速酶。在大多數(shù)真核生物和許多需氧或兼性細菌中,PPO是氧依賴性的。PPO蛋白結(jié)構(gòu)包括黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)結(jié)合域、底物作用結(jié)合域和膜結(jié)合域。通過FAD的黃素環(huán)(PPO輔助因子)從原卟啉原Ⅸ接收電子[13],并將電子轉(zhuǎn)移到氧分子,原卟啉原Ⅸ通過氧分子被氧化為原卟啉Ⅸ。PPO通過自身不同結(jié)構(gòu)域與底物、輔酶和蛋白之間發(fā)生相互作用調(diào)控葉綠素的合成[14]。已有報道認為,原卟啉原氧化酶PPO催化形成原卟啉Ⅸ的酶促步驟在原核和真核生物生命形式中都是保守的。在植物中,葉綠素的產(chǎn)生也取決于該酶促步驟[15]。利用這一催化酶的關(guān)鍵性,通過開發(fā)可與PPO結(jié)合的底物,從而抑制PPO與體內(nèi)原卟啉原Ⅸ的結(jié)合,使葉綠素不能合成、原卟啉原Ⅸ積累而導致細胞死亡,可以達到新型生物農(nóng)藥除草劑的作用,因而也使PPO成為除草劑的一個特異靶標[13-16]。PPO除了在催化葉綠素的生物合成中起到關(guān)鍵作用之外,還通過與多種有機體RNA編輯因子(MORF)家族蛋白相互作用,在調(diào)控質(zhì)體RNA編輯中發(fā)揮重要作用[8]。

近年來也有一些報道對葉綠素整個合成途徑進行綜述[17],但對具體基因功能的深入研究相對較少。對PPO基因的報道部分是以細菌、藍藻等微生物為載體,在植物中主要以擬南芥為主[18]。

4 結(jié) 論

本研究依據(jù)前期轉(zhuǎn)錄組信息,對TePPO基因進行了克隆,經(jīng)測序驗證其編碼序列與其他植物物種PPO基因具有同源性,其中與向日葵和紫花苜蓿PPO的一致性最高。

萬壽菊花中所含主要色素成分為類胡蘿卜素,由于類胡蘿卜素成分含量和組成的差異而呈現(xiàn)豐富的花色,而且其他色素成分(如葉綠素)進一步增加了萬壽菊花色的多彩漸變和觀賞性。本文在對TePPO基因表達模式的分析中發(fā)現(xiàn),其在萬壽菊花中轉(zhuǎn)錄表達水平較高,且在葉綠素量高的花色品種、花發(fā)育時期,TePPO的表達量也相應明顯升高,表明其參與萬壽菊花中葉綠素的合成與花色形成。因此,本研究工作可為植物花色遺傳改良提供基因資源和參考依據(jù)。