張恩啟, 譚永毅, 云俊文, 孫甲玲, 聶 婧, 牛向麗

(合肥工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,安徽 合肥 230601)

萬壽菊(TageteserectaL.)是原產(chǎn)于墨西哥的一種一年生菊科草本植物,適應(yīng)性較強,適于春天播種,夏天開放。其莖直立,具有較小的根部以及含腺體的葉片。頂部生長單生花序,花梗長而中空,花色有乳白、黃、橙黃和橘紅等[1-2]。中國是萬壽菊種植面積最大的國家之一,在我國山東、云南、東北等地均有色素萬壽菊品種種植,用于植物天然色素提取[3]。同時,由于萬壽菊花色絢麗多變,它也是一種重要的觀賞植物,花色是觀賞植物的一個重要特性。一般來說,類胡蘿卜素、類黃酮及花青素是花中的主要色素成分[4],其含量、比例與花色密切相關(guān)。此外,在一些花中由于含有葉綠素而使花色呈現(xiàn)更多變化。萬壽菊花中主要色素成分為類胡蘿卜素,但在花的發(fā)育早期,尤其在一些淺色系萬壽菊花中由于葉綠素的存在,使其花色多彩漸變,進一步增加了萬壽菊的觀賞性。

葉綠素是參與植物光合作用的重要色素,同樣也是組成觀賞林木的色素成分之一。葉綠素的生物合成自L-谷酰胺-tRNA開始,共需15 步反應(yīng),涉及相應(yīng)15種酶[5-6]。其中,原卟啉原氧化酶(protoporphyrinogen oxidase,PPO)將原卟啉原Ⅸ氧化成為原卟啉Ⅸ,是四吡咯生物合成的最后一個酶。隨后原卟啉Ⅸ再與鎂螯合最終生成葉綠素[7]。目前對植物PPO基因的研究主要以擬南芥為主[8],在其他植物物種中的報道并不多,特別是萬壽菊的相應(yīng)催化酶基因序列。本文依據(jù)轉(zhuǎn)錄組組裝數(shù)據(jù)結(jié)果,進一步對萬壽菊PPO(TageteserectaPPO,TePPO)基因進行克隆、測序和生物信息學(xué)分析、表達(dá)分析,探討其在萬壽菊花色形成中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料

1.1.1 植物材料

萬壽菊(TageteserectaL.)栽培品種‘marvel yellow’(黃色花)、‘marvel orange’(桔黃色花)購于泛美種子公司,種植于合肥工業(yè)大學(xué)植物培養(yǎng)室。

1.1.2 試劑藥品

Trizol購于Invitrogen公司;高保真Pfu DNA 聚合酶、dNTPs、DNA marker、反轉(zhuǎn)錄酶、實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)試劑盒均購于北京全式金生物技術(shù)有限公司;質(zhì)粒提取試劑盒、DNA純化試劑盒均購于天根生化科技有限公司;T4 DNA Ligase購于Thermo Scientific公司;引物設(shè)計采用Primer Premier 5.0軟件,由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成;其他試劑均為國外原裝或國產(chǎn)分析純。

1.1.3 載體與菌株

pEASY-Blunt克隆載體、大腸桿菌(Escherichia coli)菌株DH5α,均由本實驗室保存。

1.2 實驗方法

1.2.1 RNA 提取、反轉(zhuǎn)錄

將所采集的萬壽菊組織樣品液氮研磨,進行總RNA 提取,并對RNA的純度、濃度進行檢測。取總RNA 2 μg進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.2.2TePPO基因擴增

根據(jù)萬壽菊轉(zhuǎn)錄組組裝注釋結(jié)果,設(shè)計TePPO基因巢式PCR引物[9],分別為:

TePPOF1 5’-ACACAAAAATAGCAATGTGGATA-3’

TePPOR1 5’-TTTCACTCTTCATTTACTGTTCCT-3’;

TePPOF2 5’-CAATCAAGATGACACAATGACAAT-3’

TePPOR2 5’-GTCCTTATGAAGCTCGAACCA-3’。

以上述反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板,對TePPO基因進行擴增,擴增后的PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離檢測。

1.2.3TePPO基因克隆

利用DNA純化試劑盒對擴增產(chǎn)物進行純化;然后將純化后的擴增產(chǎn)物與克隆載體pEASY-Blunt進行連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞,涂布于帶有卡那霉素的培養(yǎng)皿中37 ℃培養(yǎng);挑取單克隆進行菌落PCR鑒定;取陽性克隆菌液進行質(zhì)粒提取、送樣測序,比對測序序列結(jié)果。

1.2.4TePPO基因生物信息學(xué)分析

利用蛋白組學(xué)分析平臺(ExPASy,https://www.expasy.org/)對TePPO編碼蛋白的理化性質(zhì)進行分析。使用同源建模方法[10](SWISS-MODEL)對TePPO蛋白三維結(jié)構(gòu)進行預(yù)測。同時,將TePPO基因序列在NCBI數(shù)據(jù)庫進行對比,利用MEGA 7.0軟件,使用Neighbor Joining遺傳算法構(gòu)建基因進化樹進行進化分析。

1.2.5 葉綠素量的測定

分別取黃色、桔黃色萬壽菊品種‘marvel yellow’、‘marvel orange’的不同發(fā)育時期的花組織樣品0.10～0.15 g(以直徑5 mm花蕾開始定為DP0,取隨后第10、15、21天的萬壽菊花組織,分別記為DP10、DP15、DP21),立即以液氮冷卻并快速研磨。然后加入丙酮5 mL,4 ℃避光浸提24 h,提取葉綠素。過濾、定容至合適濃度后以紫外可見分光光度計測定645、663 nm吸光值[11]。根據(jù)經(jīng)驗公式計算總?cè)~綠素的量。具體公式為:葉綠素的量=(20.2A645+8.02A663)×稀釋倍數(shù)/質(zhì)量。

1.2.6TePPO基因表達(dá)分析

分別以萬壽菊‘marvel yellow’、‘marvel orange’的葉片和DP10、DP15、DP21花組織樣品所反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板,以已知在萬壽菊不同組織中穩(wěn)定表達(dá)的TIF6 (translation initiation factor 6) 作為內(nèi)參基因[12],利用熒光定量PCR對TePPO表達(dá)水平進行檢測。其中TePPO基因定量PCR引物為:

TePPORTF 5’-TATGTGTGTGGGGATTATCGGAC-3’

TePPORTR 5’-ATCTTTCAACAACGCCTCTGC-3’;

TIF6基因引物為:

TIF6 F 5’-TAAGACCTGGTGGTGGAAATAGA-3’

TIF6 R 5’-CAGCACCATGAGGACGAAGA-3’。

2 結(jié)果與分析

2.1 TePPO基因克隆結(jié)果

以萬壽菊未成熟花組織的反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板,利用特異性巢式PCR引物對TePPO基因進行擴增,瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖1所示,由圖1可知，獲得與預(yù)期大小(1 699 bp)基本一致的目的條帶,且條帶清晰,沒有其他明顯的非特異擴增產(chǎn)物。將此擴增產(chǎn)物純化后與pEASY-Blunt 克隆載體連接,轉(zhuǎn)入大腸桿菌細(xì)胞，然后將菌落PCR鑒定的陽性克隆進行測序驗證。測序結(jié)果顯示克隆獲得了TePPO基因,其與轉(zhuǎn)錄組組裝序列僅有少數(shù)堿基的差異。表明轉(zhuǎn)錄組組裝結(jié)果較為準(zhǔn)確,由此克隆分離得到TePPO基因全長序列。

M. DNA Marker 1.TePPO基因圖1 TePPO基因PCR擴增產(chǎn)物

2.2 TePPO基因生物信息學(xué)分析結(jié)果

通過蛋白組學(xué)分析平臺(ExPASy)對TePPO編碼蛋白的理化性質(zhì)分析。結(jié)果顯示,TePPO基因編碼493個氨基酸,相對分子質(zhì)量約為54 KDa;等電點為6.74;不穩(wěn)定系數(shù)為30.11,屬于穩(wěn)定蛋白;親水性平均值為-0.08,屬于親水性蛋白。通過同源建模方法預(yù)測TePPO蛋白的三維結(jié)構(gòu)，如圖2a所示。利用TePPO基因序列所構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹如圖2b所示,圖2b中,TePPO為萬壽菊(Tageteserecta)PPO基因;AtPPO為擬南芥(Arabidopsisthaliana)PPO基因;AhPPO為花生(Arachishypogaea)PPO基因;AiPPO為花生(Arachisipaensis)PPO基因;AdPPO為蔓花生(Arachisduranensis)PPO基因;ZjPPO為棗(Ziziphusjujuba)PPO基因;HaPPO為向日葵(Helianthusannuus)PPO基因;MsPPO為紫花苜蓿(Medicagosativa)PPO基因;CsPPO為亞麻芥(Camelinasativa)PPO基因;SmPPO為卷柏(Selaginellamoellendorffii)PPO基因;GhPPO為棉花(Gossypiumhirsutum)PPO基因;ZmPPO為玉米(Zeamays)PPO基因;GsPPO為大豆(Glycinesoja)PPO基因;CpPPO為西葫蘆(Cucurbitapepo)PPO基因;CmPPO為筍瓜(Cucurbitamaxima)PPO基因;MdPPO為蘋果(Malusdomestica)PPO基因。

從圖2b可以看出，TePPO與其他植物物種PPO基因具有同源性,其中與向日葵和紫花苜蓿同源基因的一致性最高。

圖2 TePPO蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測和系統(tǒng)進化樹分析

2.3 萬壽菊花中葉綠素量的測定結(jié)果

對萬壽菊品種‘marvel yellow’、 ‘marvel orange’的3個發(fā)育時期(DP10、DP15、DP21)的花組織進行收集并測定葉綠素的量,如圖3所示,由圖3可知,在黃色品種‘marvel yellow’的DP10、DP15、DP21花組織中,每g鮮重中葉綠素的質(zhì)量分別為23、19、8 μg;而在桔黃色品種‘marvel orange’3個對應(yīng)時期花組織中每g鮮重中葉綠素的質(zhì)量分別9、5、3 μg。在黃色、桔黃色萬壽菊花發(fā)育早期(DP10、DP15),花中葉綠素的量均明顯高于成熟花(DP21);在花色呈現(xiàn)更明顯綠色的‘marvel yellow’中,其DP10、DP15、DP21花組織中葉綠素的量均顯著高于桔黃色品種‘marvel orange’3個對應(yīng)時期花組織(P<0.05)。表明葉綠素參與萬壽菊的花色形成,并隨著花組織的成熟其所含葉綠素的合成減少、降解加快,從而呈現(xiàn)多色漸變。

圖3 不同發(fā)育時期萬壽菊花和葉綠素的量

2.4 TePPO基因表達(dá)分析結(jié)果

對‘marvel yellow’、 ‘marvel orange’不同發(fā)育時期(DP10、DP15、DP21)的花組織中TePPO基因的表達(dá)水平進行RT-qPCR檢測，結(jié)果如圖4所示,從圖4可以看出，與葉片相比,TePPO在花中表達(dá)水平較高,表明TePPO基因可在萬壽菊花組織中轉(zhuǎn)錄,發(fā)揮功能。TePPO基因在萬壽菊花發(fā)育早期豐度更高,隨花組織的成熟,TePPO基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)降低。在花色中綠色更明顯、葉綠素含量更高的品種‘marvel yellow’中,不同發(fā)育時期的TePPO表達(dá)量也明顯高于‘marvel orange’品種。結(jié)合花中葉綠素量變化,萬壽菊花中TePPO基因表達(dá)水平與葉綠素量呈現(xiàn)一致的變化趨勢,基因表達(dá)與葉綠素量有較高的相關(guān)性。因此,TePPO基因的表達(dá)水平分析提示其可能參與萬壽菊花中葉綠素的合成及花色形成。

圖4 不同發(fā)育時期萬壽菊花中TePPO基因的表達(dá)水平

3 討 論

植物葉綠素的合成過程較為復(fù)雜,需要多種不同的酶催化完成,其中原卟啉原氧化酶PPO是催化最后步驟合成葉綠素的關(guān)鍵限速酶。在大多數(shù)真核生物和許多需氧或兼性細(xì)菌中,PPO是氧依賴性的。PPO蛋白結(jié)構(gòu)包括黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)結(jié)合域、底物作用結(jié)合域和膜結(jié)合域。通過FAD的黃素環(huán)(PPO輔助因子)從原卟啉原Ⅸ接收電子[13],并將電子轉(zhuǎn)移到氧分子,原卟啉原Ⅸ通過氧分子被氧化為原卟啉Ⅸ。PPO通過自身不同結(jié)構(gòu)域與底物、輔酶和蛋白之間發(fā)生相互作用調(diào)控葉綠素的合成[14]。已有報道認(rèn)為,原卟啉原氧化酶PPO催化形成原卟啉Ⅸ的酶促步驟在原核和真核生物生命形式中都是保守的。在植物中,葉綠素的產(chǎn)生也取決于該酶促步驟[15]。利用這一催化酶的關(guān)鍵性,通過開發(fā)可與PPO結(jié)合的底物,從而抑制PPO與體內(nèi)原卟啉原Ⅸ的結(jié)合,使葉綠素不能合成、原卟啉原Ⅸ積累而導(dǎo)致細(xì)胞死亡,可以達(dá)到新型生物農(nóng)藥除草劑的作用,因而也使PPO成為除草劑的一個特異靶標(biāo)[13-16]。PPO除了在催化葉綠素的生物合成中起到關(guān)鍵作用之外,還通過與多種有機體RNA編輯因子(MORF)家族蛋白相互作用,在調(diào)控質(zhì)體RNA編輯中發(fā)揮重要作用[8]。

近年來也有一些報道對葉綠素整個合成途徑進行綜述[17],但對具體基因功能的深入研究相對較少。對PPO基因的報道部分是以細(xì)菌、藍(lán)藻等微生物為載體,在植物中主要以擬南芥為主[18]。

4 結(jié) 論

本研究依據(jù)前期轉(zhuǎn)錄組信息,對TePPO基因進行了克隆,經(jīng)測序驗證其編碼序列與其他植物物種PPO基因具有同源性,其中與向日葵和紫花苜蓿PPO的一致性最高。

萬壽菊花中所含主要色素成分為類胡蘿卜素,由于類胡蘿卜素成分含量和組成的差異而呈現(xiàn)豐富的花色,而且其他色素成分(如葉綠素)進一步增加了萬壽菊花色的多彩漸變和觀賞性。本文在對TePPO基因表達(dá)模式的分析中發(fā)現(xiàn),其在萬壽菊花中轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平較高,且在葉綠素量高的花色品種、花發(fā)育時期,TePPO的表達(dá)量也相應(yīng)明顯升高,表明其參與萬壽菊花中葉綠素的合成與花色形成。因此,本研究工作可為植物花色遺傳改良提供基因資源和參考依據(jù)。