高小寧，吳自林，黃詠虹，劉 睿，齊永文

（廣東省科學(xué)院生物工程研究所/廣東省甘蔗遺傳改良工程技術(shù)中心，廣州510316）

0 引言

甘蔗(Saccharum spp.)是中國最重要的糖料作物，蔗糖占到中國食糖總產(chǎn)量的90%左右，在保障食糖安全方面具有重要地位。由黑頂柄銹菌(P.melanocephala)引起的甘蔗褐銹病(brown rust)于1890年在爪哇首次發(fā)現(xiàn)，1981年在中國福建蔗區(qū)發(fā)現(xiàn)其危害[1]，現(xiàn)已遍布世界各甘蔗種植區(qū)[2]。褐銹病主要危害甘蔗葉片，初為黃色小斑點(diǎn)，后擴(kuò)展為褐色短條斑，病斑處的葉背面產(chǎn)生紅褐色夏孢子堆。發(fā)病嚴(yán)重時蔗葉提早枯死，分蘗減少，蔗莖變細(xì)，可造成甘蔗減產(chǎn)15%～40%，蔗糖含量降低10%～36%[3]。已有的研究結(jié)果表明不同甘蔗品種及親本對褐銹病的抗性差異顯著，而感病品種的大面積種植成為病害流行的重要原因[4]。由于褐銹病的常發(fā)態(tài)勢，致使中國主栽的一批豐產(chǎn)高糖甘蔗品種因高感褐銹病而面臨淘汰，從而極大影響了中國甘蔗產(chǎn)業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展。因此，開展甘蔗與褐銹病互作研究，揭示甘蔗對褐銹病的抗性規(guī)律進(jìn)而選育抗病品種就成為主要的研究方向和目標(biāo)。研究人員通過構(gòu)建遺傳圖譜，發(fā)現(xiàn)并確認(rèn)了甘蔗抗褐銹病基因Bru1和Bru2；并建立了PCR、SSR、AFLP和RFLP的分子標(biāo)記技術(shù)用于甘蔗對褐銹病的抗性分析[5-9]。李文鳳等[10-13]結(jié)合抗褐銹病基因Bru1的分子檢測和抗病性鑒定，系統(tǒng)評價了中國甘蔗栽培原種、主要育種親本及品種對褐銹病的抗性特點(diǎn)。近年來轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)(RNA-seq)已經(jīng)越來越廣泛地用于植物與病原菌互作的研究中，挖掘出了大量與抗病相關(guān)的新基因及代謝途徑，為深入研究植物與病原菌互作的分子機(jī)制和植物抗病機(jī)理提供了物質(zhì)基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。在甘蔗病害研究中，研究人員利用RNA-seq技術(shù)，分析了甘蔗與黑穗病菌(Sporisorium scitamineum)[14]、甘蔗花葉病毒(Sugarcane mosaic virus)[15]、赤 條 病 菌 (Acidovorax avenae subsp.avenae)[16]、白 條 病 菌 (Xanthomonas albilineans)[17]互作過程中的基因表達(dá)特征。然而，至今未見從轉(zhuǎn)錄水平分析甘蔗響應(yīng)褐銹病菌侵染的相關(guān)報道。為此，本研究以Illumina HiSeq 2500高通量測序技術(shù)為基礎(chǔ)，對受褐銹病菌侵染以及健康甘蔗葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，找到二者在轉(zhuǎn)錄水平基因表達(dá)的差異，分析甘蔗響應(yīng)褐銹菌侵染的相關(guān)基因和途徑，對進(jìn)一步研究甘蔗抗褐銹病機(jī)理和抗病育種提供一些理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以廣東省科學(xué)院生物工程研究所科研試驗(yàn)基地內(nèi)種植的高感褐銹病甘蔗品種‘粵糖60號’為材料，測序樣品來自田間管理方式完全相同的同一地塊，根據(jù)葉片的感病狀況，試驗(yàn)材料分為感病組YTCL（感病初期甘蔗葉片）和對照組YTCK（健康的甘蔗葉片）。感病組為受褐銹病感染，初發(fā)病的黃色小斑點(diǎn)且無其他病斑及害蟲危害的甘蔗葉片，取病斑處；對照組取與感病組同等嫩度且無任何損傷的面積相等的健康葉片；所取樣品液氮速凍，每處理組3個重復(fù)。試驗(yàn)在廣東省科學(xué)院生物工程研究所，于2019年10月—2020年5月份進(jìn)行。

1.2 總RNA提取、cDNA文庫構(gòu)建與測序

使用Trizol法提取各樣品的總RNA，1.0%瓊脂糖電泳、NanoDrop 2000、Agilent Bioanalyzer 2100 system(Agilent Technologies,CA,USA)檢測RNA純度、濃度和完整性。檢測合格的RNA樣品，使用NEBNext UltraTM RNA Library Prep Kit試劑盒標(biāo)準(zhǔn)流程構(gòu)建文庫，委托北京百邁客生物科技有限公司使用高通量測序平臺Illumina HiSeq 2500進(jìn)行測序，得到原始測序序列。

1.3 數(shù)據(jù)的過濾與組裝

將測序得到的raw reads，去除帶接頭的reads、未知序列比例大于10%的reads和低質(zhì)量reads后得到clean reads，作為后續(xù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)。

1.4 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析

使用Hisat2將得到的clean reads比對到割手密參考基因序列(S.spontaneum)[18]，堿基錯配值設(shè)為2。使用 Nr(NCBI non-redundant protein sequences)、Nt(NCBI nucleotide sequences)、Pfam(Protein family)、KOG/COG(Clusters of orthologous groups of proteins)、Swiss-prot(A manually annotated and reviewed protein sequence database)，KEGG (Kyoto encyclopedia of genes and genomes)、GO(Gene ontology)等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因功能注釋。

基因表達(dá)水平通過RSEM軟件計算FPKM(fragments perkilobase oftranscriptpermillion fragments mapped reads)。使用DESeq2進(jìn)行差異基因的篩選，篩選條件為差異倍數(shù)(Fold Change)≥4且錯誤發(fā)現(xiàn)率(FDR,False Discovery Rate)＜0.01。通過GOseq對差異基因進(jìn)行GO功能富集分析，利用KOBAS進(jìn)行KEGG通路富集分析。

1.5 差異表達(dá)基因的qRT-PCR驗(yàn)證

以甘蔗的GAPDH為內(nèi)參基因，選取5個差異表達(dá)基因進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證。試驗(yàn)材料和取樣方法同1.1，采用Trizol法提取總RNA。按照SMARTer PCR cDNA Synthesis Kit試劑盒的方法合成cDNA。使用Primer 5.0軟件參考轉(zhuǎn)錄組測序序列設(shè)計實(shí)時熒光定量PCR引物（表1）。按照BBI公司SG Fast qPCR Master Mix說明書進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR。反應(yīng)體系(20 μL)：2×SYBR Green PCR Master Mix 溶液 10 μL（TOYOBO，日本），10 μmol/L上下游引物各0.5 μL，模板 1 μL，超純水補(bǔ)足 20 μL。PCR 反應(yīng)程序：95℃5 min，95℃ 10 s，60℃ 45 s，40個循環(huán)。3次試驗(yàn)重復(fù)，基因相對表達(dá)量的計算采用2-ΔΔCt法。

表1 實(shí)時熒光定量PCR的基因及引物

2 結(jié)果與分析

2.1 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量分析及比對統(tǒng)計

經(jīng)過測序質(zhì)量控制，6個樣品共得到42.71 Gb Clean Data，各樣品Clean Data都達(dá)到6.43 Gb，Q30堿基百分比均高于93%，對照葉片和感病葉片GC含量均大于54%。分別將各樣品的Clean Reads與割手密(S.spontaneum)的基因組進(jìn)行序列比對，比對效率在69.67%～80.75%；基于比對結(jié)果，進(jìn)行可變剪接預(yù)測分析、基因結(jié)構(gòu)優(yōu)化分析以及新基因的發(fā)掘，發(fā)掘新基因33,788個，其中27,999個得到功能注釋。

2.2 基因表達(dá)分析

在本研究的RNA-seq分析中，通過最大流量算法，采用FPKM作為衡量基因表達(dá)水平的指標(biāo)。對不同樣品的FPKM做箱線圖（圖1），F(xiàn)PKM密度分布顯示，感褐銹病葉片(YTCL)和健康葉片(YTCK)的基因總體表達(dá)量在離散度和總體分布度上存在一定差異，表明甘蔗葉片受到褐銹病菌侵染后，部分基因的表達(dá)發(fā)生了改變。

圖1 FPKM分布箱線圖

2.3 差異表達(dá)基因篩選

使用DESeq2進(jìn)行對照組與處理組間的差異表達(dá)分析，將Fold Change≥4且FDR＜0.01作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，統(tǒng)計分析所得的差異基因個數(shù)，共鑒定出差異基因4716個，其中上調(diào)表達(dá)2979個，下調(diào)表達(dá)1737個（圖2a）。進(jìn)一步對差異表達(dá)基因進(jìn)行聚類分析（圖2b），發(fā)現(xiàn)處理組與對照組差異明顯，受到褐銹病菌侵染的甘蔗葉片與健康葉片相比，上調(diào)表達(dá)基因數(shù)量高于下調(diào)表達(dá)基因。結(jié)果表明，大量基因在甘蔗葉片受到褐銹病菌侵染時呈現(xiàn)差異表達(dá)模式。

圖2 基因差異表達(dá)分析火山圖和熱圖

2.4 差異表達(dá)基因GO富集分析

GO功能分析將差異表達(dá)基因分為生物過程、細(xì)胞組分和分子功能3個功能注釋本體。圖3展示了每類功能之下Top10的功能亞分組。分析發(fā)現(xiàn)受褐銹菌侵染的甘蔗葉片涉及生物過程中代謝過程、細(xì)胞進(jìn)程、單體代謝過程出現(xiàn)了大量差異表達(dá)基因；分子功能的催化活性和結(jié)合2個條目中差異基因數(shù)量最多；細(xì)胞、細(xì)胞組分和細(xì)胞膜是細(xì)胞組分中最大的3個條目。

圖3 差異表達(dá)基因的GO功能分析

為了進(jìn)一步了解甘蔗葉片對褐銹菌侵染的響應(yīng)，通過topGO有向無環(huán)圖對上調(diào)差異表達(dá)基因分析富集程度，結(jié)果顯示（表2）：分子功能中有較多的GO term顯著富集，包括ATP結(jié)合、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶活性、解旋酶活性、黃嘌呤脫氫酶活性、L-乳酸脫氫酶活性、纖維素合成酶活性、轉(zhuǎn)座酶活性、查耳酮合成酶活性；生物過程中的谷胱甘肽代謝過程、毒素分解過程、纖維素生物合成過程、黃嘌呤分解過程、RNA聚合酶II啟動子轉(zhuǎn)錄調(diào)控、氧化還原過程顯著富集；細(xì)胞質(zhì)在細(xì)胞組分中顯著富集。

表2 轉(zhuǎn)錄組測序分析中上調(diào)差異表達(dá)基因的GO富集分析

2.5 差異表達(dá)基因的Pathway分析

利用KEGG數(shù)據(jù)庫可以分析差異表達(dá)基因參與的主要生化代謝途徑和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。本研究中差異表達(dá)基因的KEGG注釋顯示，1919個差異表達(dá)基因被注釋到114個通路；進(jìn)一步按照KEEG的通路類型進(jìn)行分類，結(jié)果如圖4所示：參與苯丙烷生物合成的差異表達(dá)基因最多，其次為谷胱甘肽代謝途徑、植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、淀粉和蔗糖代謝、類黃酮生物合成、碳代謝、糖酵解/糖異生、氨基酸生物合成、甘油磷酸脂代謝和植物與病原菌互作等通路。

圖4 差異表達(dá)基因KEGG分類圖

以KEGG數(shù)據(jù)庫中Pathway為單位，應(yīng)用超幾何檢驗(yàn)，與整個基因組背景相比，進(jìn)行Pathway顯著性富集分析。本研究中上調(diào)和下調(diào)差異表達(dá)基因KEGG通路富集分析結(jié)果如表3所示：從上調(diào)差異表達(dá)基因的富集程度可以看出，當(dāng)甘蔗葉片受到褐銹菌侵染時，苯丙烷生物合成、類黃酮生物合成、谷胱甘肽代謝等植物抵御生物脅迫有關(guān)的代謝途徑顯著富集，大量差異基因上調(diào)表達(dá)。

表3 差異表達(dá)基因KEEG通路富集分析

2.6 甘蔗響應(yīng)褐銹菌侵染的防御基因

本研究針對植物與病原菌互作途徑的富集基因，共篩選到13個差異表達(dá)基因，其中10個上調(diào)表達(dá)，3個下調(diào)表達(dá)。植物與病原菌長期互作過程中形成了包括PTI(PAMP-triggered immunity)和ETI(effectortriggered immunity)的免疫系統(tǒng)。在PTI系統(tǒng)中，鈣依賴蛋白激酶(CDPK)和呼吸爆發(fā)氧化酶(Rboh)協(xié)同作用產(chǎn)生活性氧并通過過敏性壞死反應(yīng)提高植物的抗病性。真菌細(xì)胞壁成分如寡糖和幾丁質(zhì)真菌PAMP，可以被寄主受體識別并激活防御反應(yīng)。在甘蔗受到褐銹菌侵染后，編碼幾丁質(zhì)激發(fā)子受體激酶(CERK1)、鈣依賴蛋白激酶(CDPK)、呼吸爆發(fā)氧化酶(Rboh)、鈣調(diào)蛋白(CaM)、PR1等基因上調(diào)表達(dá)。此外，在甘蔗響應(yīng)褐銹病菌侵染時，RPM1、RPS2、RPS4等相關(guān)抗病蛋白基因同樣出現(xiàn)上調(diào)表達(dá)。

2.7 差異表達(dá)基因的qRT-PCR分析

以甘蔗的GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參基因，對選取的PR1、PR10、CDPK、NPR1、CTR1等5個上調(diào)表達(dá)基因進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證，結(jié)果顯示這5個差異表達(dá)基因的表達(dá)趨勢與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)一致，說明轉(zhuǎn)錄組測序分析結(jié)果是可靠的。

3 討論

甘蔗褐銹病自20世紀(jì)80年代初期在中國甘蔗種植區(qū)發(fā)現(xiàn)以來，因其適應(yīng)性廣、產(chǎn)孢量大、傳播速度快、流行性強(qiáng)，加之單一甘蔗品種的大面積種植，致使病害迅速蔓延，已發(fā)展成為甘蔗種植中重要的葉部病害，而篩選和培育抗褐銹病的甘蔗種質(zhì)和品種是防控該病害最為經(jīng)濟(jì)和有效的途徑[19]。在前期的研究中，研究者基于cDNA-AFLP和SSH方法分析了甘蔗與褐銹病互作過程中的差異表達(dá)基因[20-21]，但是由于研究技術(shù)的局限，在一定程度上限制了對甘蔗響應(yīng)褐銹菌侵染分子機(jī)制的認(rèn)知水平。本研究首次利用高通量測序技術(shù)(RNA-seq)分析了感病品種粵糖60受到褐銹菌侵染的轉(zhuǎn)錄組，更為全面地揭示了基因表達(dá)特征，鑒定到4716個差異表達(dá)基因，并分析了差異表達(dá)基因的功能及其參與的代謝通路。取得的研究結(jié)果為揭示甘蔗與病菌互作的分子機(jī)制提供了豐富的數(shù)據(jù)資源。

植物內(nèi)源激素在植物與病原菌互作中發(fā)揮極其重要的作用。當(dāng)植物受到病原菌侵染時，通過產(chǎn)生小的信號分子并協(xié)調(diào)激素信號通路來激活信號網(wǎng)絡(luò)，從而啟動針對病原菌攻擊的防御機(jī)制。水楊酸(SA)、茉莉酸(JA)、乙烯(ET)、油菜素類脂(BR)、脫落酸(ABA)等激素類物質(zhì)是植物抗病信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的重要調(diào)控因子[22]。SA作為植物防御反應(yīng)中一個重要的信號分子，其介導(dǎo)的抗病信號通路主要針對活體營養(yǎng)型或半活體營養(yǎng)型病菌的侵染[23]。TGA基因家族是bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族的重要亞家族之一，能夠與靶基因啟動子上的as-1區(qū)域相結(jié)合，激活或抑制下游靶標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄，在SA介導(dǎo)的植物抗病信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要的調(diào)控作用[24]。郭雙元等[25]研究發(fā)現(xiàn)小麥TaTGA2.2受條銹菌和外源激素SA的誘導(dǎo)表達(dá)，TaTGA2.2可能通過與NPR1互作參與SA信號途徑介導(dǎo)的小麥對條銹菌的防御反應(yīng)。本研究的試驗(yàn)結(jié)果顯示：甘蔗TGA4和PR1在受到褐銹菌侵染后顯著上調(diào)表達(dá)，表明SA信號途徑在甘蔗與褐銹菌互作中發(fā)揮著相似作用。

轉(zhuǎn)錄因子(Transcription factor，TF)作為一類重要的調(diào)控基因，能夠與基因啟動子區(qū)域中的順式元件特異性結(jié)合，激活或者抑制目的基因的表達(dá)。WRKY、MYB、NAC、ERF等轉(zhuǎn)錄因子被發(fā)現(xiàn)是寄主植物響應(yīng)生物脅迫的重要調(diào)控因子。已有的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)WRKY轉(zhuǎn)錄因子中的很大一部分都參與了植物對生物脅迫的響應(yīng)，在植物多種免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，是植物響應(yīng)生物脅迫尤其是病原微生物的重要轉(zhuǎn)錄因子家族[26]。研究發(fā)現(xiàn)擬南芥AtWRKY33的過表達(dá)增強(qiáng)了對死體營養(yǎng)型真菌灰霉病菌(Botrytis cinerea)和黑斑病菌(Alternaria brassicicola)抗性，但是增強(qiáng)了對丁香假單胞桿菌(Pseudomonas syringae)的感病性[27]；進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)AtWRKY33直接被MPK3/6磷酸化進(jìn)而調(diào)控植保素合成基因的表達(dá)，將AtWRKY33磷酸化位點(diǎn)突變后，轉(zhuǎn)基因植株的抗病性明顯削弱[28]。本研究的結(jié)果顯示甘蔗WRKY33、WRKY22在褐銹菌侵染后顯著上調(diào)表達(dá)，但是WRKY轉(zhuǎn)錄因子在甘蔗與褐銹菌互作中的功能及其作用機(jī)理還有待進(jìn)行深入研究。

在植物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，鈣離子是普遍存在的第二信使，參與調(diào)控了大多數(shù)細(xì)胞生理代謝的過程。鈣信號在植物抗病信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起重要的作用，并通過鈣離子結(jié)合蛋白調(diào)節(jié)信號的傳遞[29]。鈣調(diào)蛋白(CaM)是植物細(xì)胞內(nèi)最重要的鈣離子結(jié)合蛋白，在植物生長發(fā)育和抗逆抗病中具有重要的調(diào)控作用。鈣依賴的蛋白激酶(CDPK)是細(xì)胞內(nèi)鈣離子信號的受體，同時具有鈣離子受體蛋白和Ser/Thr蛋白激酶的功能，廣泛參與植物逆境脅迫的分子響應(yīng)。本研究的KEGG代謝通路富集分析結(jié)果顯示，在甘蔗受到褐銹菌侵染后CDPK、CaM、CML等與Ca2+相關(guān)的基因顯著上調(diào)表達(dá)，這與孫云南等[30]在茶葉葉片響應(yīng)茶餅病侵染的轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果基本一致。

植物與病原物的互作是一個復(fù)雜且連續(xù)的過程，涉及植物抗病相關(guān)基因和病原物致病相關(guān)基因的遺傳和變異、表達(dá)和調(diào)控以及它們之間的相互聯(lián)系和影響。本研究僅對親和性互作條件下甘蔗葉片響應(yīng)褐銹菌侵染的基因表達(dá)特征進(jìn)行了分析，在褐銹病菌侵染甘蔗的不同階段以及甘蔗-褐銹病菌互作的非親和關(guān)系中，甘蔗在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)特征將是后續(xù)需要開展的研究。盡管，轉(zhuǎn)錄組分析作為挖掘功能基因的重要途徑之一，已被廣泛應(yīng)用于植物與病原菌互作研究中，但是，單個組學(xué)數(shù)據(jù)具有片面性，可能無法完整描繪整個生物學(xué)過程。因此，將基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)和代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)有機(jī)結(jié)合，基于各組學(xué)的特點(diǎn)及其各自相適應(yīng)的分析技術(shù)，通過多組學(xué)的聯(lián)合研究將能更全面的闡述甘蔗與褐銹病菌的互作過程及其規(guī)律，進(jìn)而為甘蔗抗褐銹病的種質(zhì)創(chuàng)新和品種改良奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究利用Illumina Hiseq 2500高通量測序平臺，在轉(zhuǎn)錄組水平上分析了甘蔗響應(yīng)褐銹病菌侵染的基因表達(dá)特征，篩選出差異表達(dá)基因4716個，其中2979個上調(diào)表達(dá)，1737個下調(diào)表達(dá)。GO和KEGG分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甘蔗葉片受到褐銹病菌侵染時，差異表達(dá)基因主要參與苯丙烷生物合成、谷胱甘肽代謝途徑、植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、類黃酮生物合成、植物與病原菌互作等代謝途徑。本研究獲得的甘蔗葉片與褐銹病菌互作的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，將為今后開展甘蔗抗/感病基因及其功能，解析甘蔗與褐銹病菌互作的分子機(jī)理提供數(shù)據(jù)支撐。