闞玉娜，謝佳明，簡白羽，馬立威，陳哲，王文豹，劉吉成*（.黑龍江中醫(yī)藥大學，哈爾濱50040；.齊齊哈爾醫(yī)學院，黑龍江 齊齊哈爾 6006）

糖尿病（DM）是一種常見的代謝性疾病，其特征是血糖水平異常升高，這可能會導致多系統(tǒng)并發(fā)癥，包括糖尿病性酮癥酸中毒，腎衰竭，心血管損害甚至死亡。2015年，全世界約有4.15億人患有糖尿病，到2040年，預計將超過6.4億[1]，90%為2 型糖尿?。═2DM）[2]。胰島素抵抗（IR）是T2DM 的主要原因，是指其靶細胞對胰島素敏感性降低或喪失，導致葡萄糖耐受性降低，動脈高血壓，以及葡萄糖和脂質(zhì)代謝紊亂，最終導致多種并發(fā)癥，例如非酒精性脂肪肝疾病、心血管疾病和代謝紊亂[3-4]。因此，改善IR已成為治療T2DM 的主要策略。IR 是推動T2DM發(fā)生的重要機制，在生理條件下，胰島素刺激葡萄糖進入肝臟，骨骼肌和脂肪組織維持葡萄糖穩(wěn)態(tài)，IR 時胰島素無法激活葡萄糖轉運，促進脂質(zhì)吸收，并抑制脂肪分解。

磷脂酰肌醇3 激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）信號通路是胰島素信號轉導的主要途徑，主要調(diào)節(jié)葡萄糖轉運、β細胞存活、胰島素基因轉錄等過程，該通路障礙都會導致IR[5]。胰島素與胰島素受體（InsR）結合時，胰島素受體底物（IRS）酪氨酸磷酸化后被激活，隨后激活PI3K/AKT 信號通路，參與胰島素的代謝調(diào)節(jié)[6]。

鈣敏感受體（CaSR）是不可或缺的膜蛋白，屬于G 蛋白偶聯(lián)受體C 家族。CaSR 可在脂肪組織中表達[7]，CaSR 激動劑使AKT 活性顯著增強，其抑制劑可抑制AKT 活性[8]。當CaSR 被激活時，可以使PI3K/Akt 信號通路激活，提示CaSR 與PI3K/Akt 信號通路密切相關[9]。

1 材料

1.1 實驗動物

Wistar 雄性大鼠48 只，體質(zhì)量（200±20）g[黑龍江中醫(yī)藥大學動物實驗中心，合格證號編號：SCXK（魯-2009-0007）]。分籠飼養(yǎng)，房間溫度（22±2）℃，相對濕度（50±5）%，空氣新鮮，通風良好，按時更換墊料，不限制攝食和飲水。

1.2 試藥

膽固醇、果糖、蔗糖和谷氨酸鈉（上?；菔郎噭┯邢薰荆槐蜓踵奏ぃ绹鳶igma 公司）；Tween 80（天津市進豐化工有限公司）；丙二醇（天津市化學試劑六廠）；葡萄糖（天津基準化學試劑有限公司）；75%乙醇（山東利爾康醫(yī)療科技股份有限公司）；苦味酸（西隴化工股份有限公司）；甲醛（天津永晟精細化工有限公司）；二甲苯、無水乙醇、鹽酸（北京化工廠）；氨水（西隴科學股份有限公司）；低熔石蠟、高熔石蠟（上海華永石蠟有限公司）；ELISA 試劑盒（南京生物試劑公司）；Trizol Reagen（Invitrogen 公司）；AccuPower RocketScript RT PreMix、AccuPower GreenStar qPCR PreMix 試劑盒（Bioneer 公司）；蛋白裂解液（碧云天生物有限公司）；蛋白預染Marker（美國Thermo 公司）；CaSR、β-actin 抗體（美國Abcam 公司）；AKT、p-AKT（S473）、p-AKT（T308）抗體（美國CST 公司）。

1.3 儀器

梯度PCR 儀（Bio-RAD S1000）、Real-time PCR 儀（Bio-RAD CFX96）、電泳儀（Bio-RAD）、半干轉膜儀（Bio-RAD）、Bio-RAD 凝膠成像系統(tǒng)（Universal Hood Ⅱ）；微量臺式低溫離心機（Thermo 有限公司）；紫外分光光度計（日本島津有限公司）。

2 方法

2.1 分組與建模

脂肪乳的制備：豬油（20%）、膽固醇（5%）、蔗糖（5%）、果糖（5%）、丙硫氧嘧啶（1%）、谷氨酸鈉（1%）、食用鹽（6%）、Tween 80（20%）和丙二醇（30%）配成脂肪乳。

雄性Wistar 大鼠48 只，隨機分為模型組和空白組，每組24 只，于第2、4、6、8 周分別處死6 只。模型組大鼠灌胃脂肪乳（10 mL·kg－1），1 次·d－1，空白組灌胃等量蒸餾水。

2.2 觀測指標與標本采集

2.2.1 大鼠一般情況觀察 觀察大鼠行為表現(xiàn)，測量體質(zhì)量。

2.2.2 空腹血糖（FBG） 各組大鼠末次灌胃脂肪乳后禁食，不禁水，12 h 后經(jīng)尾靜脈取血，用血糖儀測定大鼠FBG。

2.2.3 空腹胰島素（FINS） 將動物麻醉后，腹主動脈取血4 mL， 靜置30 min，4℃、3500 r·min－1離心15 min 后，取上清液1 mL，－20℃保存，按酶聯(lián)免疫試劑盒說明書方法進行檢測。根據(jù)FBG 和FINS 的值，計算胰島素敏感指數(shù)（ISI）：ISI ＝ln[1/（FBG×INS）]。

2.2.4 免疫組化檢測脂肪組織CaSR 表達 將經(jīng)多聚甲醛固定液浸泡的大鼠脂肪組織標本，切成2 mm×3 mm×4 mm 大小的組織塊，用0.1 mmol·L－1PBS 漂洗后，使用不同濃度乙醇脫水，包埋，蠟塊在室溫下自然冷卻凝固；修塊后用石蠟切片機切片，與標本垂直方向連續(xù)切片，厚5 μm，間斷集片，將組織切片粘貼于經(jīng)過10%多聚賴氨酸處理過的載玻片上。貼片，60℃烘烤60 min，在切片組織上滴加按1∶1000 比例配制的CaSR 抗體，4℃過夜，檢測。

2.2.5 實時熒光定量PCR（RT-q-PCR）檢測脂肪組織CaSR mRNA 的表達量 取冰凍組織在研缽中用液氮研磨成為粉末狀小顆粒，并將研磨好的組織轉入l.5 mL 離心管中，全程冰上操作，按照Trizol 試劑盒提取脂肪組織中總RNA，按逆轉錄試劑盒合成cDNA，引物由哈爾濱賽拓生物有限公司設計合成，按照實時熒光定量PCR 試劑盒說明書在熒光定量PCR 儀上測定。

2.2.6 蛋白印跡法（Western blot）檢測脂肪組織CaSR 蛋白表達水平及蛋白激酶（AKT）活性 取凍存的脂肪組織在研缽中用液氮研磨成粉末狀小顆粒，加入蛋白裂解液提取蛋白；電泳分離；將蛋白轉移到PVDF 膜上，封閉1 h，用TBST 清洗3 次，每次5 min，加入相應的一抗（1∶1000）4℃過夜；加入稀釋好的二抗（1∶1000），室溫輕搖1 h，TBST 洗膜3 次（5 min/次），采用化學發(fā)光顯影觀察結果。

2.3 統(tǒng)計方法

采用SPSS 17.0 軟件進行數(shù)據(jù)處理和分析，所有實驗數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標準差（±s）表示，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 一般情況

空白組大鼠皮毛有光澤，活動敏捷，攝食量及攝水量均無明顯變化，體質(zhì)量增加，差異無統(tǒng)計學意義；模型組大鼠皮毛無光澤，精神萎靡，靈敏性下降，行動緩慢、攝水量及尿量增加，第6 周和8 周時，與空白組比較，模型組大鼠體質(zhì)量增加（P＜0.05），見圖1A。

3.2 各組大鼠FBG、FINS、ISI

由圖1B、C 可見，模型組大鼠FBG 水平隨著灌胃脂肪乳時間增加而增加，其中第4、6、8周時，與相應空白組比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，P＜0.01）；FINS 表達水平隨著造模時間延長而增加，到第8 周時，與空白組比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；由圖1D 可見，與空白組比較，模型組大鼠ISI 在第6周、第8 周時與空白組比較差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，P＜0.01）。

圖1 大鼠體質(zhì)量（A）、空腹血糖（B）、空腹胰島素（C）、胰島素敏感指數(shù)（D）的變化Fig 1 Change of body mass （A） and expression level of fasting blood glucose（B） ，fasting insulin（C） ，and insulin sensitivity index（D）in rats

3.3 脂肪組織中CaSR 免疫組化檢測

第2 周時，空白組與模型組大鼠脂肪組織中均可見CaSR 表達（棕色），與空白組比較，模型組脂肪組織內(nèi)CaSR 表達水平下降，見圖2。

圖2 第2 周時空白組（A）與模型組（B）大鼠脂肪組織中CaSR的表達水平Fig 2 Expression level of CaSR in adipose tissue of the control group（A）and the model group（B）at the second week

3.4 CaSR 在脂肪組織中mRNA 的表達

如圖3所示，在脂肪組織中，與空白組比較，模型組CaSR mRNA 表達水平下調(diào)，且隨著脂肪乳灌胃時間的增加而呈下降趨勢，在第6 周、第8 周兩組之間差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

圖3 脂肪組織CaSR mRNA 的表達Fig 3 Expression level of CaSR mRNA in adipose tissue

3.5 大鼠脂肪組織中CaSR 的蛋白表達水平

如圖4A 所示，在脂肪組織中，各模型組CaSR 蛋白表達隨著脂肪乳灌胃時間的增加而呈下降趨勢，與第2 周時比較，第8 周時CaSR 蛋白表達顯著降低（P＜0.05）。

3.6 大鼠脂肪組織中AKT 活性

如圖4B 所示，在脂肪組織中，各模型組AKT活性隨著灌胃脂肪乳時間的增加而呈下降趨勢，與第2 周時模型組比較，第8 周時的磷酸化AKT（T308）差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與第2 周時比較，第6 周、第8 周的模型組磷酸化AKT（S473）的差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，P＜0.01）。

圖4 模型組大鼠脂肪組織CaSR 蛋白的表達（A）及AKT 活性（B）Fig 4 Expression level of CaSR protein （A）and AKT activity （B）in adipose tissue of the model group

4 討論

本研究為模擬高脂飲食對人類健康的影響，采用分周給予大鼠脂肪乳，與空白組比較，第8周時模型組大鼠體質(zhì)量、FINS、FBG 和ISI 存在顯著差異，提示第8 周時大鼠產(chǎn)生IR。

Li 等[10]研究表明，AKT 的活性被NPS2390（CaSR 抑制劑）抑制，而GdCl3（CaSR 激動劑）能增強AKT 活性，同時發(fā)現(xiàn)CaSR 的生理效應與PI3K/AKT 信號通路密切相關。研究表明，高脂飲食誘導的大鼠肝臟和肌肉中，可能通過抑制CaSR，降低PI3K/AKT 信號通路中AKT 活性，導致IR[11]。劉笑男等[12]研究表明，CaSR 可在脂肪細胞中表達，GdCl3可增加AKT 活性，當調(diào)節(jié)CaSR 分子表達水平時，可增強AKT 活性，改善IR。研究提示，IR 時CaSR 可能參與PI3K/AKT信號通路。

IR 是指身體目標器官或組織對胰島素的敏感性喪失和胰島素無法促進葡萄糖吸收，脂肪量增加通常會引起胰島素抵抗，這是與肥胖有關的代謝性疾?。ㄈ绱x綜合征和T2DM）的關鍵因素[13]。CaSR 在人脂肪細胞中激活，可使促炎細胞因子白介素6（IL-6），趨化因子C-C 基序配體2（CCL2），白介素1β（IL-1β）和腫瘤壞死因子α（TNF-α）的表達升高[14]。此外，CaSR 活化可刺激脂肪細胞的增殖和促炎性細胞因子表達，促使內(nèi)臟脂肪生成增加[15-16]。在本研究中，采用免疫組化法檢測IR 大鼠脂肪組織中CaSR 表達水平顯著降低；采用RT-qPCR 檢測到高脂飲食誘導IR大鼠的脂肪組織中CaSR mRNA 表達顯著降低；Western blot 結果表明，給予脂肪乳2、4、6、8 周后CaSR 蛋白表達量顯著降低；在高脂飲食誘導大鼠IR 過程中，CaSR 從基因到蛋白水平均呈現(xiàn)降低趨勢，且與血糖及胰島素水平呈負相關，推測CaSR 可能在IR 發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。

PI3K/AKT 信號通路在細胞生存過程中發(fā)揮重要作用，如葡萄糖穩(wěn)態(tài)、脂質(zhì)代謝、蛋白質(zhì)合成、細胞增殖和生長等。AKT 主要表達在骨骼肌，脂肪和肝臟等胰島素敏感組織中[17-18]。AKT通過兩個關鍵的磷酸化過程激活，磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1（PDK1）將激酶結構域中的蘇氨酸308（T308）磷酸化，啟動激活過程，隨后通過mTOR 復合物2（mTORC2）在羧基末端調(diào)節(jié)域中的絲氨酸473（S473）進行磷酸化，完全激活AKT[19-21]。AKT 還參與細胞周期調(diào)節(jié)及葡萄糖轉運中胰島素的調(diào)節(jié)。在高脂飲食喂養(yǎng)第2、4、6 和8 周后，模型組中磷酸化AKT（T308和S473）顯著降低，提示高脂飲食誘導的IR 中PI3K/AKT 信號通路受到抑制。

5 結論

本研究證明了CaSR 在大鼠脂肪組織中的表達，脂肪乳誘導的IR 大鼠中，CaSR 分子表達水平被抑制，可能導致PI3K/AKT 信號通路中AKT活性被抑制，提示CaSR 可能經(jīng)由PI3K/AKT 信號通路，參與高脂飲食可誘導大鼠IR 發(fā)展過程。因此，CaSR 可作為IR 治療新的靶點，為研究IR發(fā)生發(fā)展的潛在分子機制提供新的方向。