董穎，張鶴，張玉堯，潘黛安，魏星華，趙大慶（.魯西南醫(yī)院有限公司，山東 聊城 5300；.長春中醫(yī)院大學(xué)附屬醫(yī)院，長春 300；3.吉林省科普服務(wù)中心，長春 300）

哈蟆油為蛙科動物中國林蛙Rana temporaria chensinensisDavid 雌蛙的輸卵管，為滋補藥材，具有補腎益精、健脾益胃、滋陰補腎、潤肺生津等功效。中國林蛙的輸卵管呈不規(guī)則彎曲，位于腹腔中下位兩側(cè)，全長呈現(xiàn)粗細(xì)不均勻，近肺根段較細(xì)，中段漸漸加粗，近子宮段輸卵管較粗且略扁，其長度一般為體長的4 ～8 倍，質(zhì)量為體質(zhì)量的20%～26%[1]；呈現(xiàn)乳白色或黃白色，干品偶帶有灰白色薄膜狀的干皮，呈脂肪樣光澤，手摸有滑膩感，質(zhì)硬且易斷；有特殊的油脂氣味和腥味，味微甘，嚼之有黏滑感；膨脹度大于55；其主要成分為蛋白質(zhì)，含量約占50%以上[2]。常見的偽品黑斑蛙的輸卵管（青蛙油）外觀性狀為不規(guī)則彎曲，中間灰黑色瓣膜，管徑均一，透明；白色或黃白色，有脂肪樣光澤；質(zhì)脆易碎，手摸之稍有油脂狀潤滑感；味辛辣，嚼之麻嘴、黏牙；膨脹度大于55；其主要成分為蛋白質(zhì)，含量約為47.5%[3]。在目前的研究中，偽品青蛙油與正品哈蟆油性狀上相似，不易區(qū)別，但通過顯微、薄層色譜等方法可以進(jìn)行鑒別[4]。至今研究顯示哈蟆油中特異性的成分僅有1-甲基海因，但目前在青蛙油中也發(fā)現(xiàn)含有該成分[5]。本研究采用iTRAQ技術(shù)和質(zhì)譜分別建立和比較哈蟆油和青蛙油的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫，篩選兩個種屬蛙在冬眠前輸卵管中蛋白組成的差異。

1 材料

1.1 樣品采集

哈蟆油的基源動物為中國林蛙長白山亞種，保護(hù)地域為吉林省長白山區(qū)域。林蛙采于吉林省蛟河市前進(jìn)鄉(xiāng)（東經(jīng)127°40′18.4′，北緯43°54′20.9′）、永吉縣北大湖鎮(zhèn)（東經(jīng)126°30′14′，北緯43°27′53′）、舒蘭市上營鎮(zhèn)（東經(jīng)127°15′43.9′，北緯44°8′25.2′）、樺甸市紅石砬子鎮(zhèn)（東經(jīng)127°6′26.5′，北緯42°57′17.7′）、集安市清河村（東經(jīng)125°55′58.2′，北緯41°25′59.5′）和安圖縣三道灣鎮(zhèn)（東經(jīng)129°10′19.5′，北緯43°9′29.2′），海拔在500 ～1000 米。黑斑蛙（青蛙）采自于吉林省永吉縣北大湖鎮(zhèn)（東經(jīng)126°30′14′，北緯43°27′53′）和吉林市（東經(jīng)126°25′17′，北緯44°4′40′）兩個地區(qū)，海拔在100 ～300 米。中國林蛙和黑斑蛙均經(jīng)長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院肖井雷副教授鑒定為正品。

1.2 儀器與試藥

Q Exactive 質(zhì)譜儀（Thermo 公司）；AKTA Purifier 100 蛋白純化儀、數(shù)控600V 電泳儀（通用GE Healthcare 公司）；5430R 型低溫高速離心機、真空離心濃縮儀（德國Eppendorf 公司）；胰蛋白酶（Promega 公司）；iTRAQ Reagent-8plex Multiplex Kit（美國AB SCIEX 公司）；丁香酚（Sigma，純度：98%，批號：E2069）。

2 方法[6-7]

2.1 林蛙和黑斑蛙的輸卵管（蛙油）摘取

分別取活蛙，沿腹部正中線解剖，取出輸卵管，去除筋膜、肉、卵等雜物，用蒸餾水反復(fù)清洗至呈乳白色或黃白色，置于陰涼干燥處晾干，研缽研磨成粉末。哈蟆油樣品：5 個產(chǎn)地各取10 只混合后準(zhǔn)確稱量100 mg 后混勻；青蛙油樣品：兩個產(chǎn)地分別取10 只混合，準(zhǔn)確稱量100 mg，混勻。

2.2 蛙油中蛋白質(zhì)的提取和含量測定

兩個蛙油樣品各準(zhǔn)確稱取10.0 mg，分別加入1 mL SDT 裂解液，勻漿后沸水浴5 min，超聲破碎10 min，14 000 g 室溫離心45 min，取上清液，－80℃保存?？捡R斯亮藍(lán)法測定兩個蛙油樣品中蛋白質(zhì)的含量，哈蟆油蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度分別為8.83 μg·μL－1和7.09 μg·μL－1，青蛙油蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度為6.59 μg·μL－1。

2.3 iTRAQ 定量分析

每份樣品各取250 μg，胰酶消化，酶解后的肽段用8 標(biāo)iTRAQ 試劑中的113、114 和115 進(jìn)行標(biāo)記。采用二維液相（納升流速HPLC 液相系統(tǒng)Easy nLC 和強陽離子交換液相色譜）進(jìn)行分離，每份樣品經(jīng)分離后用Q-Exactive 質(zhì)譜儀進(jìn)行分析[8]。

2.4 哈蟆油與青蛙油差異蛋白質(zhì)篩選

對哈蟆油蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫中1220 個蛋白質(zhì)組在樣本哈蟆油113（A）/REF 和114（B）/REF與青蛙油115（C）/REF 中的定量信息進(jìn)行差異分析，篩選條件為比值＞1.5（或比值＜0.67），且P＜0.05。

2.5 生物信息學(xué)分析

2.5.1 Gene Ontology（GO）功能注釋分析 在GO 注釋過程中，Blast 2 GO 通過比較目標(biāo)序列和比對序列的相似性、GO 條目來源的可靠性和GO有向無環(huán)圖的結(jié)構(gòu)，將map 過程中提取的GO 功能條目中符合條件的條目注釋給目標(biāo)蛋白質(zhì)。

2.5.2 WEGO 注釋分析 利用WEGO 軟件對鑒定到的差異蛋白質(zhì)的細(xì)胞學(xué)組件、生物學(xué)途徑和分子功能完成GO 注釋，比較青蛙油（C/REF）與哈蟆油（/REF）差異蛋白質(zhì)進(jìn)行WEGO 分析。對GO 2 層次進(jìn)行匯總。

2.5.3 KEGG 通路注釋 利用KAAS（KEGG automatic annotation server）數(shù)據(jù)庫將目標(biāo)蛋白質(zhì)序列與KEGG GENES 數(shù)據(jù)庫中的兩棲綱蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比對，通過同源/相似蛋白質(zhì)的KO 號注釋到相關(guān)KEGG 通路上。

3 結(jié)果

3.1 青蛙油與哈蟆油差異蛋質(zhì)白質(zhì)篩選結(jié)果

對青蛙油與哈蟆油中蛋白質(zhì)定量的數(shù)據(jù)進(jìn)行差異比較，篩選出差異表達(dá)蛋白質(zhì)總數(shù)為55 個，其中上調(diào)的蛋白質(zhì)數(shù)為40 個（見表1），下調(diào)的蛋白質(zhì)數(shù)為15 個（見表2）。

表1 青蛙油與哈蟆油相比上調(diào)的蛋白質(zhì)Tab 1 Up-regulated proteins in the proteomics database of OCB compared with that of ORN

表2 青蛙油與哈蟆油相比下調(diào)的蛋白質(zhì)Tab 2 Down-regulated proteins in the proteomics database of OCB compared with that of ORN

3.2 青蛙油中含量較高的差異蛋白質(zhì)（上調(diào)蛋白）

參與能量代謝過程的蛋白質(zhì)包括羥?；o酶A脫氫酶三官能多酶復(fù)合體亞基β（HADHB）、乙酰輔酶A 合成酶（AACS）、烏頭酸水合酶（ACO1）、煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶s 同源體（NAMPT）和羥酰輔酶A 脫氫酶Ⅱ型（HSD17B10）等。參與糖代謝的蛋白質(zhì)包括半乳糖-1-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶（GALT）、血漿a-L-巖藻糖苷酶（FUCA2）和磷酸葡萄糖變位酶（PGM1）等。參與應(yīng)激反應(yīng)的蛋白質(zhì)包括鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白a 亞基14（GNA14）、L-乳酸脫氫酶A 鏈（LDHA）、血紅素結(jié)合蛋白（HPX）和蛋白酶體亞基α-3 型（PSMA3，PSMA5）等。參與生長發(fā)育相關(guān)的蛋白質(zhì)包括LUC7-like、核孔復(fù)合物蛋白（NUP93）和高速泳動族蛋白B2（HMGB2）等。參與生物合成的蛋白質(zhì)包括核糖體蛋白（RPS26）、不均一核核糖核蛋白質(zhì)A1 樣亞型1（HNMPA1）和絲氨酸轉(zhuǎn)運RNA 連接酶（SARS1）等。參與細(xì)胞骨架形成的蛋白質(zhì)包括細(xì)絲蛋白（FLNB）和驅(qū)動蛋白重鏈（KIF）等。參與氧化還原的蛋白質(zhì)包括1，2-二羥基-3-酮-5-甲基硫戊烯雙加氧酶（ADI1）和微粒體谷胱甘肽s-轉(zhuǎn)移酶3 S 同源體（MGST3）等。參與免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的蛋白質(zhì)包括腺苷脫氨酶2（ADA2）。

3.3 哈蟆油中含量較高的差異蛋白質(zhì)（下調(diào)蛋白）

3.4 WEGO 注釋分析結(jié)果

3.4.1 細(xì)胞組分分析 從圖1細(xì)胞組分中可以看出青蛙油與哈蟆油比較差異蛋白質(zhì)表達(dá)體現(xiàn)在細(xì)胞、細(xì)胞器、膜、大分子復(fù)合體、膜封閉腔和胞外區(qū)，分別占所有差異蛋白質(zhì)的34%、23%、16%、16%、8%和3%。

圖1 差異蛋白質(zhì)細(xì)胞組分分析Fig 1 Cellular components of differentially expressed proteins

3.4.2 分子功能分析 從圖2分子功能中可以看出催化活性、結(jié)合功能、結(jié)構(gòu)分子活性、酶調(diào)節(jié)活性、化學(xué)引誘物活性、載體活性、核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性、抗氧化活性和分子轉(zhuǎn)導(dǎo)活性是青蛙油與哈蟆油差異蛋白質(zhì)比較集中的9 類功能，其中催化活性和結(jié)合功能類蛋白質(zhì)最多，分別占所有差異蛋白質(zhì)的43%和42%。

圖2 差異蛋白質(zhì)分子功能分析Fig 2 Molecular function of differentially expressed proteins

3.4.3 生物學(xué)途徑分析 從圖3生物學(xué)途徑中可以看出繁殖、免疫系統(tǒng)過程、代謝過程、細(xì)胞過程、信號、多組織過程、發(fā)育過程、生長過程、位移運動、單組織過程、刺激反應(yīng)、定位、多生物過程、生物調(diào)節(jié)和細(xì)胞成分組織/生物合成是青蛙油與哈蟆油差異蛋白質(zhì)比較集中的15 個生物學(xué)途徑，其中參與代謝過程、細(xì)胞過程、單組織過程和生物調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)數(shù)量較多，分別占所有差異蛋白質(zhì)的21%、19%、12%和10%。

圖3 差異蛋白質(zhì)生物學(xué)途徑分析Fig 3 Biological process of differentially expressed proteins

3.5 青蛙油與哈蟆油差異蛋白質(zhì)KEGG 代謝通路分析

青蛙油與哈蟆油的差異蛋白質(zhì)總數(shù)為55 個，其中29 個差異蛋白質(zhì)map 到77 條KEGG 信號/代謝通路中；在這29 個差異蛋白質(zhì)中，27 個上調(diào)蛋白map 到76 條KEGG 信號通路中，兩個下調(diào)蛋白map 到8 條KEGG 信號通路中。

與哈蟆油蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)比，青蛙油中含量較高（即上調(diào)）的27 個差異蛋白質(zhì)中鈉/鉀離子轉(zhuǎn)運ATP 酶亞基α1 肽（ATP1A1）參與cGMP-PKG 信號通路（cGMP-PKG signaling pathway）、唾液分泌（salivary secretion）、心肌細(xì)胞腎上腺素能信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（adrenergic signaling in cardiomyocytes）、胰島素分泌（insulin secretion）、甲狀腺激素合成（thyroid hormone synthesis）等16 個代謝過程；PGM1 參與糖酵解/糖異生途徑（glycolysis/gluconeogenesis）、磷酸戊糖途徑（pentose phosphate pathway）、半乳糖代謝（galactose metabolism）、嘌呤代謝（purine metabolism）等7 個代謝過程；Ⅰ型膠原蛋白a1 鏈（COL1A1）參與焦點黏連（focal adhesion）、ECM 受體相互作用（ECM-receptor interaction）、血小板活化（platelet activation）等6 個代謝過程；ACO1 參與三羧酸循環(huán)（citrate cycle）、乙醛酸和二羧酸代謝（glyoxylate and dicarboxylate metabolism）、原核生物固碳過程（carbon fixation pathways in prokaryotes）、碳代謝（carbon metabolism）等6 個代謝過程；HADHB 參與脂肪酸降解（fatty acid degradation），脂肪酸伸長（fatty acid elongation），纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解（valine，leucine and isoleucine degradation），苯甲酸降解（benzoate degradation）和脂肪酸代謝（fatty acid metabolism）等5 個代謝過程；LDHA 參與糖酵解/糖異生途徑（glycolysis/gluconeogenesis）、半胱氨酸和甲硫氨酸代謝（cysteine and methionine metabolism）、丙酮酸代謝（pyruvate metabolism）、丙酸代謝（propanoate metabolism）等4 個代謝過程。

在差異蛋白質(zhì)富集分析中發(fā)現(xiàn)，半乳糖代謝、氨基糖和核苷酸糖代謝（amino sugar and nucleotide sugar metabolism）均富集到3 個差異蛋白質(zhì)（GALT、PGM1、UDP2）。糖酵解/糖異生途徑富集到兩個差異蛋白質(zhì)LDHA 和PGM1。嘌呤代謝（purine metabolism）富集到兩個差異蛋白質(zhì)PNP 和PGM1。半胱氨酸和甲硫氨酸代謝富集到兩個差異蛋白質(zhì)ADI1 和LDHA。纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解富集到兩個差異蛋白質(zhì)HADHB 和HSD17B10。

哈蟆油中含量較高（即下調(diào)）的兩個差異蛋白質(zhì)包括LOC398139 protein，CD63 antigen。其中LOC398139 protein 參與三羧酸循環(huán)（citrate cycle）、乙醛酸和二羧酸代謝（glyoxylate and dicarboxylate metabolism）、原核生物固碳過程（carbon fixation pathways in prokaryotes）、氧代羧酸代謝（2-oxocarboxylic acid metabolism）和氨基酸生物合成（biosynthesis of amino acids）等6 個代謝過程。CD63 antigen 參與溶酶體（lysosome）和癌癥過程蛋白聚糖（proteoglycans in cancer）等兩個代謝過程。

其他差異蛋白質(zhì)在KEGG 代謝通路中未被注釋到。

4 討論與結(jié)論

4.1 青蛙油中含量較高的差異蛋白質(zhì)與環(huán)境、生長發(fā)育的關(guān)系

成年黑斑蛙常棲息于稻田、池溏、湖澤、河濱、水溝內(nèi)或水域附近的草叢中。一般10月開始冬眠，鉆入向陽的坡地或離水域不遠(yuǎn)的田地、溝埂、塘埂土層30 ～40 cm 深處穴居冬眠，次年4月后出蟄[9]。冬眠前青蛙油中含量較高的差異蛋白質(zhì)（即上調(diào)成分）與黑斑蛙平時的棲息環(huán)境、冬眠環(huán)境可能存在密切關(guān)系。

鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白（GNA14）是在膜結(jié)合受體和細(xì)胞內(nèi)效應(yīng)器之間起信號傳遞作用，可水解GTP 生成GDP，具有GTP 酶活性，在哺乳動物細(xì)胞中G 蛋白和其受體形成一個最普遍的信號系統(tǒng)，在哺乳動物的各種組織中均有表達(dá)，如腦、心臟、胚胎等組織。參與調(diào)節(jié)感官感知[10]、細(xì)胞生長、激素的分泌和釋放[11]、防御物質(zhì)的信號傳導(dǎo)[12]及脂肪體中能源物質(zhì)的使用[13]。有研究表明，在低氧或缺氧的胚胎中GNA14 高表達(dá)，可調(diào)節(jié)高血壓和內(nèi)皮細(xì)胞的功能[14-15]。因此認(rèn)為GNA14 在蛙冬眠過程中調(diào)節(jié)機體機能，適應(yīng)環(huán)境方面起到重要作用。

血紅素結(jié)合蛋白（HPX）是肝臟合成的一種急性時相反應(yīng)蛋白，在血漿中與游離的血紅素結(jié)合能力最強，廣泛參與機體多種生理和病理過程。機體內(nèi)游離的血紅素是有害的，可以破壞脂質(zhì)雙分子層，促進(jìn)低密度脂蛋白轉(zhuǎn)化成具有細(xì)胞毒性的氧化產(chǎn)物[16]，還可以插入紅細(xì)胞膜，縮短紅細(xì)胞的壽命，加速溶血的發(fā)生[17]，HPX 可以結(jié)合和轉(zhuǎn)運有毒的游離血紅素至肝臟而發(fā)揮解毒作用。Grinberg 等[18]研究發(fā)現(xiàn)HPX 與血紅素結(jié)合后，血紅素誘導(dǎo)的氧自由基明顯減少，過氧化活性下降80%～90%，脂質(zhì)過氧化活性也顯著降低，進(jìn)而達(dá)到抗氧化的作用。目前研究結(jié)果顯示HPX 還具有維持體內(nèi)鐵的穩(wěn)態(tài)[19]、保護(hù)神經(jīng)[20]等功能。在黑斑蛙冬眠過程中，高含量的HPX降解機體產(chǎn)生的毒素-血紅素，同時起到抗氧化的作用。

羥?；o酶A 脫氫酶三官能多酶復(fù)合體亞基β（HADHB）是一種具有多功能的膜結(jié)合型蛋白酶，可以催化3 種酶活性（長鏈烯酰輔酶A 水合酶、長鏈3-羥烷基輔酶A 脫氫酶和長鏈3-酰基輔酶A 硫解酶），參與脂肪酸和脂質(zhì)代謝過程，在線粒體中參與長鏈脂肪酸的β氧化過程產(chǎn)生能量[21-22]。ACO1 也稱烏頭酸酶，廣泛分布于動植物和微生物中，在肝臟、腎臟、肌肉、前列腺中含量特別高。在三羧酸循環(huán)中，ACO1 為催化檸檬酸和異檸檬酸之間相互轉(zhuǎn)換的輔酶[23]。GALT具有催化、連接活性，參與半乳糖代謝過程[24]。在KEGG 代謝通路中， 筆者發(fā)現(xiàn)ATP1A1、PGM1、ACO1、HADHB、GALT 和LDHA 是青蛙油中重要的差異蛋白質(zhì)，主要參與體內(nèi)的各種糖代謝、糖異生、氨基酸代謝、脂肪代謝等代謝過程。

綜合以上青蛙油中差異的蛋白結(jié)構(gòu)、活性特點可以看出，部分蛋白質(zhì)是參與胚胎細(xì)胞生長、發(fā)育的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，部分蛋白質(zhì)在蛙冬眠過程中提供能量，是維持生命活動的重要成分，為冬眠期和翌年的排卵期做準(zhǔn)備。

4.2 哈蟆油中含量較高的差異蛋白質(zhì)的特點與環(huán)境、生長發(fā)育的關(guān)系

中國林蛙冬眠期主要在水下，這個特點是中國林蛙所特有的，其他種類的蛙一般都在泥土中冬眠。同時在東北中國林蛙最早結(jié)束冬眠，比黑斑蛙、蟾蜍等蛙類早20 ～30 d。本文通過比較青蛙油與哈蟆油蛋白質(zhì)組學(xué)的差異，發(fā)現(xiàn)哈蟆油中蛋白成分差異主要為a-激酶錨定蛋白13 類似蛋白、免疫球蛋白Fc 段連接蛋白和黏蛋白，且此3 類成分在哈蟆油中表達(dá)量較高，對哈蟆油的功能活性起到至關(guān)重要的作用。

a-激酶錨定蛋白13 類似蛋白（AKAP13-like），AKAP13 包含兩個重要的結(jié)構(gòu)域（PKA 結(jié)構(gòu)域和GEF 結(jié)構(gòu)域），在許多信號傳導(dǎo)中發(fā)揮著重要的作用，能激活GTP 酶Rho，水解GTP 為GDP。AKAP13 可將PKA、PKD、PKC 多蛋白復(fù)合物錨定于細(xì)胞骨架肌動蛋白[25-26]，在PKD 和Rho 通路中起著整合cAMP 信號的作用；AKAP13將PKD 與其上游激活因子PKC 連接，PKC 磷酸化PKD，使其激活，而PKA 磷酸化AKAP13，促進(jìn)激活的PKD 從AKAP 復(fù)合物平臺上游離出來。AKAP13 在多個器官和組織中高表達(dá)，如脾、胸腺、外周血白細(xì)胞、骨路肌和睪丸；胎盤和肺中適度表達(dá)；而在肝、腦、小腸、結(jié)腸和前列腺癌中沒有或者少量表達(dá)[27]。目前研究顯示AKAP13 通過GEF 作用，參與心肌肥大的形成[28]。邢修業(yè)[29]研究AKAP13 在小鼠卵泡發(fā)育中的作用，發(fā)現(xiàn)AKAP13 基因敲除雜合型小鼠的生殖能力降低，表明AKAP13 可能通過作用于FSHR 信號通路下游效應(yīng)分子參與并影響FSHR信號通路，進(jìn)而在小鼠卵泡發(fā)育中起至關(guān)重要的作用。免疫球蛋白Fc 段連接蛋白（IgGFc binding protein，F(xiàn)cγBP）主要在胎盤和結(jié)腸的上皮細(xì)胞表達(dá)，作為黏膜的組成部分，維持黏膜的結(jié)構(gòu)。FcγBP 類似黏蛋白，具有黏蛋白的結(jié)構(gòu)特點，同時具有免疫球蛋白連接的活性，在黏膜免疫系統(tǒng)和炎癥中具有重要的作用[30]。Kobayashi 等[31]報道FcγBP 存在于血清中，在各種自身免疫性疾病的患者中高水平表達(dá)。黏蛋白（mucin）是分布在各種管腔內(nèi)表面的高分子量糖蛋白，對上皮細(xì)胞起到重要的保護(hù)和潤滑的作用，黏蛋白中的糖鏈在維持蛋白質(zhì)的穩(wěn)定、抵抗蛋白酶水解、防止抗體識別等方面發(fā)揮重要的作用[32]。近年來，發(fā)現(xiàn)黏蛋白還參與細(xì)胞增殖的調(diào)控、受精，上皮細(xì)胞的分化、更新，調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程[33]。Mucin2、Mucin-5AC 和Mucin-5B 屬于凝膠形成型的黏蛋白，具有形成凝膠的能力，結(jié)構(gòu)中包含半胱氨酸富含區(qū)域，經(jīng)二硫鍵連接形成二聚體，因此其分子量較高不溶于水[34]。人類Mucin2（包含5179aa）有超過100 個不同寡糖修飾后形成的糖蛋白[35]，糖分子產(chǎn)生一個高度異構(gòu)的黏蛋白凝膠層，形成一個天然的防御機制，在腸道內(nèi)，帶電的糖鏈能有效地控制水分子，形成一個穩(wěn)定的環(huán)境保護(hù)半透膜[36]。Mucin-5B 主要在呼吸道黏膜腺體的黏液細(xì)胞中表達(dá)，在舌下腺高度表達(dá)，在頜下腺、子宮內(nèi)膜、膽囊和胰腺也有表達(dá)，有助于唾液和宮頸黏液的潤滑和彈性的作用。在胃和呼吸道上皮細(xì)胞中Mucin-5AC 通過結(jié)合吸入的微生物和微粒，隨后被黏液系統(tǒng)清除，來保護(hù)黏膜，防止感染和化學(xué)損傷[36]。當(dāng)卵子通過輸卵管時即被腺體所分泌的膠狀物所包裹，為卵提供豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，此類膠狀物多為黏蛋白[37]，因林蛙剛出蟄后，溫度較低、缺乏食物等為其提供營養(yǎng)物質(zhì)，輸卵管作為重要的生殖器官，分泌大量的膠狀物質(zhì)，達(dá)到保護(hù)卵子的作用。以上結(jié)果提示在哈蟆油中高表達(dá)的蛋白質(zhì)主要參與免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞骨架形成、生殖發(fā)育等過程。

哈蟆油本身具有高的膨脹度與其含有大量的、多種類型的凝膠型黏蛋白密切相關(guān)。黏蛋白凝膠的程度會受到各種因素的影響，包括黏蛋白自身分子量大小、糖基側(cè)鏈長短、聚合度和濃度以及外界因素如pH、離子強度的變化等。由于黏蛋白和免疫球蛋白Fc 段連接蛋白都包含大量的糖鏈結(jié)構(gòu)，對于哈蟆油膨脹的能力具有重要的影響。

4.3 結(jié)論

中國林蛙與黑斑蛙的生活習(xí)性不同導(dǎo)致哈蟆油與青蛙油中蛋白質(zhì)含量的差異，本研究通過比較青蛙油與哈蟆油蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫的差異，篩選到差異表達(dá)蛋白質(zhì)55 個，其中上調(diào)的蛋白質(zhì)數(shù)為40 個，下調(diào)的蛋白質(zhì)數(shù)為15 個。哈蟆油中含量較高的15 差異蛋白質(zhì)主要參與免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞骨架形成和生殖發(fā)育等過程；而青蛙油中含量較高的40 個差異蛋白質(zhì)主要參與能量代謝、糖代謝、應(yīng)激反應(yīng)、生長發(fā)育、生物合成、細(xì)胞骨架形成、氧化還原和免疫調(diào)節(jié)等過程；其中AKAP13-like、FcγBP、MUC5AC-like、MUC、MUC5B 等15 個高表達(dá)的蛋白質(zhì)可作為哈蟆油區(qū)別于青蛙油的重要蛋白質(zhì)，同時哈蟆油的特異性膨脹度可能與含量較高的黏蛋白類密切相關(guān)，本文的研究結(jié)果為進(jìn)一步研究哈蟆油的功效成分奠定基礎(chǔ)。