孫 敏，達(dá)曉偉，張悅婧，李 穎，龐海龍, 2，馮漢青, 2*

(1西北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，蘭州 730070；2西北師范大學(xué) 新農(nóng)村發(fā)展研究院，蘭州 730070)

農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、 花粉管通道法、基因槍法、微注射法、電激法、化學(xué)法(PEG、PLD、DVA)等技術(shù)廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因研究中，其中農(nóng)桿菌介導(dǎo)法使用最為廣泛[1-2]。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法的原理是將目的基因克隆到經(jīng)改造后的T-DNA上，構(gòu)建重組載體系統(tǒng)，并轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌宿主中，然后用農(nóng)桿菌侵染植物傷口，從而將攜帶目的基因的T-DNA轉(zhuǎn)入到植物細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。通過上述方法，外源基因可通過穩(wěn)定表達(dá)或瞬時表達(dá)在植物中產(chǎn)生蛋白產(chǎn)物。但穩(wěn)定轉(zhuǎn)化涉及到遺傳和篩選鑒定等，因此是需要持續(xù)幾個月到一年。相比而言，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時表達(dá)雖然使得大部分T-DNA并未整合入宿主基因組內(nèi)，但可以短時間暫存于細(xì)胞核中，從而在數(shù)天內(nèi)快速表達(dá)外源基因[3-4]。該技術(shù)具有成本效益、周期短、堅固、安全性高、高通量、轉(zhuǎn)化效率高的優(yōu)勢，可以在幾天內(nèi)觀察到實(shí)驗處理的結(jié)果，因此在分析植物中基因功能、基因啟動子和抑制子特性、轉(zhuǎn)錄因子活性、蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位和蛋白質(zhì)間相互作用[5-7]等方面具有極大的便利。

中國中草藥(Chinese herbal medicine,CHM)種植面積廣闊，生產(chǎn)量高，其大部分取根或根莖入藥，廣泛用于治療和預(yù)防各種疾病[8-11]。并且中草藥植物中的一些次生代謝物質(zhì)已被認(rèn)可用于食品、藥品、化妝品、茶或咖啡的替代品或植物膠的來源[12]。因此，對于中草藥的研究目前需要有效的基因功能的分析方法來幫助揭示中草藥代謝物產(chǎn)生、有效成分積累、生長規(guī)律和機(jī)制等。但中草藥多為多年生植物，利用穩(wěn)定轉(zhuǎn)化需要耗費(fèi)大量時間。如果利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將外源基因?qū)胫胁菟幹袑?shí)現(xiàn)瞬時表達(dá)，對于提高中草藥研究具有重要意義。

農(nóng)桿菌屬通過葉浸潤介導(dǎo)的瞬時表達(dá)的方法已廣泛用于多種植物，包括煙草、萵苣、番茄、菜豆和擬南芥等[13-16]，而中草藥適合用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時表達(dá)方法尚不清楚，其相關(guān)影響因素也無研究。基于以上原因，本研究選用兩種常見的非病毒型(載體Ⅰ)和病毒型二元載體(載體Ⅱ)[17-18]，兩種農(nóng)桿菌(EHA105和LBA4404)[19-20]，以常見的中草藥(甘草、黃芩、大黃、板藍(lán)根和黃芪)植株為材料，以報告基因GFP為表征手段[21-22]，以煙草瞬時表達(dá)為參照，以無轉(zhuǎn)化載體的農(nóng)桿菌為對照，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時表達(dá)對以上5種中草藥葉片注射侵染。通過徠卡熒光體式鏡檢測5種中草藥葉片中綠色熒光蛋白的瞬時表達(dá)情況，對未來在中藥材中瞬時表達(dá)技術(shù)的應(yīng)用奠定一定的基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗材料

本氏煙草(Nicotianabenthamiana)種子由本實(shí)驗室收集并常溫保存，甘草[23](GlycyrrhizauralensisFisch.)、黃芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)、蒙古黃芪[24][Astragalusmembranaceusvar.mongholicus(Bge.) Hsiao]、大黃(RheumofficinaleBaill.)和板藍(lán)根(IsatistinctoriaL.)購自中國河北中藥材種植有限公司，5種中草藥種子在-4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 材料處理

本氏煙草種子通過育苗盤培養(yǎng)在育苗塊上，每個育苗盤中放有10個育苗塊，加蒸餾水浸潤后點(diǎn)種，將育苗盤加蓋并置于25 ℃、50%濕度的培養(yǎng)室中，以16 h/8 h晝夜周期生長2周左右，當(dāng)幼苗長出3～4個葉片后去蓋并轉(zhuǎn)移至空間較大的托盤中，培養(yǎng)至苗齡5～6周時進(jìn)行瞬時侵染。

實(shí)驗前期取出5種中草藥種子分別進(jìn)行滅菌處理：甘草和黃芪，80%濃硫酸處理種子3 min，流水沖洗30 min，甘草浸泡6 h，黃芪浸泡12 h；黃芩于30 ℃溫水浸泡5～6 h；板藍(lán)根于30 ℃溫水浸泡10 h；大黃于1%的次氯酸鈉殺菌消毒10 min，蒸餾水沖洗3～5次。之后置于墊雙層紗布的培養(yǎng)皿中，于23 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行種子萌發(fā)：甘草和黃芪2～3 d，板藍(lán)根3～4 d，黃芩和大黃6～7 d。種子出芽2～3 cm后移栽到裝有營養(yǎng)土的小花盆中，常溫培養(yǎng)室中培養(yǎng)5～6周用于瞬時侵染。

1.3 方 法

1.3.1 細(xì)菌菌株和載體及重懸液的制備非病毒型二元載體由瓦格寧根大學(xué)Klaas Bouwmeester教授提供；病毒型二元載體由亞利桑那州立大學(xué)Hugh S. Mason教授提供。將帶有GFP的非病毒型和病毒型二元載體分別轉(zhuǎn)化2種農(nóng)桿菌(EHA105和LBA4404)菌株。將新鮮農(nóng)桿菌從-80 ℃甘油儲備中接種活化，在含50 mg·L-1卡那霉素(Kanna)、25 mg·L-1利福平(Rif)、25 mg·L-1氯霉素(Chl)的YEB瓊脂平板上劃線接種，于28 ℃下靜止生長24～48 h,挑取單菌落接種于含相同抗生素單YEB液體培養(yǎng)基中。用同樣處理無轉(zhuǎn)化載體的空菌(EHA105和LBA4404)作對照組。于28 ℃、180 r·min-1條件下?lián)u床培養(yǎng)16～19 h后，取出菌液移至4 mL離心管中，4 ℃、5 000 r·min-1離心10 min后棄上清收集菌液。配置重懸溶液(10 mmol·L-1MgSO4， 10 mmol·L-1MES-KOH，100 μmol·L-1乙酰丁香醇，dd H2O加至100 mL，pH 5.5)，清洗并重懸菌體，使重懸后的OD600為0.8，室溫放置3 h后用于葉片侵染。

1.3.2 葉片侵染及GFP的檢測選取葉片舒展、大小、長勢基本一致的5種中草藥(甘草、黃芩、大黃、板藍(lán)根、黃芪)葉片和煙草葉片，用針頭輕刺注射葉片的下表皮，將懸浮液用5 mL無菌注射器緩慢滲入葉片氣縫中，每種植株選取3～5個葉片進(jìn)行完全注射侵染，重復(fù)3次實(shí)驗。經(jīng)注射后的植株繼續(xù)在培養(yǎng)室中培養(yǎng)。注射后第2～7天用徠卡熒光體式鏡(Leica Microsystems Ltd.DFC450C)檢測煙草葉片熒光表達(dá)量及中草藥葉片熒光，即綠色熒光蛋白的表達(dá)情況并拍照記錄。

1.3.3 煙草葉片熒光的定量分析采用ImageJ軟件分析GFP在煙草葉片中綠色熒光表達(dá)圖片，所得數(shù)值至少為3次獨(dú)立實(shí)驗的平均值，實(shí)驗結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析并用Excel 2010作圖，以P<0.05表示顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 載體轉(zhuǎn)化及煙草葉片侵染

本實(shí)驗為了保證載體成功轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，從農(nóng)桿菌中提取Ti質(zhì)粒，并通過瓊脂糖凝膠電泳對2種表達(dá)載體進(jìn)行電泳檢測(圖1);農(nóng)桿菌從-80 ℃甘油儲備中劃線接種在含篩選抗生素的YEB培養(yǎng)基上，次日后長出菌落(圖2)；農(nóng)桿菌介導(dǎo)煙草葉片侵染使用無菌無針注射器來引入農(nóng)桿菌進(jìn)入煙草葉片(圖3)。首先，準(zhǔn)備材料并吸取2 mL農(nóng)桿菌重懸液(圖3，A、B),其次通過輕輕地刮擦而不刺穿兩側(cè)，在葉背面的表皮上用針刺出一個小缺口(圖3，C)。最后使用無針注射器將浸潤在培養(yǎng)基中的農(nóng)桿菌通過缺口注入葉片中。當(dāng)農(nóng)桿菌混合物進(jìn)入葉片的細(xì)胞間空間時，淺綠色開始變暗，表明已成功滲透(圖3，D)。

M.Marker; 1、2. 載體Ⅰ；3. 載體Ⅱ圖1 質(zhì)粒凝膠電泳圖M. Marker; 1, 2. CarrierⅠ; 3. The carrier ⅡFig.1 Plasmid gel electrophoresis

A、D. 無轉(zhuǎn)化載體的EHA105、LBA4404；B、E. 攜帶載體Ⅰ的EHA105、LBA4404; C、F. 攜帶載體Ⅱ的EHA105、LBA4404圖2 農(nóng)桿菌在YEB上的培養(yǎng)性狀A(yù), D. EHA105 and LBA4404 without transformation carrier; B, E. EHA105 and LBA4404 carrying carrierⅠ; C, F. EHA105 and LBA4404 carrying carrierⅡFig.2 Culture traits of Agrobacterium tumefaciens on YEB

A. 材料準(zhǔn)備：5周齡煙草、農(nóng)桿菌重懸液、無菌注射器；B. 無菌注射器吸取2 mL農(nóng)桿菌重懸液；C. 針頭輕刺煙草葉片背面；D.通過缺口將菌液注射到葉片間隙中圖3 農(nóng)桿菌對煙草葉片的注射器浸潤A. Preparation materials: 5-week-old tobacco, Agrobacterium resuspension, sterile syringes; B. Draw 2 mL Agrobacterium resuspension from sterile syringe; C. Gently prick the back of the tobacco leaf with the needle; D. Inject bacterial fluid into the leaf space through the gapFig.3 Agrobacterium tumefaciens infiltration in syringes on tobacco leaves

煙草是外源基因瞬時表達(dá)的首選植物，目前已在多個方面優(yōu)化條件，以提高蛋白質(zhì)的表達(dá)量。將帶有GFP的2種農(nóng)桿菌(EHA105和LBA4404)菌株侵染煙草葉片，在OD600為0.8，侵染2～4 d后，結(jié)果顯示：煙草葉片中均能瞬時表達(dá)GFP(圖4)。與無熒光表達(dá)的對照組相比，攜帶載體Ⅱ的LBA4404菌株GFP熒光表達(dá)量很高，瞬時轉(zhuǎn)化效率最高；攜帶載體 Ⅰ的EHA105菌株熒光表達(dá)量高，轉(zhuǎn)化效率好；含載體Ⅱ的EHA105菌株和含載體Ⅰ的LBA4404菌株熒光蛋白表達(dá)相近，并且含載體Ⅰ的LBA4404菌株瞬時轉(zhuǎn)化效率最低(圖4，表1)。進(jìn)一步證明了2種農(nóng)桿菌在煙草葉片中成功瞬時表達(dá)綠色熒光蛋白，為在中草藥葉片中能否瞬時表達(dá)GFP奠定基礎(chǔ)。

A. 比例尺=2 mm Scale =2 mm圖4 農(nóng)桿菌介導(dǎo)煙草葉片GFP熒光表達(dá)Fig.4 GFP fluorescence expression in tobacco leaves mediated by Agrobacterium tumefaciens

表1 不同菌株及載體在煙草葉片中GFP熒光表達(dá)量

2.2 攜帶兩種常見二元載體的農(nóng)桿菌EHA105和LBA4404介導(dǎo)5種中草藥葉片的瞬時表達(dá)

分別用載體Ⅰ和載體Ⅱ轉(zhuǎn)化的EHA105菌液侵染5種中草藥葉片。結(jié)果如圖5、表2所示，相比對照組，攜帶載體Ⅰ的EHA105菌株在中草藥植株中轉(zhuǎn)化效率更高，其中在甘草葉片中熒光強(qiáng)度最高，大黃葉片中較高，黃芩、黃芪和板藍(lán)根中很低，且黃芪只在傷口處檢測到熒光，并未向四周擴(kuò)散表達(dá)。攜帶載體Ⅱ的EHA105菌株僅在甘草葉片的注射孔處瞬時表達(dá)熒光蛋白，其他4種中草藥中未檢測到綠色熒光，即GFP未表達(dá)。

0-EHA105.無轉(zhuǎn)化載體的EHA105；Ⅰ-EHA105. 攜帶載體Ⅰ的 EHA105; Ⅱ-EHA105. 攜帶載體Ⅱ的EHA105; 標(biāo)尺=2 mm圖5 農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)5種中草藥葉片GFP熒光表達(dá)0-EHA105. EHA105 without transformation vector; Ⅰ-EHA105. EHA105 carrying vector Ⅰ; Ⅱ-EHA105. EHA105 carrying vector Ⅱ; Scale = 2 mmFig.5 Agrobacterium tumefaciens EHA105 mediated GFP fluorescence expression in the leaves of five Chinese herbal medicines

表2 不同菌株及載體在5種中草藥葉片中的GFP熒光表達(dá)量

如圖6、表2所示，與對照組相比，LBA4404菌株在甘草葉片的傷口處及周圍表達(dá)GFP，并沒有EHA105菌株轉(zhuǎn)化效率高；攜帶載體Ⅱ的LBA4404在煙草葉片中瞬時蛋白表達(dá)量很高，同樣，在黃芩葉片中GFP有很高的蛋白表達(dá)量。相反，攜帶載體Ⅰ的LBA4404菌株在黃芩葉片中未檢測到綠色熒光。黃芪葉片中檢測出弱熒光，GFP熒光表達(dá)量較低；LBA4404菌液侵染的大黃和板藍(lán)根葉片中幾乎無綠色熒光。

0-LBA4404.無轉(zhuǎn)化載體的LBA4404; Ⅰ-LBA4404. 攜帶載體Ⅰ的 LBA4404;Ⅱ-LBA4404. 攜帶載體Ⅱ的 LBA4404; 比例尺=2 mm圖6 農(nóng)桿菌LBA4404介導(dǎo)5種中草藥葉片GFP熒光表達(dá)0-LBA4404. LBA4404 without transformation vector;Ⅰ-LBA4404. LBA4404 carrying vector Ⅰ; Ⅱ-LBA4404. LBA4404 carrying vector Ⅱ; Scale =2 mmFig.6 Agrobacterium tumefaciens LBA4404 mediated GFP fluorescence expression in the leaves of five Chinese herbs

3 討 論

植物瞬時表達(dá)是一種可以在短時間內(nèi)高效表達(dá)目標(biāo)基因的技術(shù)，這是一種檢測靶基因功能的簡單、快速、有效的方法。對于難以發(fā)展遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的物種，瞬時表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建具有重要意義[25]。研究表明，重組質(zhì)粒進(jìn)入植物細(xì)胞后，目標(biāo)基因可以在12 h內(nèi)表達(dá)，并且會在2～4 d內(nèi)表達(dá)水平達(dá)到峰值[26]。也有報道GFP在植物組織中連續(xù)表達(dá)3 d到達(dá)峰值，明顯表達(dá)需要至少1周[20]。劉文浩等[21]發(fā)現(xiàn)，菌液濃度OD600為0.4左右，侵染48 h后，煙草葉片中外源蛋白的表達(dá)效率最高。Zhang等[27]發(fā)現(xiàn)農(nóng)桿菌浸潤溶液OD600為0.5，擬南芥葉片共培養(yǎng)3～4 d明顯瞬時表達(dá)GFP。而本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌懸液OD600為0.8，農(nóng)桿菌侵染煙草葉片2～3 dGFP瞬時轉(zhuǎn)化率均高，而中草藥葉片中需要侵染5～7 d，才能檢測到高水平表達(dá)的綠色熒光蛋白，特別是甘草和黃芩葉片。這表明不同的植物、菌液濃度和侵染時間對農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因瞬時表達(dá)的敏感性表現(xiàn)出很大的差異性[28]。因此，需要根據(jù)實(shí)驗條件、預(yù)期結(jié)果和所用材料進(jìn)行條件優(yōu)化，從而提高瞬時轉(zhuǎn)化效率。

農(nóng)桿菌通過涉及農(nóng)桿菌Vir蛋白和宿主蛋白的T-DNA傳輸機(jī)制將位于Ti質(zhì)粒左邊界(LB)和右邊界(RB)之間的基因傳遞到植物組織中，因此瞬時轉(zhuǎn)化的效率受多種因素影響，例如：共培養(yǎng)條件、農(nóng)桿菌品系、二元載體類型、寄主植物種類、外植體來源、組織培養(yǎng)基等[25]。主要表現(xiàn)為不同的農(nóng)桿菌對植物親和力及感染力的差異性。Andrieu等[29]發(fā)現(xiàn)EHA105菌株在水稻葉片中的瞬時表達(dá)效果優(yōu)于LBA4404。本研究結(jié)果顯示，整體而言EHA105菌株對中草藥葉片感染效果優(yōu)于LBA4404，攜帶非病毒型載體的EHA105在甘草和大黃葉片中實(shí)現(xiàn)了綠色熒光蛋白的瞬時表達(dá)，而黃芪、板藍(lán)根葉片中熒光強(qiáng)度較低或幾乎無GFP表達(dá)。此外，據(jù)報道EHA105和LBA4404菌株感染豆類具有高表達(dá)效率[13,30]，Withania somnifera等[4]發(fā)現(xiàn)LBA4404菌株具有最高的感染效果，本實(shí)驗中攜帶病毒載體的LBA4404菌株在黃芩葉片中實(shí)現(xiàn)GFP高水平的瞬時表達(dá)，甘草葉片在注射孔及周圍檢測到較高的熒光強(qiáng)度。這進(jìn)一步說明農(nóng)桿菌菌株的遺傳背景和修飾的Ti質(zhì)粒組合明顯影響細(xì)菌宿主范圍和各種植物物種的轉(zhuǎn)化效率。本研究在中草藥葉片中成功建立瞬時表達(dá)體系，為后期在中藥材中分析功能基因、抗體、疫苗和大規(guī)模生產(chǎn)藥用蛋白提供了理論依據(jù)。

與中草藥中無轉(zhuǎn)化載體的菌株及煙草瞬時表達(dá)相比，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的中草藥葉片的瞬時表達(dá)效率較低，依據(jù)農(nóng)桿菌與植物先天免疫反應(yīng)[31-32]，本研究推測一方面中草藥對農(nóng)桿菌的先天免疫應(yīng)答更為敏感，表現(xiàn)為對外源基因的表達(dá)具有抗性，甚至有抑菌現(xiàn)象。雖然目前還不清楚具體原因，但已有研究數(shù)據(jù)表明，一些植物激素和酸誘導(dǎo)性基因在某些植物體內(nèi)對農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化具有抵抗力，特別是植物激素的平衡會影響農(nóng)桿菌的瞬時轉(zhuǎn)化效率，表現(xiàn)為促進(jìn)或抑制基因的表達(dá)、細(xì)菌的生長，進(jìn)而來影響農(nóng)桿菌的感染過程[28]。另一方面從表型上更加直觀地推測，瞬時轉(zhuǎn)化效率受葉片面積、葉脈、苗齡和葉片厚度等影響，5～6周齡煙草葉片大且容易注射侵染，而侵染4 d后在農(nóng)桿菌浸潤區(qū)域葉片出現(xiàn)萎黃、變軟變爛現(xiàn)象，潛在機(jī)制尚未得到很好地解釋，可能與葉脈少、葉片薄及葉綠體對農(nóng)桿菌的防御反應(yīng)有關(guān)。然而5～6周齡中草藥葉片難以注射菌液，這可能是由于葉片面積小，葉脈多及狹窄的細(xì)胞間隙使菌液難以滲入，并且成熟葉片表面存在厚厚的角質(zhì)層和蠟涂層所致[5,33]。因此，在小葉片上出現(xiàn)2～3處傷口，后續(xù)研究可考慮真空滲透[34]。此外，由于5種中草藥葉片面積不同及出現(xiàn)了僅在注射孔處檢測到的熒光強(qiáng)度反而高于整個葉片的熒光蛋白表達(dá)情況，因而本研究以煙草為參照對中草藥葉片中GFP的熒光表達(dá)量進(jìn)行定性分析，后續(xù)研究有待進(jìn)一步定量分析并提高中草藥葉片中外源基因瞬時轉(zhuǎn)化效率。

中草藥植物大部分取根入藥，其葉等地上器官通常被遺棄，然而研究證明，許多藥用植物地上部分也具有多種有效活性成分[35-36]。因此，以中草藥葉片為生物反應(yīng)器，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時表達(dá)技術(shù)，將外源基因瞬時且高水平表達(dá)，提高了藥用植物葉片等地上部分的利用效率。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時轉(zhuǎn)化成為研究植物基因的最佳選擇，尤其在2021年國家進(jìn)一步鼓勵農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物原始創(chuàng)新的背景下，以農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時轉(zhuǎn)化有望作為中草藥品種創(chuàng)新的有力工具，為國家的中藥材事業(yè)發(fā)展提供支撐。