張 蒙，劉 敏，李夢(mèng)倩，李 萍，周 蓉，蔣芳玲，吳 震

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，農(nóng)業(yè)部華東地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210095)

大蒜(AlliumsativumL.)為藥食兼用的一、二年生草本植物，是中國(guó)在國(guó)際市場(chǎng)上有較強(qiáng)競(jìng)爭(zhēng)力的出口蔬菜之一，具有重要的經(jīng)濟(jì)和藥用價(jià)值[1]。由于育性退化，大蒜主要靠鱗莖進(jìn)行無(wú)性繁殖，導(dǎo)致病毒積累和種性退化嚴(yán)重，影響了其遺傳改良和種質(zhì)創(chuàng)新[2-3]。利用常規(guī)組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行脫毒快繁，有助于恢復(fù)大蒜種性，但仍存在繁殖系數(shù)低、玻璃化嚴(yán)重、變異率高、生根困難、試管苗質(zhì)量差和老化嚴(yán)重等問(wèn)題[4]。

體細(xì)胞胚發(fā)生是植物界的普遍現(xiàn)象，是植物細(xì)胞全能性的重要體現(xiàn)，為植物離體快繁開(kāi)創(chuàng)了新的途徑[5-6]。體細(xì)胞胚發(fā)生途徑具有發(fā)生速度快、繁殖系數(shù)高、遺傳穩(wěn)定性強(qiáng)和再生個(gè)體整齊性好等優(yōu)點(diǎn)[7-8]。雖然大蒜體細(xì)胞胚發(fā)生早有報(bào)道，但主要集中在培養(yǎng)條件的優(yōu)化、形態(tài)解剖特征觀察及生理生化分析等方面[9-11]。激素是影響大蒜體細(xì)胞胚發(fā)生的重要調(diào)控物質(zhì)，但體細(xì)胞胚發(fā)生不同階段不同種類激素的變化特征還缺少系統(tǒng)研究，相關(guān)分子調(diào)控特點(diǎn)尚未見(jiàn)報(bào)道，阻礙了大蒜體細(xì)胞胚發(fā)生體系的完善，影響了該體系優(yōu)勢(shì)的發(fā)揮和規(guī)模化生產(chǎn)。因此，明確大蒜體細(xì)胞胚發(fā)生過(guò)程中的內(nèi)源激素變化及相關(guān)基因表達(dá)特征，不僅有助于進(jìn)一步明確大蒜體細(xì)胞胚發(fā)生的機(jī)理，更為大蒜種質(zhì)資源創(chuàng)新、基因遺傳轉(zhuǎn)化和人工種子的制備奠定基礎(chǔ)，還可為解決大蒜種性退化和新品種選育開(kāi)辟途徑。

植物體細(xì)胞胚發(fā)生受多種因素影響，是植物體內(nèi)外不同因素綜合作用的結(jié)果，其中植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑(PGRs)起決定性作用[12-13]。研究表明，外源PGRs在植物體細(xì)胞胚發(fā)生過(guò)程中的不同階段均有十分重要的調(diào)控作用[14-15]，且外源PGRs必須通過(guò)內(nèi)源激素才能發(fā)揮作用[16]，而內(nèi)源生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素(CTK)和脫落酸(ABA)水平的時(shí)空變化是調(diào)控體細(xì)胞胚發(fā)生的重要信號(hào)之一[17]。目前，關(guān)于玉米[18]、茶樹(shù)[19]、櫟樹(shù)[20]、橡膠[21]等經(jīng)濟(jì)植物和姜黃[22]、半夏[23]、北五味子[24]、枇杷[25]等藥用植物體細(xì)胞胚發(fā)生過(guò)程中內(nèi)源激素的研究已有報(bào)道。相關(guān)研究結(jié)果因物種而異，高水平的內(nèi)源IAA能夠促進(jìn)荔枝和龍眼胚性愈傷組織和球形胚的形成，但過(guò)高的內(nèi)源IAA會(huì)抑制北五味子體細(xì)胞胚的形成[26-27]。也有研究表明，低水平的內(nèi)源ABA有助于姜黃胚性愈傷組織的形成，而石刁柏中內(nèi)源ABA水平在胚性愈傷組織階段達(dá)到最高值[28]。關(guān)于內(nèi)源激素對(duì)大蒜體細(xì)胞胚發(fā)生調(diào)控的研究尚無(wú)報(bào)道，目前多是參考前人和其他植物的研究結(jié)果來(lái)利用外源PGRs調(diào)控大蒜體細(xì)胞胚的發(fā)生。

體細(xì)胞胚發(fā)生是由激素代謝和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)介導(dǎo)的高度復(fù)雜的分子系統(tǒng)，特別是生長(zhǎng)素、CTK和ABA及其激素依賴性基因的表達(dá)。為了揭示植物體細(xì)胞胚發(fā)生的機(jī)理，人們開(kāi)始研究體細(xì)胞胚發(fā)生過(guò)程中關(guān)鍵基因和激素信號(hào)通路相關(guān)基因的作用。關(guān)于植物體細(xì)胞胚發(fā)生分子調(diào)控的研究主要集中在擬南芥[29]和煙草[30]等模式植物中，部分報(bào)道涉及大豆[31]、落葉松[32]、棉花[33]、百合[34]、龍眼[35]等，關(guān)于大蒜體細(xì)胞胚發(fā)生過(guò)程中的分子調(diào)控特點(diǎn)還未見(jiàn)報(bào)道。

本研究以大蒜品種‘二水早’為材料，選擇體細(xì)胞胚發(fā)生過(guò)程中的外植體(花序軸，EX)、愈傷組織(CA)、早期胚性愈傷組織(PC)、后期胚性愈傷組織(LC)與球形胚(GE)5個(gè)階段，分析不同階段培養(yǎng)物的5種生長(zhǎng)素及其類似物、4種CTK和ABA含量，以及不同階段激素合成和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量的變化特征，以期從內(nèi)源激素變化的角度解析大蒜體細(xì)胞胚的發(fā)生機(jī)制，為建立大蒜體細(xì)胞胚高效發(fā)生體系提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 植物材料

供試植物材料為大蒜品種‘二水早’，以花序軸為外植體。將花序軸接種在B5+ 3.0 mg·L-12,4-D + 0.5 mg·L-1KT + 0.7%瓊脂 + 3%蔗糖，pH 5.8的培養(yǎng)基中，在(25±1) ℃下暗培養(yǎng)。根據(jù)前人研究結(jié)果[9-11]，對(duì)大蒜體細(xì)胞胚發(fā)生過(guò)程中的形態(tài)變化進(jìn)行觀察，確定大蒜體細(xì)胞胚發(fā)生不同階段研究材料，分別選取大蒜體細(xì)胞胚發(fā)生的外植體(花序軸)、愈傷組織、早期胚性愈傷組織、后期胚性愈傷組織和球形胚5個(gè)階段的材料，經(jīng)液氮固定后于-80 ℃保存，用于后續(xù)內(nèi)源激素和相關(guān)基因表達(dá)量的檢測(cè)。

1.2 內(nèi)源激素及類似物含量的測(cè)定

采用高效液相色譜(Shim-pack UFLC SHIMADZU CBM30A，日本)和串聯(lián)質(zhì)譜(Applied Biosystems 6500 Quadrupole Trap，美國(guó))法進(jìn)行3類激素及類似物含量的測(cè)定，包括5種生長(zhǎng)素及其類似物吲哚-3-乙酸(IAA)、吲哚-3-乙酸甲酯(ME-IAA)、吲哚-3-丁酸(IBA)、吲哚-3-甲醛(ICAld)和吲哚-3-甲酸(ICA)，4種細(xì)胞分裂素異戊烯腺嘌呤(IP)、順式玉米素(cZ)、反式玉米素(tZ)和二氫玉米素(DZ)以及脫落酸(ABA)。

1.2.1 樣品提取取上述待測(cè)材料研磨至粉狀，稱取50 mg研磨后的樣品，加入適量?jī)?nèi)標(biāo)，用甲醇∶水∶甲酸=15∶4∶1(V∶V∶V)進(jìn)行提取，提取液濃縮后用100 μL 80%甲醇-水溶液復(fù)溶，過(guò)0.22 μm PTFE濾膜，置于進(jìn)樣瓶中，用于后續(xù)分析[36]。

1.2.2 色譜質(zhì)譜的采集條件色譜條件主要包括：(1)色譜柱：Waters公司的ACQUITY UPLC HSS T3 C18柱(1.8 μm, 2.1 mm* 100 mm)。(2)流動(dòng)相：水相為超純水(加入0.05%甲酸)，有機(jī)相為乙腈(加入0.05%甲酸)。(3)洗脫梯度：0～1 min水/乙腈(95∶5，V/V)，8～9 min水/乙腈(5∶95，V/V)，9.1～12 min水/乙腈(95∶5，V/V)。(4)流速0.35 mL·min-1，柱溫為40 ℃，進(jìn)樣量2 μL[37]。質(zhì)譜條件主要包括：(1)離子源操作參數(shù)：電噴霧離子源(ESI)溫度為500 ℃，質(zhì)譜電壓為4 500 V，簾氣(CUR)設(shè)置為35 psi，碰撞誘導(dǎo)電離(CAD)參數(shù)設(shè)置為中等(medium)。(2)特征離子對(duì)的獲得：在串聯(lián)質(zhì)譜儀中，根據(jù)優(yōu)化的去簇電壓(DP)和碰撞能(CE)進(jìn)行掃描檢測(cè)得到[38-39]。

1.2.3 激素的定性與定量利用植物激素標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建植物激素?cái)?shù)據(jù)庫(kù)，并基于植物激素?cái)?shù)據(jù)庫(kù)對(duì)質(zhì)譜檢測(cè)的數(shù)據(jù)進(jìn)行定性分析，利用多反應(yīng)檢測(cè)模式(MRM)進(jìn)行激素定量分析。獲得不同樣本的質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)后，對(duì)所有目標(biāo)物的色譜峰進(jìn)行積分，通過(guò)內(nèi)標(biāo)法獲得目標(biāo)激素的相對(duì)含量。

1.3 激素相關(guān)基因表達(dá)分析

使用Trizol試劑(Invitrogen，美國(guó))提取總RNA后，取質(zhì)量良好的1 μg RNA樣品用于第一鏈的cDNA的合成。反轉(zhuǎn)錄使用5× All-In-One RT MasterMix 試劑盒(abm，中國(guó)鎮(zhèn)江)，混勻后在PCR 儀(Mastercycler?ep realplex，德國(guó))上進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄的PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為：25 ℃ 10 min，42 ℃ 15 min，85 ℃ 5 min，得到的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA置于-20 ℃保存?zhèn)溆?。利用qRT-PCR檢測(cè)大蒜體細(xì)胞胚發(fā)生過(guò)程中生長(zhǎng)素、CTK和ABA合成和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因的表達(dá)量，引物序列見(jiàn)表1。

表1 大蒜激素相關(guān)基因的引物序列

按照TOROIVD qRT Master Mix試劑盒操作說(shuō)明，在QuantStudio 3型實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems，美國(guó))上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)?？偡磻?yīng)體系為10 μL：5 μL SYBR?Green qPCR Master Mix，0.4 μL上游引物，0.4 μL下游引物，cDNA 1 μL，3.2 μL ddH2O。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性60 s，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。以AsACTIN為內(nèi)參基因，運(yùn)用2-ΔΔCt法計(jì)算各個(gè)基因的表達(dá)量，并計(jì)算其平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。每個(gè)發(fā)育階段取3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)生物學(xué)重復(fù)進(jìn)行3次技術(shù)性重復(fù)，以花序軸基因平均表達(dá)量為對(duì)照。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2007和IBM SPSS Statistics 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析，用Duncan新復(fù)極差法檢驗(yàn)不同發(fā)育階段之間的差異顯著性(P<0.05)，使用 Graphpad prism 8.0軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 大蒜體細(xì)胞胚發(fā)生不同階段內(nèi)源激素及類似物含量的動(dòng)態(tài)變化

2.1.1 內(nèi)源生長(zhǎng)素及其類似物含量動(dòng)態(tài)變化大蒜體細(xì)胞胚發(fā)生的5個(gè)階段均未檢測(cè)到吲哚-3-甲酸(ICA)，其余4種內(nèi)源生長(zhǎng)素及其類似物含量和總含量的動(dòng)態(tài)變化見(jiàn)圖1。隨著大蒜體細(xì)胞胚的發(fā)生進(jìn)程，內(nèi)源生長(zhǎng)素的總含量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，并在PC階段達(dá)到最高值，在LC階段次之，且兩者顯著高于EX階段；總含量在GE階段降至最低值，且GE和CA階段均與EX階段無(wú)顯著差異(圖1，A)。4種不同內(nèi)源生長(zhǎng)素及其類似物含量在各階段的變化趨勢(shì)與生長(zhǎng)素總含量基本一致，但含量值存在差異。其中，內(nèi)源吲哚-3-乙酸(IAA)含量在PC階段達(dá)到最高值(21.73 ng·g-1)，在LC階段次之，且兩者顯著高于其余階段；其余階段間無(wú)顯著差異，并在GE階段降至最低值(1.54 ng·g-1)(圖1，B)；而內(nèi)源吲哚-3-乙酸甲酯(ME-IAA)含量也在PC階段最高(23.97 ng·g-1)，分別約為EX、CA、LC和GE階段的15、11、13和19倍，但這4個(gè)階段之間差異不顯著(圖1，C)；與EX階段相比，吲哚-3-甲醛(ICAld)含量在CA和PC階段顯著升高，在PC階段達(dá)到最大值(6.33 ng·g-1)，隨后顯著下降，并稍低于EX階段(圖1，D)；吲哚-3-丁酸(IBA)在EX和GE階段中均未檢測(cè)到，其含量在PC階段達(dá)到最大值(0.91 ng·g-1)，在LC階段顯著下降(圖1，E)?？梢?jiàn)，在大蒜體細(xì)胞胚發(fā)生過(guò)程中，4種內(nèi)源生長(zhǎng)素及其類似物均在早期胚性愈傷組織階段達(dá)到最高值，在愈傷組織和早期胚性愈傷組織階段有大量的內(nèi)源ICAld和IBA的積累，而在球形胚階段4種內(nèi)源生長(zhǎng)素及其類似物含量均降至最低值。由此推測(cè)，大蒜早期胚性愈傷組織的形成需要較多的內(nèi)源生長(zhǎng)素，且內(nèi)源IAA和ME-IAA可能起主要作用；較高的內(nèi)源ICAld和IBA有助于大蒜愈傷組織和早期胚性愈傷組織的形成，但過(guò)高水平的內(nèi)源生長(zhǎng)素不利于大蒜球形胚的形成。

EX.外植體(花序軸);CA.愈傷組織;PC.早期胚性愈傷組織;LC.后期胚性愈傷組織;GE.球形胚；不同小寫字母表示發(fā)育時(shí)期間在0.05水平差異顯著(P<0.05)，下同圖1 大蒜體細(xì)胞胚發(fā)生過(guò)程中內(nèi)源生長(zhǎng)素及其類似物含量的變化EX. Explant (inflorescence axis); CA. Callus; PC. Primary embryogenic callus; LC. Late embryonic callus; GE. Globular embryo; Different lowercase letters indicate significant difference among development stages at 0.05 level (P<0.05), the same as belowFig.1 Changes in the contents of auxin and its analogs during garlic somatic embryogenesis

2.1.2 內(nèi)源細(xì)胞分裂素含量的動(dòng)態(tài)變化在大蒜體細(xì)胞胚發(fā)生的5個(gè)階段均未檢測(cè)到的二氫玉米素(DZ)，其余3種CTK含量和總含量在大蒜體細(xì)胞發(fā)生過(guò)程中的變化見(jiàn)圖2。其中，在大蒜體細(xì)胞胚發(fā)生的5個(gè)階段，總CTK和內(nèi)源反式玉米素(tZ)、異戊烯腺嘌呤(IP)的含量均在EX階段最高，并與其余階段差異顯著，然后從CA階段降低至GE階段，且4個(gè)階段間均無(wú)顯著差異；而順式玉米素(cZ)在CA和PC階段含量較高，在EX和LC階段較低，在GE階段降至最低。由此推測(cè)，反式玉米素和異戊烯腺嘌呤含量的降低可能有利于大蒜愈傷組織的形成，而較高水平的順式玉米素則有利于大蒜愈傷組織和早期胚性愈傷組織的形成；總CTK含量的降低，可能是大蒜體細(xì)胞胚發(fā)生所必需的。

圖2 大蒜體細(xì)胞胚發(fā)生過(guò)程中內(nèi)源細(xì)胞分裂素含量的變化Fig.2 Changes in endogenous cytokinin content during garlic somatic embryogenesis

2.1.3 內(nèi)源脫落酸含量動(dòng)態(tài)變化圖3，A顯示，在大蒜體細(xì)胞胚發(fā)生的5個(gè)階段，其內(nèi)源ABA含量在EX階段最高，達(dá)到了51.3 ng·g-1，是其他階段的4～138倍；隨著大蒜體細(xì)胞胚的形成，ABA含量在CA階段顯著降低，并持續(xù)到GE階段，但這4個(gè)階段之間無(wú)顯著差異。由此推測(cè)，低水平的ABA可能有利于大蒜體細(xì)胞胚的發(fā)生。

2.1.4 3類內(nèi)源激素含量動(dòng)態(tài)變化比較及其比值分析大蒜體細(xì)胞胚發(fā)生過(guò)程中，比較3類內(nèi)源激素含量發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源生長(zhǎng)素及其類似物的含量普遍比3種CTK的含量高(圖1-3，A)。在4種內(nèi)源生長(zhǎng)素及其類似物中，內(nèi)源IAA和ME-IAA含量比內(nèi)源ICAld和IBA含量高，內(nèi)源IAA和ME-IAA最高值分別約為ICAld和IBA最高值的3～4和21～24倍；在同一時(shí)期生長(zhǎng)素及其類似物含量的比較中發(fā)現(xiàn)，在EX、LC和GE階段以IAA含量最高，在CA階段以ICAld含量最高，在PC階段以ME-IAA含量最高，IAA含量次之。在3種CTK中，tZ含量最高，約為cZ和IP含量的3～5倍；在同一時(shí)期3種CTK含量的比較中發(fā)現(xiàn)，tZ含量在EX、CA、LC和GE階段最高，cZ含量在PC階段最高。內(nèi)源ABA含量在EX階段高達(dá)51.3 ng·g-1，僅低于PC階段的總生長(zhǎng)素含量。

另外，比較3類內(nèi)源激素含量變化趨勢(shì)發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源生長(zhǎng)素及其類似物的含量變化趨勢(shì)與3種CTK和ABA含量的變化趨勢(shì)不同，而tZ、IP和ABA含量的變化趨勢(shì)基本一致。為了進(jìn)一步探討3類激素總含量的變化趨勢(shì)與大蒜體細(xì)胞胚發(fā)生之間的關(guān)系，我們進(jìn)行了各個(gè)階段內(nèi)源激素總含量的比值分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在大蒜體細(xì)胞胚發(fā)生過(guò)程中，ABA/AUXIN比值隨著大蒜體細(xì)胞胚的形成顯著降低，在PC和GE階段比值較低；ABA/CTK比值在CA階段顯著下降，在PC階段迅速回升，隨后在GE階段又顯著下降；ABA/(AUXIN+CTK)比值在EX階段最高，LC階段次之，在GE階段降至最低值(圖3，B-D)。由此推測(cè)，較低的ABA/CTK和ABA/(AUXIN+CTK)比值有助于大蒜愈傷組織和球形胚的形成，較低的ABA/AUXIN和較高的ABA/CTK比值有助于大蒜早期胚性愈傷組織的形成，而較高ABA/(AUXIN+CTK)有助于大蒜后期胚性愈傷組織的形成，這3種激素之間含量的動(dòng)態(tài)變化調(diào)控了大蒜體細(xì)胞胚的發(fā)生。

圖3 大蒜體細(xì)胞胚發(fā)生過(guò)程中內(nèi)源ABA含量和各激素之間比值的變化趨勢(shì)Fig.3 Changes in endogenous ABA content and mass ratios of various hormones during garlic somatic embryogenesis

2.2 大蒜體細(xì)胞胚發(fā)生不同階段內(nèi)源激素相關(guān)基因表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化

2.2.1 生長(zhǎng)素合成和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因的表達(dá)分析在大蒜體細(xì)胞胚發(fā)生過(guò)程中，IAA合成相關(guān)基因AsYUCCA1和AsTA1的表達(dá)量在PC階段達(dá)到峰值，與內(nèi)源IAA含量變化趨勢(shì)基本一致(圖4，A、B)；生長(zhǎng)素應(yīng)答基因AsTIR1表達(dá)量在GE階段達(dá)到最高值，生長(zhǎng)素結(jié)合蛋白基因AsABP1表達(dá)量在CA階段最高(圖4，C、D)；內(nèi)源IAA運(yùn)輸相關(guān)基因AsABCB1、AsAUX1和AsAUX2表達(dá)量呈現(xiàn)出不同的趨勢(shì)，生長(zhǎng)素外運(yùn)載體基因AsABCB1在PC階段達(dá)到最高值，顯著高于其他階段，而生長(zhǎng)素內(nèi)運(yùn)載體基因AsAUX1在LC階段達(dá)到最高值，AsAUX2在GE階段達(dá)到高值(圖4，E-G)；生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因AsARF1和AsARF2隨著大蒜體細(xì)胞胚的發(fā)生逐漸升高，在PC階段達(dá)到最高值，隨后又顯著降低(圖4，H、I)；AsIAA1基因表達(dá)量在大蒜體細(xì)胞胚發(fā)生的過(guò)程中呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，在LC階段達(dá)到最高值(圖4，J)；AsAUX22D和AsSAUR1基因表達(dá)量在LC階段升至最高值，且均在GE階段維持高表達(dá)(圖4，K、L)。

圖4 大蒜體細(xì)胞胚發(fā)生過(guò)程中生長(zhǎng)素合成和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量變化Fig.4 Changes in the relative expression of genes related to auxin synthesis and signal transduction during garlic somatic embryogenesis

2.2.2 細(xì)胞分裂素合成和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因的表達(dá)分析IP合成相關(guān)基因AsIPT1表達(dá)量在大蒜體細(xì)胞胚發(fā)生后4個(gè)階段顯著低于EX階段，且這4個(gè)階段之間無(wú)顯著性差異，這與IP含量在大蒜體細(xì)胞胚發(fā)生過(guò)程中的變化趨勢(shì)一致(圖5，A)?；駻sKNOX1表達(dá)量在后4個(gè)階段顯著低于EX階段，在PC和CA階段表達(dá)量較高，隨后顯著降低(圖5，B)。cZ合成相關(guān)基因AsLOG1的表達(dá)量在CA階段最高，在PC階段顯著降低(圖5，C)。細(xì)胞分裂素運(yùn)輸相關(guān)基因AsENT1和AsENT2在大蒜體細(xì)胞胚發(fā)生過(guò)程中變化趨勢(shì)不同，AsENT1在體細(xì)胞胚發(fā)生各階段的表達(dá)量無(wú)顯著差異，而AsENT2隨著體細(xì)胞胚的形成而先升高后降低，在PC階段達(dá)到最高值(圖5，D、E)。細(xì)胞分裂素受體基因AsHK1表達(dá)量在PC、LC和GE階段顯著高于EX和CA階段；AsHK2在后4個(gè)階段維持高水平表達(dá)，在LC階段達(dá)到最高值，顯著高于GE階段(圖5，F(xiàn)、G)。隨著大蒜體細(xì)胞胚的發(fā)生，CTK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因AsORR-A1和AsORR-A2表達(dá)量均呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢(shì)，在PC階段達(dá)到峰值，隨后顯著降低；AsORR-B1表達(dá)量從CA階段顯著升高，在PC階段達(dá)到最高值，而AsORR-B2表達(dá)量在各階段之間無(wú)顯著差異(圖5，H-K)。

圖5 大蒜體細(xì)胞胚發(fā)生過(guò)程中細(xì)胞分裂素合成和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量變化Fig.5 Changes in relative expression levels of genes related to cytokine synthesis and signal transduction during garlic somatic embryogenesis

2.2.3 脫落酸合成和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因的表達(dá)分析隨著大蒜體細(xì)胞胚的發(fā)生，ABA合成相關(guān)基因AsZEP1的表達(dá)量先升高后降低，在LC階段達(dá)到最大值(圖6，A)。ABA合成限速酶基因AsNCED1和AsNCED2在后4個(gè)階段的表達(dá)量顯著低于EX階段，其中AsNCED1在LC階段略有回升，而AsNCED2表達(dá)量從PC階段降低至GE階段(圖6，B、C)。轉(zhuǎn)錄因子基因AsHDG表達(dá)量在PC階段達(dá)到峰值，顯著高于其他階段(圖6，D)。ABA受體基因AsPYL1表達(dá)量在GE階段達(dá)到最高值，顯著高于其他階段，而AsPYL2的表達(dá)量也在GE階段達(dá)到最大值，并顯著高于EX和CA階段(圖6，E、F)。PYL下游基因AsPP2C表達(dá)量隨著大蒜體細(xì)胞胚的發(fā)生呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，在PC階段達(dá)到最高值，在GE階段降到最低值(圖6，G)。ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因AsSnRK2表達(dá)量在大蒜體細(xì)胞胚發(fā)生的各個(gè)階段無(wú)顯著差異(圖6，H)。ABFs轉(zhuǎn)錄因子家族中的AsABI1基因表達(dá)量在LC階段達(dá)到最高值，顯著高于其他階段(圖6，I)。

圖6 大蒜體細(xì)胞胚發(fā)生過(guò)程中脫落酸合成和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量變化Fig.6 Changes in the relative expression of genes related to abscisic acid synthesis and signal transduction during garlic somatic embryogenesis

3 討 論

3.1 大蒜體細(xì)胞胚發(fā)生不同發(fā)育階段主要內(nèi)源激素含量的變化規(guī)律

植物體細(xì)胞胚發(fā)生過(guò)程中的內(nèi)源激素含量因物種和檢測(cè)方法不同而異。高效液相色譜法(HPLC)檢測(cè)枇杷[25]胚性愈傷組織中的內(nèi)源IAA含量可高達(dá)1 000 ng·g-1，用同樣的方法檢測(cè)茶樹(shù)[19]體細(xì)胞胚發(fā)生過(guò)程中的內(nèi)源IAA含量最高只有27 ng·g-1，而用LC-MS/MS方法檢測(cè)胡椒中內(nèi)源IAA含量更低，最高只有6.21 ng·g-1[40]。本試驗(yàn)使用LC-MS/MS檢測(cè)發(fā)現(xiàn)大蒜體細(xì)胞胚內(nèi)源IAA含量最高為21.73 ng·g-1。

不同植物的體細(xì)胞胚發(fā)生過(guò)程中內(nèi)源生長(zhǎng)素含量的變化趨勢(shì)不同。在玉米[15]和姜黃[19]的體細(xì)胞胚發(fā)生過(guò)程中，內(nèi)源IAA先上升后下降，在胚性愈傷組織時(shí)達(dá)到峰值，而北五味子[21]則在球形胚時(shí)期達(dá)到峰值。本研究中，大蒜體細(xì)胞胚形成過(guò)程中內(nèi)源IAA含量先逐漸升高，在PC階段達(dá)到最高值，隨后降低，與玉米和姜黃體細(xì)胞胚中內(nèi)源IAA含量的變化趨勢(shì)基本一致。除內(nèi)源IAA外，本研究還發(fā)現(xiàn)內(nèi)源IBA、ME-IAA和ICAld含量均在大蒜體細(xì)胞胚形成的PC階段達(dá)到最高值，在GE階段降至最低值。

在紅豆和碧桃中，非胚性愈傷組織的內(nèi)源細(xì)胞分裂素tZ和cZ含量高于胚性愈傷組織[41-42]。本研究發(fā)現(xiàn)，tZ含量在EX階段最高，隨后顯著降低，而內(nèi)源cZ含量呈現(xiàn)先升后降的變化趨勢(shì)，在CA和PC階段較高，這與前人研究結(jié)果有所不同。吉訓(xùn)志等[40]發(fā)現(xiàn)IP含量在胚性愈傷組織與體細(xì)胞胚混合階段顯著高于其他階段，但含量較低。而在本研究中，IP含量在EX階段顯著高于其他階段，但總體含量也較低，這與前人研究結(jié)果有所不同，這可能是由于不同物種體細(xì)胞胚發(fā)生過(guò)程中起主要作用CTK類型不同導(dǎo)致的。

高含量?jī)?nèi)源ABA對(duì)棉花和蘋果胚性愈傷組織的形成有促進(jìn)作用[43-44]，而龍眼和荔枝在胚性愈傷組織和球形胚形成的過(guò)程中，都伴隨著內(nèi)源ABA的增加，且在球形胚階段達(dá)到最高值[23-24]。本研究則發(fā)現(xiàn)EX階段內(nèi)源ABA含量很高，但隨著大蒜愈傷組織的形成，內(nèi)源ABA含量顯著降低，并在球形胚階段降至最低值，這與前人研究結(jié)果不一致。有研究表明，在人參和紅豆體細(xì)胞胚胎發(fā)育后期內(nèi)源ABA顯著升高，但在早期胚階段達(dá)到最低值[41,45]。由此推測(cè)，因?yàn)楸狙芯恐械拇笏馇蛐闻咛幱谂咝栽缙?，所以?nèi)源ABA含量無(wú)明顯上升。

3.2 內(nèi)源激素在大蒜體細(xì)胞胚發(fā)生中的調(diào)控作用

前人普遍認(rèn)為生長(zhǎng)素在植物體細(xì)胞胚發(fā)生過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，外源生長(zhǎng)素的添加是誘導(dǎo)體細(xì)胞胚不可或缺的一步，而內(nèi)源IAA含量的上升可能是胚性細(xì)胞形成的一個(gè)重要標(biāo)志[46-48]。本研究發(fā)現(xiàn)，生長(zhǎng)素及其類似物含量均在PC階段升至最高，在GE階段降至最低，由此推測(cè)內(nèi)源IAA、IBA、ME-IAA和ICAld含量的升高可能促進(jìn)大蒜早期胚性愈傷組織的形成，但過(guò)高的內(nèi)源生長(zhǎng)素及其類似物可能會(huì)抑制大蒜球形胚的形成。有研究表明，CTK雖不是啟動(dòng)胚性必需的，但是在某些植物中這類物質(zhì)對(duì)其胚狀體的發(fā)生也起著關(guān)鍵的作用[49]。本研究發(fā)現(xiàn)，cZ含量在大蒜體細(xì)胞胚發(fā)生的CA和PC階段有大量積累，而tZ和IP含量在愈傷組織形成時(shí)持續(xù)下降至球形胚階段。由此推測(cè)，CTK不是大蒜胚性啟動(dòng)的必要物質(zhì)，但是cZ含量的積累和tZ、IP含量的降低可能有助于促進(jìn)大蒜愈傷組織的形成。有研究表明，高水平的內(nèi)源ABA與胚性能力的啟動(dòng)有關(guān)，它可能通過(guò)參與碳水化合物的代謝調(diào)節(jié)植物體細(xì)胞胚胎的發(fā)育[50-51]。本研究發(fā)現(xiàn)，ABA在大蒜體細(xì)胞胚發(fā)生的GE階段含量最低，并未出現(xiàn)ABA的積累，因此推測(cè)低水平的ABA有助于大蒜體細(xì)胞胚的發(fā)生，但對(duì)球形胚的發(fā)育作用，還有待深入研究。

3.3 激素相關(guān)基因參與體細(xì)胞胚發(fā)生調(diào)控的機(jī)理

有研究表明，內(nèi)源性信號(hào)和基因的重編程啟動(dòng)了胚胎發(fā)生過(guò)程的信號(hào)鏈，從而共同調(diào)控了體細(xì)胞胚的發(fā)生[52]。本研究根據(jù)內(nèi)源激素含量在大蒜體細(xì)胞胚發(fā)生各階段的變化趨勢(shì)，結(jié)合內(nèi)源激素代謝和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因的表達(dá)，初步構(gòu)建了大蒜體細(xì)胞胚發(fā)生過(guò)程中激素水平變化與相關(guān)基因表達(dá)之間的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)(圖7)。

外源施加生長(zhǎng)素類物質(zhì)能夠激活生長(zhǎng)素合成相關(guān)基因YUC2和YUC4的表達(dá)，改變內(nèi)源IAA含量，促進(jìn)了體細(xì)胞胚的發(fā)生[53-54]。本研究中發(fā)現(xiàn)，AsYUCCA1和AsTA1基因相對(duì)表達(dá)量的變化與內(nèi)源IAA含量的變化趨勢(shì)基本一致，這說(shuō)明AsYUCCA1和AsTA1正調(diào)節(jié)IAA的合成，這與前人研究結(jié)果一致。有研究表明，生長(zhǎng)素抑制因子Aux/IAA抑制ARFs的表達(dá)，而ARFs激活或抑制下游基因的表達(dá)[55-56]。由此推測(cè)，低水平的內(nèi)源IAA會(huì)減少AsIAA1和AsAUX22D的泛素化降解，抑制AsARF1、AsARF2的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)AsSAUR1的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)大蒜球形胚的形成(圖7)。

本研究發(fā)現(xiàn)大蒜體細(xì)胞胚發(fā)生過(guò)程中AsIPT1和AsKNOX1表達(dá)量低于EX階段，IP含量的降低可能是因?yàn)锳sIPT1和AsKNOX1表達(dá)量降低導(dǎo)致的。除此之外，AsLOG1的表達(dá)也影響cZ含量的變化，而cZ可能通過(guò)激活A(yù)sENT2的表達(dá)來(lái)加速cZ的運(yùn)輸，進(jìn)而促進(jìn)大蒜愈傷組織和早期胚性愈傷組織的形成。植物體內(nèi)CTK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是一個(gè)“磷酸傳遞”的過(guò)程，結(jié)合本研究結(jié)果推測(cè)，cZ可能通過(guò)激活A(yù)sHK2來(lái)誘導(dǎo)B型AsORRs的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)下游A型AsORRs和其他CTK反應(yīng)，促進(jìn)大蒜體細(xì)胞胚的形成(圖7)。本研究還發(fā)現(xiàn)A型AsORR-A1和AsORR-A2表達(dá)量在LC和GE階段顯著下降，而B型AsORR-B1和AsORR-B2在LC和GE階段仍維持高水平表達(dá)，可能是因?yàn)锳型AsORRs對(duì)B型AsORRs存在負(fù)反饋調(diào)節(jié)導(dǎo)致的。

轉(zhuǎn)錄因子HDG可以直接或間接激活NCED3的表達(dá)，而NCED上調(diào)表達(dá)對(duì)ABA的合成具有積極的促進(jìn)作用[57-58]。本研究中發(fā)現(xiàn)大蒜體細(xì)胞胚發(fā)生過(guò)程中AsNCED1和AsNCED2表達(dá)量低于EX階段，這導(dǎo)致ABA含量顯著降低，而AsHDG和AsNCED2表達(dá)量在PC階段升高，這說(shuō)明AsHDG可能參與調(diào)節(jié)AsNCED2的表達(dá)，與前人研究結(jié)果一致。本研究還發(fā)現(xiàn)AsPYL1基因表達(dá)量在GE階段最高，與AsPP2C基因表達(dá)量變化趨勢(shì)相反，所以推測(cè)AsHDG和AsNCED2影響內(nèi)源ABA合成，而內(nèi)源ABA影響了AsPYL1的表達(dá)；AsPYL1通過(guò)抑制AsPP2C基因的表達(dá)來(lái)促進(jìn)AsABI1的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)了大蒜球形胚的形成(圖7)。另外，本研究發(fā)現(xiàn)AsSnRK2表達(dá)量在大蒜體細(xì)胞胚發(fā)生各個(gè)階段無(wú)顯著差異，可能存在其他調(diào)控途徑，尚需要進(jìn)一步進(jìn)行研究。

圖中不同顏色的曲線表示不同內(nèi)源激素含量的變化趨勢(shì)；切角矩形框表示不同基因；橢圓框表示不同內(nèi)源激素含量圖7 大蒜體細(xì)胞胚發(fā)生過(guò)程中激素水平與相關(guān)基因變化的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖The curves of different colors in the figure indicate the changing trend of the contents of different endogenous hormones；Tangential rectangular boxes indicate different genes; Oval boxes indicate different endogenous hormone contentsFig.7 Regulatory network diagram of hormone levels and related gene changes during garlic somatic embryogenesis development

4 結(jié) 論

大蒜體細(xì)胞胚的發(fā)生是個(gè)極其復(fù)雜的動(dòng)態(tài)過(guò)程，內(nèi)源生長(zhǎng)素、CTK和ABA含量及相關(guān)基因表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化共同調(diào)控了大蒜體細(xì)胞胚的形成。在大蒜體細(xì)胞胚發(fā)生過(guò)程中，大蒜愈傷組織的形成可能需要ICAld、IBA和cZ的積累，高水平的生長(zhǎng)素及其類似物和低水平的IP、tZ可能是大蒜早期胚性愈傷組織形成所必需的，而低水平的生長(zhǎng)素及其類似物、CTK和ABA可能有利于大蒜球形胚的形成；激素合成相關(guān)基因調(diào)控內(nèi)源激素含量的變化，內(nèi)源激素含量的變化激活激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因的表達(dá)，從而共同調(diào)控大蒜體細(xì)胞胚的發(fā)生。