李波卡，馮虎元，潘建斌*

(1 蘭州大學 生命科學學院，蘭州 730000；2 中國科學院 植物研究所，系統(tǒng)與進化植物學國家重點實驗室，北京 100093)

藜科(Chenopodiaceae Vent.)植物約有130余屬1 500余種，主要分布于南部非洲、中亞、北美洲、南美洲及大洋洲的干草地、荒漠、鹽堿地，以及地中海、黑海、紅海沿岸。傳統(tǒng)上，莧科(Amaranthaceae Juss.)被認為是藜科的近緣類群。而分子證據(jù)顯示，藜科的多節(jié)草亞科(Polycnemoideae Ulbr.)與莧科成姊妹群關系[1]，表明藜科是并系群。因此自APGⅡ系統(tǒng)開始[2]，狹義藜科和莧科合并成廣義莧科。為避免混亂，以下采用多識植物分類系統(tǒng)[3]中的廣義莧科分類框架進行闡述。

苞藜屬(BaoliaKung et G. L. Chu)是根據(jù)1978年孔憲武等在甘肅省迭部縣發(fā)現(xiàn)的苞藜(BaoliabracteataKung et G. L. Chu)新種建立的單型屬[4]，由于采樣困難等諸多因素，尚無分子水平的研究。形態(tài)學上苞藜屬通過不同的特點被認為與不同的類群具有較近的親緣關系：苞藜具有平坦的葉、兩性花、5枚雄蕊、環(huán)形胚，這些特征與藜族(Chenopodieae Dumort.)一致；但其每朵花均具2枚膜質(zhì)小苞片及1枚苞片，顯示其具有堿蓬亞族(Suaedinae Dumort.)的特征。此外，苞藜屬種皮木質(zhì)且增厚，表面有獨特的小凹陷，表明其可能與環(huán)翅蓬屬(BienertiaBunge ex Boiss.)有較近的關系?！吨袊参镏尽穂5]將苞藜屬放在環(huán)胚亞科(Cyclolobeae C. A. Mey.)藜族。之后，朱格麟[6]對苞藜屬的系統(tǒng)位置進行修訂，將其放在了環(huán)胚亞科多節(jié)草族(Polycnemeae Dum.)。Kühn的系統(tǒng)中苞藜屬位于藜亞科(Chenopodioideae Burnett)[7]，而Zhu等[8]認為，苞藜屬應被放在堿蓬亞科(Suaedioideae Ulbr.)苞藜族(Baolieae Kung)。多識植物分類系統(tǒng)則將苞藜屬置于藜亞科藜族[3](表1)。上述所有觀點均缺少分子系統(tǒng)學證據(jù)，因此，通過分子手段確定苞藜屬的系統(tǒng)位置非常有必要。

表1 苞藜屬的分類歷史

分子鐘定年方法現(xiàn)已廣泛用于生物類群分化年代的推斷，該方法可通過整合化石證據(jù)從而得到各節(jié)點的絕對分化時間與置信區(qū)間[9]。藜粉(ChenopodipollismultiplexKrutzsch)[10]和擬鹽角(SalicornitesmassalongoiPrincipi)[11]是2個年代分別為65～56 Ma和35～23 Ma的藜亞科植物化石記錄，在過去的研究中已被用于推測系統(tǒng)發(fā)育樹節(jié)點分化年代[1, 12]。傳統(tǒng)上，苞藜屬因其較原始的形態(tài)學特征而被認為是一個原始屬[13]。本研究基于核基因片段(ITS)和葉綠體基因片段(atpB-rbcL，rbcL)等序列構建莧科物種系統(tǒng)發(fā)育樹，同時采用上述化石記錄對分子鐘進行校正，探討苞藜屬的系統(tǒng)位置與分化時間。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

莧科植物材料取自野外(表2)，使用硅膠對采集的新鮮葉片進行快速干燥，之后在實驗室完成DNA的提取。

1.2 DNA提取和樣品測序

選取核糖體RNA基因轉錄間隔區(qū)ITS、葉綠體rbcL和葉綠體非編碼區(qū)atpB-rbcL片段，進行序列擴增、測序與系統(tǒng)發(fā)育分析。除對所采集物種進行測序外，其他物種的基因序列下載自GenBank數(shù)據(jù)庫(表2)。

表2 實驗材料來源與GenBank序列號

1)總DNA提取。使用天根生化科技有限公司生產(chǎn)的植物基因組DNA提取試劑盒完成總DNA的提取。

2)目的片段擴增。采用文獻[14]中的引物與PCR反應條件，完成ITS、rbcL、atpB-rbcL三個目的片段的擴增。PCR過程使用 2720 熱循環(huán)儀，反應體系 40 μL：DNA 2 μL，dNTPs 10 mmol/L，引物 2 μL(每種引物5 μmol/L), DNA聚合酶4 U，緩沖液4 μL，ddH2O 26.4 μL。取200～1 000 μg基因組DNA完成對ITS、rbcL、atpB-rbcL片段的擴增。

3)純化與測序。使用天根生化科技有限公司生產(chǎn)的通用型DNA純化回收試劑盒完成PCR產(chǎn)物純化，由北京擎科新業(yè)生物技術有限公司完成測序。

1.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

MEGA 7[15]軟件內(nèi)置的Muscle程序被用于多序列比對，比對結果經(jīng)手動調(diào)整后保存為fasta格式。rbcL、atpB-rbcL兩個數(shù)據(jù)集采用多基因聯(lián)合分析，經(jīng)Sequence Matrix V1.7.8[16]完成拼接后組裝為一個序列矩陣。ITS 序列與rbcL、atpB-rbcL拼接后的序列數(shù)據(jù)使用PGDspider V2.1.1.5[17]轉換成nexus格式，分別用于Beast V1.10.4[18]進行貝葉斯樹構建，用IQ-TREE[19]進行最大似然樹的構建。

在貝葉斯樹的構建中，使用PAUP V4.0[20]對ITS、atpB-rbcL+rbcL兩個序列矩陣的nexus文件進行打分測試，將得到的打分(score)文件使用Mrmodeltest V2.3[21]選出最適核酸替代模型(在AIC標準下，ITS數(shù)據(jù)為 GTR+I+G，atpB-rbcL數(shù)據(jù)為GTR+G，rbcL數(shù)據(jù)為GTR+I+G)。Beast V1.10.4[18]用于對上述核基因ITS數(shù)據(jù)與葉綠體基因atpB-rbcL+rbcL數(shù)據(jù)進行貝葉斯分析與分化時間評估。運行Beast V1.10.4軟件內(nèi)置的 BEAUti V1.10.4程序生成xml文件。具體步驟如下：(1)在替代模型的選擇中，atpB-rbcL設定為GTR+G模型，ITS、rbcL均設定為GTR+I+G；(2)所有數(shù)據(jù)集采用對數(shù)正態(tài)分布的非相關寬松分子鐘模型(uncorrelated relaxed log normal molecular clock model)[22]；(3)樹先驗(tree prior)選擇生滅過程(Birth-Death Process)[23]，并使用隨機起始樹(random starting tree)；(4)采用年代(百萬年，Ma)分別為 65～56 Ma 和35～23 Ma的藜粉(Chenopodipollismultiplex)和擬鹽角(Salicornitesmassalongoi)2個化石記錄，分別標定系統(tǒng)發(fā)育樹根節(jié)點以及鹽角草亞族(Salicorniinae Ulbr.)冠群分化年代；(5)系統(tǒng)發(fā)育樹根部及鹽角草亞族年代均設置為正態(tài)分布，均值/標準差分別設置為：60.5/2和29/2.5，其他先驗采用默認設置；(6)執(zhí)行參數(shù)(Operators)采用默認設置；(7)馬爾可夫鏈-蒙特卡洛算法運行代數(shù)為8×107，抽樣頻率為每1 000代。生成的xml文件經(jīng)Beast V1.10.4運行后，使用Tracer V1.7.1[24]對各參數(shù)的有效樣本容量(effective sample size，ESS)進行收斂性(convergence)評估，老化樣本(burn-in)設置為10%，使用TreeAnnotator V1.10.4程序總結最大分支可信度樹(maximum clade credibility tree)以及各節(jié)點的后驗概率(posterior probability,PP)、95%最高后驗密度區(qū)間(highest posterior density heights interval, HPD)以及Median heights。

使用IQ-TREE提供的WEB服務器[25]完成最大似然樹的構建。核酸替代模型選擇采用IQ-TREE整合的ModelFinder模塊[26]，在BIC標準下，ITS數(shù)據(jù)的最適模型為SYM+I+G4，atpB-rbcL數(shù)據(jù)的最適模型為 K3Pu+F+G4，rbcL數(shù)據(jù)的最適模型為TPM3u+F+I+G4。使用IQ-TREE支持的超快自展(ultrafast bootstrap)[27]，自展值(bootstrap,BS)設置為1000。系統(tǒng)發(fā)育樹分支中，貝葉斯樹后驗概率≥0.95或最大似然樹自展值≥95視為高支持率。

2 結果與分析

2.1 基于ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育分析

ITS序列矩陣包含物種33個，67條序列。序列長度為686 bp，其中變異位點390個(56.9%)，保守位點286個(41.7%)。通過Beast分析得到的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖1，最大似然樹與貝葉斯樹拓撲結構相似，不同之處是平臥堿蓬(Suaedaprostrata)以低支持率(BS=76)與豬毛菜族(Salsoleae Dumort.)聚成一支。結果顯示，千針莧屬(AcroglochinSchrad.)、蟲實屬(Corispermum)、苞藜屬(Baolia)組成的分支以低支持率(PP=0.88/BS=64)嵌入藜族(Chenopodieae)，且以低支持率(PP=0.58/BS=53)與藜屬(ChenopodiumL.)、單性濱藜屬(ArchiatriplexG. L. Chu)、刺壤藜屬(GrayiaHook. et Arn.)、濱藜屬(AtriplexL.)形成的分支(PP=1/BS=100)互為姊妹群。在鹽角草族(Salicornieae Dumort.)中，平臥堿蓬(Suaedaprostrata)與堿蓬(Suaedaglauca)、鹽角草亞族(Salicorniinae)組成的分支(PP=0.75/BS=88)形成姊妹群關系。樟味藜族(Camphorosmeae Moq.)、豬毛菜族各屬以高支持率(PP=1/BS=99)形成一單系群。

后驗概率展示在分支上，自展值展示在分支下；對節(jié)點年代的測定展示在節(jié)點后，同時展示95%置信區(qū)間；下同圖1 基于ITS序列數(shù)據(jù)集的Beast分析分子鐘系統(tǒng)發(fā)育樹Posterior probabilities are shown above branches, bootstrap values of the maximum likelihood analysis are shown below branches; Estimated ages of nodes are given behind the respective node, and corresponding bars demonstrate 95% confidence intervals; The same as belowFig.1 Molecular phylogenetic tree from the Beast analysis based on the ITS sequence dataset

2.2 基于atpB-rbcL+rbcL聯(lián)合序列的系統(tǒng)發(fā)育分析

atpB-rbcL+rbcL聯(lián)合序列矩陣包含物種35個，61條序列。拼接后序列總長度為1 992 bp，其中變異位點有422個(21.2%)，保守位點1 570個(78.8%)。Beast分析得到的系統(tǒng)關系樹見圖2，最大似然樹與貝葉斯樹拓撲結構大致相同。系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，苞藜屬(Baolia)、沙蓬屬(AgriophyllumM. Bieb.)、合被蟲實屬(AnthochlamysFenzl)與蟲實屬(Corispermum)共同構成一較高支持率的單系群(PP=1/BS=93)，且苞藜屬以高支持率聚為一支(Baolia:PP=1/BS=100)。由上述4屬形成的分支在一般支持率下與藜族(Chenopodieae)形成姊妹群關系(PP=0.83/BS=100)。由于沒有得到序列信息，千針莧屬(Acroglochin)并未包括在此次分析中。與ITS分析不同，鹽角草亞族(Salicorniinae)和堿蓬亞族(Suaedinae)形成高支持率(PP=0.99/BS=100)的姊妹群關系。豬毛菜族(Salsoleae)、樟味藜族(Camphorosmeae)以高支持率聚為一單系群(PP=0.99/BS=98)。

圖2 Beast分析得到的基于atpB-rbcL+rbcL聯(lián)合序列數(shù)據(jù)集的分子鐘系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Molecular phylogenetic tree from the Beast analysis based on the concatenated sequence of atpB-rbcL and rbcL

2.3 分化時間估計

表3展示由Beast V1.10.4分子鐘定年得到的結果，總結了ITS序列、atpB-rbcL+rbcL聯(lián)合序列中主要節(jié)點的分化年代(均值及95%置信區(qū)間)。苞藜屬的分化時間在2棵樹上分別為17.0和28.7 Ma前。

3 討 論

3.1 苞藜屬與蟲實族的單系性

分別基于核ITS序列以及基于葉綠體atpB-rbcL+rbcL聯(lián)合序列的系統(tǒng)發(fā)育樹分析顯示，苞藜屬(Baolia)在atpB-rbcL+rbcL系統(tǒng)發(fā)育樹中與藜亞科(Chenopodioideae)蟲實族(Corispermeae)的沙蓬屬(Agriophyllum)、合被蟲實屬(Anthoch-lamys)、蟲實屬(Corispermum)互為姊妹群(PP=1/BS=93)。而在ITS系統(tǒng)發(fā)育樹中苞藜屬與蟲實屬也以較高的支持率聚成一支(PP=0.92/BS=89)，表明苞藜屬與蟲實族具有較近的親緣關系，這與傳統(tǒng)上基于形態(tài)學對苞藜屬分類地位的劃分有很大不同[4, 6-8]。從形態(tài)上看，苞藜屬與蟲實族其他類群均為具有平坦葉的一年生草本，具兩性花且花柱二枚。然而苞藜屬的獨特之處在于：1)蟲實族植物常被毛，而苞藜屬無毛；2)蟲實族植物花序穗狀，苞藜屬的花則簇生葉腋；3)蟲實族植物不具小苞片而苞藜屬存在小苞片。從分布來看，蟲實族在亞洲、歐洲及北美洲(蟲實屬)均有分布，在中國分布于東北、華北、西北和青藏高原，而苞藜屬為中國特有，僅分布于甘肅西南部的迭部縣。

表3 使用Beast程序得到的分歧時間(百萬年)評估結果(括號內(nèi)為95%置信區(qū)間)

通過以上分析認為,苞藜屬應放在藜亞科(Chenopodioideae)，又因其系統(tǒng)地位、形態(tài)學與地理分布的特殊性，將其單獨放在苞藜族(Baolieae)。

3.2 蟲實族的系統(tǒng)位置

ITS和atpB-rbcL+rbcL數(shù)據(jù)集得到的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，蟲實族與藜族(Chenopodieae)關系密切。ITS系統(tǒng)樹分析顯示，藜族為一并系群，蟲實族聚成較高支持率的單系(PP=0.92/BS=89)并嵌入藜族內(nèi)部。而在atpB-rbcL+rbcL系統(tǒng)樹中，蟲實族與藜族成員互為姊妹群(PP=0.83/BS=100)。在過去的一些基于葉綠體基因的研究中，也得到了蟲實族與藜族成姊妹群關系的證據(jù)[28-30]。Berner 等[31]在一項基于核基因ITS的研究中發(fā)現(xiàn)，太平洋蟲實(CorispermumpacificumMosyakin)與異被濱藜亞族(Suckleyinae G. L. Chu et Stutz)的土荊芥[ChenopodiumambrosioidesL.=Dysphaniaambrosioides(L.) Mosyakin et Clemants]和 異被濱藜[Suckleyasuckleyana(Torr.) Rydb.]形成的分支互為姊妹群，和藜亞族(Chenopodiinae Scott)、軸藜亞族(Axyridinae Heklau)、甜菜族(Beteae Volkens)形成一多枝結構。而Kadereit 等[1]發(fā)現(xiàn)蟲實族與豬毛菜族(Salsoleae)、鹽角草族(Salicornieae)、樟味藜族(Camphorosmeae)形成的分枝聚在一起。從形態(tài)上看，蟲實族的3個屬：蟲實屬(Corispermum)、合被蟲實屬(Anthochlamys)和沙蓬屬(Agriophyllum)，具有平坦的葉、分枝狀毛被和穗狀花序等。因此，相比于豬毛菜族、樟味藜族、甜菜族和鹽角草族，蟲實族的形態(tài)學特征也與藜族更為接近。

本研究結果支持蟲實族作為一個穩(wěn)定單系群的地位，并且它與藜族有著更為緊密的關系。

3.3 苞藜屬的分化時間

基于狹義藜科(Chenopodiaceae)植物屬種在現(xiàn)代的分布格局及親緣關系，朱格麟[13]推測狹義藜科在早白堊紀起源于中國西南部，并且苞藜屬(Baolia)是一個原始屬。與大多數(shù)狹義藜科植物干旱缺水的生境不同，苞藜(Baoliabracteata)的生境相對濕潤。研究表明，苞藜屬與蟲實屬(Corispermum)在28.7～17.0 Ma間分化，即晚漸新世至中中新世。從地史上看，該時期喜馬拉雅造山運動使造山帶東部的夏季降雨量增加，也加重了中國西北部的干旱程度。因此我們推測，苞藜屬與蟲實屬的共同祖先是起源于中國西南部的狹義藜科原始類群的后代，并在晚漸新世至中中新世之間與蟲實族其他類群分化，苞藜屬適應了濕潤的氣候，并在第三紀末的氣候轉冷至第四紀冰期得以幸存，在約3.1～0.6 Ma出現(xiàn)了種內(nèi)分化，可能是由于冰期時其分布范圍收縮引起的地理隔離導致。蟲實屬、合被蟲實屬(Anthochlamys)和沙蓬屬(Agriophyllum)則適應了干旱環(huán)境，在歐亞大陸廣泛擴散。其中，蟲實屬最終可能沿白令陸橋在北美洲登陸[32-33]。由于缺少化石材料，對苞藜的研究還需進一步深入。此外，因苞藜分布域狹小且生境受到人為干擾，故在此呼吁盡快對其開展(異地)保護工作，加強物種生物學研究。

致謝：感謝任廣朋、蘇敏在數(shù)據(jù)分析、實驗操作中提供的幫助。