王新文，王世偉，茍琦敏，王永剛，馬建忠

(蘭州理工大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，蘭州 730050)

2000年，第5個(gè)不響應(yīng)ABA的突變體(ABA-insensitive 5)基因abi5被鑒定[1-2]。ABI5基因編碼一堿性亮氨酸拉鏈類(bZIP)轉(zhuǎn)錄因子，它可在花和種胚中表達(dá)，在干種子中積累最多。在擬南芥(Arabidopsisthaliana)中，與轉(zhuǎn)錄因子ABI5高度同源的bZIP類轉(zhuǎn)錄因子共有9個(gè)，分別為ABI5/AtDPBF1、AtDPBF2、AtDPBF3/AREB3、AtDPBF4/EEL、ABF1、ABF2/AREB1、ABF3/AtDPBF5、ABF4/AREB2和At5G42910，它們被統(tǒng)稱為ABI5亞家族[3-8]。ABI5亞家族9個(gè)成員參與了植物種子的成熟和萌發(fā)、開花時(shí)間等生長發(fā)育過程和植物對(duì)逆境脅迫的應(yīng)答[9-12]。但由于基因冗余，精細(xì)區(qū)別這9個(gè)成員的生理作用或在植物生長發(fā)育過程中扮演的具體角色是一件棘手的工作。如此，確定這9個(gè)成員在植物生長發(fā)育過程中的表達(dá)階段和組織以及所響應(yīng)的生理或環(huán)境信號(hào)，無疑是理解它們作用和分工的首要工作。

ABI5基因鑒定后，F(xiàn)inkelstein等[1]報(bào)道該基因在胚胎發(fā)育的晚期開始表達(dá)，在干種子中其mRNA含量最高。Lopez-Molina等[2]報(bào)道，ABI5在花中也有表達(dá)，開花后的長角果長至11 d時(shí)可檢測到其mRNA信號(hào)。以響應(yīng)ABA的順式元件ABREs(ABA-responsive elements)為誘餌所克隆的ABFs均受ABA誘導(dǎo)表達(dá)，但強(qiáng)度不同，ABF2最強(qiáng)、ABF4次之、ABF1和ABF3較弱[5]。此外，ABF2、ABF3和ABF4受高鹽誘導(dǎo)，ABF1、ABF2、ABF4受低溫誘導(dǎo)，ABF2和ABF4受干旱誘導(dǎo)[5]。

檢測mRNA含量的方法，不管是Northern blotting或是qRT-PCR，均分析其相對(duì)含量。因此，如果不是在同一個(gè)平臺(tái)上進(jìn)行比較，各基因表達(dá)的強(qiáng)弱就沒有比較意義。Fujita等[13]最早以Northern blotting方法對(duì)ABI5家族的9個(gè)成員同時(shí)進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)無論是ABA處理還是高鹽、干旱處理，ABF2/AREB1的信號(hào)都最強(qiáng)；ABF3/AtDPBF5和ABF4/AREB2的表達(dá)強(qiáng)度差不多，二者也均受ABA、高鹽和干旱的誘導(dǎo)；ABF1、ABI5/AtDPBF1和AtDPBF3表達(dá)較弱，似乎也受ABA、高鹽和干旱誘導(dǎo)；AtDPBF2、AtDPBF4/EEL和At5G42910的表達(dá)信號(hào)未能檢測到。此后，Yoshida等[14]以qRT-PCR檢測了ABF1、ABF2/AREB1、ABF3/AtDPBF5、ABF4/AREB2和ABI5/AtDPBF1基因表達(dá)的相對(duì)強(qiáng)度，卻發(fā)現(xiàn)ABF3/AtDPBF5在無處理和干旱處理的幼苗中表達(dá)最強(qiáng)。這一結(jié)果雖然與此前的報(bào)道不太一致，但qRT-PCR檢測在靈敏度上表現(xiàn)出了明顯的優(yōu)勢。為準(zhǔn)確理解ABI5亞家族9個(gè)成員的分工和具體作用，仍然有必要以最為靈敏的分析技術(shù)，在同一平臺(tái)上同時(shí)對(duì)9個(gè)基因的表達(dá)特性加以測定和分析，結(jié)果更有比較意義，促進(jìn)理解這9個(gè)基因的生物學(xué)功能的異同。本研究采用qRT-PCR方法分析擬南芥ABI5亞家族9個(gè)基因在不同組織和生長階段，以及苗期對(duì)ABA、高鹽、高滲和低溫等響應(yīng)下mRNA的相對(duì)含量變化，以探討9個(gè)基因的生物學(xué)功能異同。

1 材料和方法

1.1 材料培養(yǎng)

擬南芥(Arabidopsisthaliana)Columbia生態(tài)型種子為馬建忠實(shí)驗(yàn)室保存。所有種子播種前置于4 ℃冰箱春化3 d。春化后參照王立光等[15]的方法清洗種子，點(diǎn)種于1/2 MS固體培養(yǎng)基表面，于人工氣候培養(yǎng)箱(上海一恒)或營養(yǎng)土中培養(yǎng)，溫度為22 ℃, 相對(duì)濕度為55%，光周期為16 h光照/8 h黑暗，光照強(qiáng)度為100 μmol·m-2·s-1。

1.2 qRT-PCR檢測

參照RNA提取試劑盒(上海生工，B518661)說明書提取總RNA，采用反轉(zhuǎn)錄酶(TaKaRa，6210A)合成cDNA, 再以cDNA為模板使用MA-6000熒光定量PCR儀(蘇州雅睿)檢測基因的相對(duì)表達(dá)量。qRT-PCR試劑盒購買自TaKaRa(RR037A)。檢測所用特異性引物見表1，其中內(nèi)參基因Actin的上下游引物參照文獻(xiàn)[16]。

表1 qRT-PCR檢測擬南芥ABI5亞家族基因的特異性引物

1.2.1 幼苗期各基因的表達(dá)將1/2 MS固體培養(yǎng)基培養(yǎng)的剛萌發(fā)的種子(以胚根突破種皮出現(xiàn)白色胚根為準(zhǔn)，記為1 d齡幼苗)提取總RNA進(jìn)行qRT-PCR，檢測基因的相對(duì)表達(dá)量；分別取萌發(fā)后5 d齡、9 d齡和13 d齡擬南芥整株幼苗的總RNA，進(jìn)行萌發(fā)后生長階段ABI5亞家族各成員的qRT-PCR實(shí)驗(yàn)，檢測各基因動(dòng)態(tài)表達(dá)。

1.2.2 擬南芥幼苗期不同脅迫下基因的表達(dá)將1/2 MS固體培養(yǎng)基培養(yǎng)4 d齡的幼苗，移到含不同濃度的蔗糖、NaCl、山梨醇(三者使用的濃度梯度均為50、100 和200 mmol·L-1)和ABA(10、25和50 μmol·L-1)的1/2 MS培養(yǎng)基培養(yǎng)8 d，檢測不同脅迫對(duì)擬南芥萌發(fā)后生長的影響；13 d齡的幼苗分別在不同脅迫下(20 μmol·L-1ABA、100 mmol·L-1NaCl、100 mmol·L-1山梨醇和4 ℃)處理0、0.5、1、2、4 和6 h后提取總RNA進(jìn)行qRT-PCR實(shí)驗(yàn)。于營養(yǎng)土培養(yǎng)(培養(yǎng)條件同上)60 d齡的擬南芥植株。

1.2.3 擬南芥不同組織部位各基因的表達(dá)營養(yǎng)土培養(yǎng)60 d的擬南芥植株，分別選取足夠量的根、莖、葉、花、果莢及成熟種子等組織，提取總RNA，進(jìn)行qRT-PCR，檢測各基因在不同部位的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 ABI5亞家族基因在擬南芥苗期的表達(dá)動(dòng)態(tài)和mRNA的相對(duì)含量

在適宜的生長條件下，擬南芥的生活周期約7～8周，分為兩個(gè)明顯的生長發(fā)育階段：營養(yǎng)生長期與生殖生長期。營養(yǎng)生長不僅是一個(gè)植物長大的過程，也是植物從營養(yǎng)生長往生殖生長轉(zhuǎn)折的積蓄過程。因此，本研究首先對(duì)營養(yǎng)生長階段ABI5亞家族基因表達(dá)的動(dòng)態(tài)進(jìn)行了測定。在營養(yǎng)生長階段，除At5G42910的信號(hào)檢測不到外，ABF1和ABF2基因的表達(dá)隨生長天數(shù)的增加而逐漸上升，而ABF3、ABF4、ABI5、AtDPBF2、AtDPBF3、AtDPBF4在種子剛萌發(fā)時(shí)表達(dá)量最高，與5 d齡的幼苗相比，分別升高了約51倍、37倍、520倍、820倍、44倍和193倍；隨后在5 d齡幼苗中表達(dá)量均降至最低，之后又分別隨著生長天數(shù)的增加而增加(圖1，A)。At5G42910基因的信號(hào)在1 d齡、5 d齡、9 d齡和13 d齡的幼苗中始終未檢測到。

除GUS組織化學(xué)染色分析外，對(duì)ABI5亞家族基因在擬南芥幼苗階段表達(dá)動(dòng)態(tài)的相對(duì)定量尚未見其他報(bào)道。從本研究結(jié)果看，AtDPBF2和AtDPBF4基因在幼苗生長階段相對(duì)表達(dá)量均大幅增加。尤其是AtDPBF4，在9 d齡的幼苗中，其相對(duì)表達(dá)量已大幅增加。據(jù)此，AtDPBF2和AtDPBF4基因可能在擬南芥生長發(fā)育的轉(zhuǎn)型中發(fā)揮了更多作用。

ABI5亞家族中除ABI5外，其余7個(gè)基因在幼苗生長的不同階段的相對(duì)表達(dá)量呈逐漸走高模式。其中，AtDPBF2和AtDPBF4的表達(dá)增強(qiáng)尤其顯著。對(duì)該亞家族的9個(gè)基因相互間比較，分析擬南芥幼苗生長早期它們的mRNA相對(duì)含量。以13 d齡擬南芥幼苗中ABI5的mRNA含量為1，經(jīng)qRT-PCR分析表明，ABI5亞家族各成員的mRNA相對(duì)含量存在著明顯的差異。ABF3的相對(duì)含量最高，約為ABI5的59倍；ABF2、ABF4和AtDPBF3次之，分別約為ABI5的32倍、30倍和14倍；ABF1和AtDPBF4分別約為ABI5的4倍和2倍；而AtDPBF2表達(dá)量最少，約為ABI5的0.1倍(圖1，B)。At5G42910的信號(hào)仍然檢測不到。ABI5亞家族基因在擬南芥幼苗中的mRNA相對(duì)含量與Fujita等[13]以Northern blotting分析的結(jié)果基本一致，即ABF3、ABF2、ABF4和AtDPBF3的相對(duì)含量較高。在Fujita等[13]的結(jié)果中，Northern blotting最強(qiáng)的信號(hào)是ABF2而不是ABF3，似乎和本研究結(jié)果不太一致。但仔細(xì)觀察他們的Northern blotting分析結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，ABF3呈現(xiàn)出了2條雜交帶。由于ABF3和AtDPBF5是一個(gè)編碼基因的2個(gè)不同的剪切本[7]，二者的mRNA長度不同，Northern Blotting可檢出2條雜交帶，而qRT-PCR則把二者的信號(hào)可能加和在了一起，以致在本實(shí)驗(yàn)中ABF3呈現(xiàn)出了最高的mRNA相對(duì)含量。

A. ABI5亞家族成員在不同天齡擬南芥幼苗中的相對(duì)表達(dá)量(以5 d齡中各基因的表達(dá)為對(duì)照)。*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)(Student’s t-test)；B. 13 d齡擬南芥幼苗中ABI5亞家族成員mRNA的相對(duì)含量(ABI5的mRNA含量計(jì)為1)。不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)圖1 ABI5亞家族基因在幼苗生長階段的表達(dá)A. Relative expression levels of the ABI5 subfamily genes in different-day-old seedlings of Arabidopsis. * indicates significant difference at P<0.05 and ** indicates significant difference at P<0.01 (Student’s t-test); B. Relative mRNA contents of ABI5 subfamily members in 13-day-old Arabidopsis seedlings. Different lowercase letters indicate significant differences(P<0.05)Fig.1 Expression of ABI5 subfamily genes in the growth stage of Arabidopsis seedlings

2.2 擬南芥不同組織部位中ABI5亞家族各基因的表達(dá)

擬南芥在培養(yǎng)4周左右時(shí)開始從營養(yǎng)生長階段向生殖生長期轉(zhuǎn)變。本研究接著對(duì)生殖生長階段ABI5亞家族9個(gè)基因在根、莖、葉片、花、果莢和成熟種子中的動(dòng)態(tài)表達(dá)進(jìn)行了測定。本研究發(fā)現(xiàn)(圖2)，在60 d齡植株中該家族基因在花和成熟種子中大量表達(dá)。與根中的表達(dá)量相比，除ABF3和At5G42910以外的其他7個(gè)基因均在種子中大量表達(dá)，且ABI5的表達(dá)量最高，上升730倍，ABF1、ABF2、ABF4、AtDPBF2、AtDPBF3 和AtDPBF4分別上升了約3倍、10倍、24倍、31倍、17倍和101倍；在花中，ABI5的表達(dá)量最高，上升了122倍，ABF1的表達(dá)量最低，ABF4和AtDPBF3上升了8倍，其他5個(gè)基因的表達(dá)均約增加了3倍。此外，本研究發(fā)現(xiàn)在葉片中ABFs基因大量表達(dá)，且ABF2表達(dá)量最高，增加了10倍，而DPBFs(包括ABI5)少量表達(dá)；在果莢中，AtDPBF2表達(dá)量最高，上升了約12倍，ABF2、ABI5 和At5G42910均增加了約5倍；在莖和根中9個(gè)基因均少量表達(dá)。

圖2 ABI5亞家族基因在不同組織中的表達(dá)Fig.2 Expression of ABI5 subfamily genes in the different tissues of Arabidopsis

2.3 不同脅迫處理對(duì)擬南芥幼苗生長的影響

ABI5亞家族基因參與了ABA、干旱、高滲和低溫等信號(hào)途徑[5, 17]。不同脅迫對(duì)擬南芥種子萌發(fā)的影響不同。圖3顯示，擬南芥種子萌發(fā)4 d后，將幼苗移到含不同濃度的蔗糖、NaCl、山梨醇和ABA的1/2 MS培養(yǎng)基上繼續(xù)生長，8 d后幼苗長勢出現(xiàn)了明顯差異。其中，不同濃度蔗糖處理對(duì)幼苗地上部分影響不顯著，對(duì)根的生長隨蔗糖濃度升高出現(xiàn)了明顯的抑制；不同濃度NaCl處理抑制擬南芥幼苗的生長，200 mmol·L-1NaCl對(duì)幼苗幾乎致死；不同濃度山梨醇處理同樣抑制幼苗根部生長，地上部分葉片萎縮；不同濃度ABA處理下擬南芥幼苗生長發(fā)育整體減緩，10 μmol·L-1的抑制效應(yīng)已非常明顯，隨著濃度上升抑制效應(yīng)加劇(圖3)。

圖3 不同濃度外源物質(zhì)處理對(duì)擬南芥幼苗生長的影響Fig.3 Effects of different concentrations of exogenous substances on the growth of Arabidopsis seedlings

2.4 不同脅迫處理對(duì)ABI5亞家族基因表達(dá)的影響

ABI5亞家族成員參與了植物對(duì)ABA、干旱、低溫、高滲等響應(yīng)的信號(hào)途徑[5, 13, 17-18]。據(jù)此測定ABI5亞家族成員基因在ABA、山梨醇、NaCl、低溫等因素處理的13 d齡幼苗中的表達(dá)狀況。

20 μmol·L-1ABA處理13 d齡的擬南芥幼苗0.5～6 h，ABF1、ABF2、ABF3、ABF4和ABI5的mRNA相對(duì)含量逐漸升高，其中ABF1和ABI5的增加最為顯著，二者均接近30倍的增幅；AtDPBF2基因的mRNA相對(duì)含量呈低-高-低走勢；AtDPBF3、AtDPBF4基因的表達(dá)對(duì)ABA沒有明顯的響應(yīng)(圖4，A)。

圖4 不同脅迫處理及其時(shí)間對(duì)擬南芥苗期ABI5亞家族各基因mRNA含量變化的影響Fig.4 Change on the relative mRNA contents of the ABI5 subfamily genes in the seedlings of Arabidopsis during different stresses

100 mmol·L-1山梨醇處理13 d齡擬南芥幼苗0.5～6 h，ABF1、ABF4和ABI5的mRNA相對(duì)含量隨著時(shí)間的增加而明顯升高，ABF1的mRNA相對(duì)含量上升最高，接近120倍；ABF3和AtDPBF2的mRNA相對(duì)含量先上升，隨后有所下降；ABF4和AtDPBF4的mRNA相對(duì)含量略有上升；ABF2基因的mRNA相對(duì)含量變化不明顯，而AtDPBF3的表達(dá)略有下降(圖4，B)。

高鹽(100 mmol·L-1NaCl)處理13 d齡的擬南芥幼苗0.5～6 h時(shí)，ABI5亞家族成員基因的表達(dá)狀況比較復(fù)雜。ABF3基因的mRNA相對(duì)含量發(fā)生了顯著上升，其余成員基因的mRNA相對(duì)含量要么變化不顯著(如ABF1、ABF2、AtDPBF2和AtDPBF3基因)、要么略有下降(如ABF4、ABI5和AtDPBF4基因)(圖4，C)。

4 ℃低溫處理13 d齡的擬南芥幼苗0.5～6 h時(shí)，ABF1和ABI5基因的mRNA相對(duì)含量大幅上升，ABF1基因的相對(duì)表達(dá)量上升了約110倍，ABI5基因也上升了約25倍；ABF3、ABF4、AtDPBF2和AtDPBF4基因的mRNA相對(duì)含量略有上升；ABF2和AtDPBF3基因的表達(dá)變化則不明顯(圖4，D)。低溫誘導(dǎo)ABF1基因表達(dá)明顯增強(qiáng)，這一結(jié)果與Choi等的結(jié)果一致[5]。

3 討 論

在植物的生長發(fā)育過程中，不同基因在不同時(shí)期的有序表達(dá)調(diào)控著植物的形態(tài)建成和生長期轉(zhuǎn)變。擬南芥ABI5亞家族的9個(gè)基因參與調(diào)控?cái)M南芥種子的成熟、萌發(fā)、開花時(shí)間，以及對(duì)ABA、干旱、高鹽和低溫脅迫的響應(yīng)[9-12, 19-22]。理解ABI5亞家族這9個(gè)基因在擬南芥生長發(fā)育過程中的分工和具體作用，確定它們時(shí)空表達(dá)次序和響應(yīng)因素非常重要。自ABI5亞家族基因先后被克隆、鑒定以來，只有Fujita等[13]以Northern blotting對(duì)這9個(gè)成員基因同時(shí)進(jìn)行了比較。但遺憾的是有3個(gè)基因(AtDPBF2、AtDPBF4和At5G42910)完全沒有信號(hào)，ABF1、ABI5和AtDPBF3也因信號(hào)較弱難以做出準(zhǔn)確判斷。本研究以qRT-PCR同時(shí)分析了ABI5亞家族9個(gè)基因在擬南芥不同生長發(fā)育時(shí)期、不同組織部位和脅迫處理下的表達(dá)情況。在種子剛萌發(fā)時(shí)除ABF1和ABF2以外的7個(gè)基因均大量表達(dá)，這可能是因?yàn)榉N子在打破休眠開始生長前，種子為維持休眠而大量表達(dá)，而在剛萌發(fā)時(shí)這種調(diào)控表達(dá)未完全解除。與之對(duì)應(yīng)的在成熟種子中9個(gè)基因均大量表達(dá)，這也從側(cè)面說明ABF1和ABF2可能在調(diào)控種子萌發(fā)方面起著重要作用。在營養(yǎng)生長階段，從5 d齡起ABI5亞家族9個(gè)基因的表達(dá)逐漸增強(qiáng)，在生殖生長階段，ABFs側(cè)重在葉片中表達(dá)，AtDPBFs側(cè)重在種子和花中表達(dá)，且在種子中9個(gè)基因均大量表達(dá)，這與它們在擬南芥的開花、種子發(fā)育等后期生長發(fā)育階段發(fā)揮作用相對(duì)應(yīng)。

此后，Yoshida等[14]以qRT-PCR分析了ABA、干旱和高鹽對(duì)ABF1、ABF2/AREB1、ABF3、ABF4/AREB2和ABI5等5個(gè)基因的mRNA相對(duì)含量的影響。ABI5亞家族成員基因中，4個(gè)ABFs基因均受ABA誘導(dǎo)表達(dá)，而4個(gè)AtDPBFs基因中僅ABI5/AtDPBF1受ABA的顯著誘導(dǎo)，這可能與ABFs是以結(jié)合ABA的順式元件為誘餌所克隆、而AtDPBFs是以體細(xì)胞胚中特異表達(dá)的順式元件為誘餌所克隆有關(guān)[3-5]。Choi等[5]以Northern blotting分析ABFs對(duì)ABA的響應(yīng)，認(rèn)為ABF2和ABF4受ABA誘導(dǎo)表達(dá)最強(qiáng)，而本結(jié)果中卻是ABF1和ABI5的表達(dá)增強(qiáng)最為顯著，造成這種差異的原因可能在于這些基因在擬南芥中的相對(duì)含量差異巨大，ABF2和ABF4基因的表達(dá)強(qiáng)度在無處理的擬南芥幼苗中遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于ABF1和ABI5，它們在ABA誘導(dǎo)時(shí)增加幅度不大，只是因?yàn)樗鼈冊贏BA處理前的幼苗中含量已經(jīng)相當(dāng)高。

此外，Choi等[5]發(fā)現(xiàn)低溫處理下只有ABF1有明顯的表達(dá)；NaCl處理下ABF2和ABF3強(qiáng)烈表達(dá)，ABF1有微弱的表達(dá)；低溫、干旱及NaCl等3種處理均誘導(dǎo)了ABF4的表達(dá)[5]。本結(jié)果表明低溫不僅誘導(dǎo)ABF1強(qiáng)烈表達(dá)，也誘導(dǎo)ABI5基因的顯著表達(dá)；NaCl處理下只有ABF3表達(dá)有顯著增強(qiáng)。這些差異是由于這9個(gè)基因在無處理的擬南芥幼苗中起始含量之間存在巨大差異所造成。

到目前為止，雖然以RT-PCR可以從擬南芥幼苗中擴(kuò)增到At5G42910基因的轉(zhuǎn)錄本，但以Northern blotting或qRT-PCR均難檢測到At5G42910基因表達(dá)的信號(hào)，以致Fujita等[13]推測其可能是個(gè)假基因。本研究發(fā)現(xiàn)幼苗中雖然At5G42910基因的表達(dá)信號(hào)難以檢測，但其在花和果莢中大量表達(dá)，推測該基因在種子形成及成熟過程中起著重要作用。