孔 杰，劉文文，蔣學(xué)乾，何 飛，康俊梅，王 珍

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193)

葉綠素是綠色植物進行光合作用的重要色素，在光能吸收、轉(zhuǎn)移和光化學(xué)電荷分離等方面發(fā)揮作用，葉綠素分子受光的激發(fā)，將電子轉(zhuǎn)移到NADP+并通過質(zhì)子驅(qū)動合成ATP[1]。擬南芥(Arabidopsisthaliana)中葉綠素的生物合成有15種酶參與，這些酶共由27個基因編碼[2]。其中，CHLG是定位于類囊體膜上的酯化酶，它催化葉綠素合成的最后一步，即由葉綠素酸酯a(chlorophyllide a, Chlide a)生成葉綠素a和由葉綠素酸酯b(chlorophyllide b, Chlide b)生成葉綠素b。該酶對形成色素蛋白復(fù)合體和穩(wěn)定葉綠素結(jié)合蛋白必不可少[3]。此外，CHLG參與葉綠素生物合成途徑的反饋調(diào)控，并對葉綠素結(jié)合蛋白和其他類囊體膜成分的穩(wěn)定組裝起重要作用[1, 4]。

葉綠素合成途徑中某些酶的編碼基因發(fā)生突變會引起葉綠素含量改變，引起葉色變化。水稻(Oryzasativa)中鎂原卟啉IX甲基轉(zhuǎn)移酶(Mg-protoporphyrin IX methyltransferase, MgPMT)催化鎂原卟啉IX(Mg-protoporphyrin IX, Mg-Proto IX)生成鎂原卟啉IX單甲酯(Mg-protoporphyrin IX monomethyl ester, Mg-PME)，其編碼基因發(fā)生突變?nèi)~片呈現(xiàn)黃綠表型[5]。綠色植物CHLG基因的表達水平影響葉綠素的合成，進而影響植株的葉色、生長發(fā)育和生物量。研究發(fā)現(xiàn)，水稻OsCHLG基因突變體ygl80中的葉綠素和類胡蘿卜素含量降低，葉色黃綠，產(chǎn)量降低[6]。抑制煙草(Nicotianatabacum)NtCHLG基因的表達導(dǎo)致葉綠素含量顯著降低，葉片呈淡綠色且植株發(fā)育遲緩。相反的，煙草中過表達該基因引起葉綠素含量增加[1]。苜蓿秋眠性是苜蓿的一種生長特性，它是指苜蓿在秋季光照時間變短和氣溫降低時所表現(xiàn)出來的一種綜合性反應(yīng)，它與苜蓿的抗寒性和生產(chǎn)潛力相關(guān)[7]。秋眠級低的苜?？购詮?，高秋眠級的苜蓿生產(chǎn)潛力大，因此，秋眠性是苜蓿選育栽培的一項重要參考指標。光照和溫度等環(huán)境因素影響葉綠素的合成，CHLG的表達也受到影響。探究CHLG的表達對于苜蓿產(chǎn)量的影響具有重要意義。

豆科植物蒺藜苜蓿因生長周期短、倍性簡單、基因組小且序列已知等特點被作為模式植物應(yīng)用于豆科飼草的基礎(chǔ)研究中。本實驗在對蒺藜苜蓿葉綠素合成酶的進化關(guān)系和基因結(jié)構(gòu)分析的基礎(chǔ)上，克隆并研究了蒺藜苜蓿MtCHLG對光照/黑暗、脫落酸(abscisic acid, ABA)及聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)的響應(yīng)。同時，利用mtcao突變體確定了MtCAO與MtCHLG的上下游關(guān)系。對兩種秋眠級紫花苜蓿材料的分析發(fā)現(xiàn)，MsCHLG表達量與株高和單株產(chǎn)量成正相關(guān)。本研究結(jié)果暗示CHLG可以作為培育高產(chǎn)豆科飼草的備選基因。

1 材料與方法

1.1 植物材料與培養(yǎng)

1.1.1 植物材料蒺藜苜蓿生態(tài)型R108及本氏煙草種子由本實驗室保存。蒺藜苜蓿突變體種子(NF11809)購自美國諾貝研究所(Noble Research Institute)。紫花苜蓿種子來自美國國家植物種質(zhì)資源數(shù)據(jù)庫(The database of U.S. National Plant Germplasm System)。

1.1.2 材料培養(yǎng)與處理用砂紙將蒺藜苜蓿種子破除硬實后，放于浸濕的濾紙上，在4 ℃避光春化2 d后，轉(zhuǎn)入人工氣候培養(yǎng)箱。待其子葉張開后，一部分幼苗移至營養(yǎng)土(營養(yǎng)土∶蛭石=1∶1)中，放于人工氣候室。另一部分R108幼苗移至1/2 Hoagland營養(yǎng)液(西美杰)中，每7 d更換1次營養(yǎng)液。煙草種子在營養(yǎng)土中發(fā)芽，子葉張開后單株種植，在人工氣候室培養(yǎng)4周。培養(yǎng)條件為16 h光照/8 h黑暗，26 ℃/22 ℃，相對濕度為60%。紫花苜蓿于2016年種植于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院廊坊實驗基地。試驗為隨機完全區(qū)組設(shè)計，3個重復(fù)，每個重復(fù)包含5個單株，行距和株距均為65 cm，重復(fù)間單株間距30 cm，約10%單株處于開花期時測定株高和單株產(chǎn)量(第一茬)。

兩月齡蒺藜苜蓿R108的根、莖、葉、花、果莢用于MtCHLG組織差異性表達分析。一月齡的蒺藜苜蓿進行以下處理：1)在光照(黑暗)生長4 h后，轉(zhuǎn)入無光(連續(xù)光照)條件下2、4、8、12、24、36、48 h后收集葉片；2)ABA(100 μmol·L-1)或PEG(5%)在處理2、4、8、12、24 h后收集葉片。同時，從8點開始至次日8點，每隔4 h收集正常光照條件下的蒺藜苜蓿葉片，用于光周期分析。

1.2 方 法

1.2.1MtCHLG基因的克隆與載體構(gòu)建根據(jù)EnsemblPlants數(shù)據(jù)庫(https://plants.ensembl.org/index.html)中蒺藜苜蓿A17生態(tài)型MtCHLG基因序列(CDS)，通過Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物MtCHLG-F/R(表1)。按照植物總RNA提取試劑盒(Promega)說明提取蒺藜苜蓿R108的RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA(TaKaRa)，以cDNA為模板、使用ExTaq DNA聚合酶(TaKaRa)擴增目的片段。PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收(TransGen)，連接pEASY-T5載體(TransGen)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)(Trans-T1，TransGen)，挑取單菌落進行PCR鑒定并測序(北京天一輝遠生物技術(shù)有限公司)，保存序列正確的克隆(pEASY-T5-MtCHLG)。參照無縫克隆試劑盒(CloneSmarter)說明書克隆至載體pCAMBIA1302，以pEASY-T5-MtCHLG質(zhì)粒為模板，兩端帶有接頭的1302-MtCHLG-F/R為引物擴增的MtCHLG基因(表1)。使用限制性內(nèi)切酶NcoⅠ和BglⅡ(QuickCut，TaKaRa)酶切pCAMBIA1302質(zhì)粒，通過無縫克隆酶(50 ℃，15 min)將線性化載體和兩端帶有與載體同源序列的MtCHLG基因進行同源重組，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)并測序，獲得35S∷MtCHLG-GFP融合表達載體。

表1 本試驗所用引物

1.2.2 突變體基因型鑒定及基因表達分析參照植物基因組DNA試劑盒(康為世紀)說明書提取蒺藜苜蓿突變體的基因組DNA，利用Tnt1上的引物Tnt 1-F和基因特異引物qRT-MtCAO-F/R(表1)鑒定突變體。利用基因特異引物，參照TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ(TaKaRa)進行實時熒光定量PCR(ABI 7300 Real Time PCR System)。Actin基因作加樣量對照，每個樣品設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)，通過2-ΔΔCt計算[8]表達差異量。

1.2.3 亞細胞定位參照段梅[9]的方法進行煙草轉(zhuǎn)化。將含有對照、重組質(zhì)粒及基因沉默抑制子P19的農(nóng)桿菌液，按照1∶100的比例接種至含有抗生素(25 mg·L-1利福平，50 mg·L-1卡那霉素)的YEB液體培養(yǎng)基中，28 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600為0.8，以相同比例再次接菌培養(yǎng)至OD600為0.8～1.0。室溫離心菌液(5 000 r/min 10 min)，去除上清液后用懸浮緩沖液(10 mmol·L-1MgCl2、5 mmol·L-1MES、150 μmol·L-1乙酰丁香酮)重懸菌體到OD600為0.8～1.0，黑暗室溫靜置3 h后，按1∶1體積混合含目的載體和P19的菌液。通過注射器(去除針頭)注射煙草下表皮，標記注射位置，培養(yǎng)2～3 d，使用激光共聚焦顯微鏡(Leica TCS SP8)進行熒光檢測。

1.2.4 葉綠素的提取及含量測定將蒺藜苜蓿葉片0.1 g剪碎后置于10 mL乙醇(96%)中，黑暗條件下放置48 h使葉片完全脫色，使用超微量分光光度計分別測定在649和665 nm處的吸光值，計算葉綠素a和葉綠素b的含量[10]。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

通過ExPASy(https://www.expasy.org/)預(yù)測蛋白等電點、分子量以及親疏水性；SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)分析蛋白二級結(jié)構(gòu)；TMHMM2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預(yù)測蛋白跨膜結(jié)構(gòu)；TargetP-2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)預(yù)測葉綠體定位信號；Phyre2(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)預(yù)測蛋白三級結(jié)構(gòu)；MEGA7.0軟件通過鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹；DNAMAN軟件進行氨基酸序列比對；PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)分析啟動子區(qū)域(起始密碼子ATG上游2 kb)的順式作用元件。采用SPSS 26.0進行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果以平均值±標準差表示，使用TB tools、Excel 2016等作圖。通過TB tools進行相對表達量與株高和單株產(chǎn)量間的相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物CHLG的進化關(guān)系及基因結(jié)構(gòu)分析

用擬南芥CHLG(At3g51820)序列搜索植物數(shù)據(jù)庫EnsemblPlants(http://plants.ensembl.org/index.html)，選取水生植物、低等陸生植物和高等植物中的16個代表物種，分析其CHLG的進化關(guān)系。結(jié)果顯示，單細胞水生植物萊茵衣藻與低等陸生植物苔蘚中的CHLG各自屬于不同的分支，高等植物的CHLG屬于同一個分支。其中，單子葉植物和雙子葉植物的CHLG分為兩個獨立的亞支(圖1，A)。除水生植物外，個別陸生植物中有2個CHLG蛋白，暗示植物在向陸生演變的過程中CHLG的數(shù)目有所增加。基因結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，與低等植物相比，高等植物中除擬南芥CHLG基因含14個外顯子外，其余CHLG均由15個外顯子組成(圖1，B)。就長度來說，除首、尾兩個外顯子在不同物種中差異較大外，其余外顯子的長度基本保持不變(表2)，這可能是由于非編碼區(qū)(untranslated region, UTR)的長度各異造成的。另外，高等植物CHLG的內(nèi)含子明顯長于低等植物(圖1，B)?？梢?，CHLG在植物進化過程中，基因數(shù)目稍有增加，基因結(jié)構(gòu)相對一致，內(nèi)含子增長。該現(xiàn)象或許與綠色植物適應(yīng)陸地上更加復(fù)雜多樣的光照環(huán)境有關(guān)。

表2 代表性物種中CHLG基因的外顯子長度

2.2 蒺藜苜蓿MtCHLG的克隆及該蛋白亞細胞定位分析

類似于大多數(shù)植物，蒺藜苜蓿的MtCHLG由單基因(Mt7g069210)編碼(圖1)。從R108中擴增到MtCHLG的CDS為1 137 bp，編碼378個氨基酸。預(yù)測MtCHLG蛋白的分子量為40.82 kD，氨基酸的平均親水系數(shù)為0.343，為疏水性蛋白質(zhì)。該蛋白二級結(jié)構(gòu)主要以α-螺旋(41.27%)和無規(guī)卷曲(40.74%)為主，組成5個跨膜結(jié)構(gòu)域，主要集中在180～300個氨基酸之間(圖2，A)。三級結(jié)構(gòu)顯示，跨膜螺旋間基本保持相互平行圍成一個類似桶狀的結(jié)構(gòu)(圖2，B)。高等植物CHLG中，MtCHLG與其它豆科植物CHLG的相似性較高，與紫花苜蓿和大豆CHLG的相似性分別為99.2%和93.9%；與單子葉植物CHLG的相似性相對較低，與水稻和小麥CHLG的相似性分別為84.5%和82.6%。

MtCHLG.蒺藜苜蓿；MsCHLG.紫花苜蓿；GmCHLG.大豆；AiCHLG.落花生；CsCHLG.黃瓜；GhCHLG.陸地棉；NtCHLG.煙草；AtCHLG.擬南芥；AcCHLG.鳳梨；OsCHLG.水稻；SbCHLG.高粱；ZmCHLG.玉米；TaCHLG.小麥；HvCHLG.大麥；SmCHLG.江南卷柏；PpCHLG.小立碗蘚；CrCHLG.萊茵衣藻圖1 植物CHLG的進化樹及其基因結(jié)構(gòu)分析MtCHLG. Medicago truncatula; MsCHLG. Medicago sativa; GmCHLG. Glycine max; AiCHLG. Arachis ipaensis; CsCHLG. Cucumis sativus; GhCHLG. Gossypium hirsutum; NtCHLG. Nicotiana attenuate; AtCHLG. Arabidopsis thaliana; AcCHLG. Ananas comosus; OsCHLG. Oryza sativa; SbCHLG. Sorghum bicolor; ZmCHLG. Zea mays; TaCHLG. Triticum aestivum; HvCHLG. Hordeum vulgare; SmCHLG. Selaginella moellendorffii; PpCHLG. Physcomitrium patens; CrCHLG. Chlamydomonas reinhardtiiFig.1 Phylogenetic tree and gene structure analysis of CHLG in plants

利用TargetP2.0分析蛋白亞細胞定位情況，發(fā)現(xiàn)以上CHLG都含有葉綠體定位信號RAA/TE(圖2，C)。為了驗證MtCHLG的定位情況，分別將表達融合質(zhì)粒35S∷MtCHLG-GFP或?qū)φ召|(zhì)粒35S∷GFP的農(nóng)桿菌在煙草葉片中瞬時表達。熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，對照蛋白在煙草表皮細胞的細胞膜、細胞核以及葉綠體中均有綠色熒光信號。重組蛋白MtCHLG-GFP主要在煙草表皮細胞的葉綠體中有綠色信號(圖3)，表明MtCHLG是一個葉綠體定位蛋白。該結(jié)果與MtCHLG參與葉綠素合成相吻合。

A. MtCHLG跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測；B. MtCHLG三級結(jié)構(gòu)預(yù)測；C. 高等植物CHLG氨基酸序列保守性分析:MtCHLG.蒺藜苜蓿；MsCHLG.紫花苜蓿；GmCHLG.大豆；NtCHLG.煙草；ZmCHLG.玉米； AtCHLG.擬南芥；OsCHLG.水稻；TaCHLG.小麥。星號表示葉綠體定位信號，方框表示保守基序，橫線表示跨膜結(jié)構(gòu)域(Ⅰ—Ⅴ)圖2 MtCHLG的生物信息學(xué)分析A. Prediction of the transmembrane structure of MtCHLG; B. Prediction of the tertiary structure of MtCHLG; C. Sequence alignment of CHLGs in the indicated higher plants. MtCHLG. Medicago truncatula; MsCHLG. Medicago sativa; GmCHLG. Glycine max; NtCHLG. Nicotiana attenuate; ZmCHLG. Zea mays; AtCHLG. Arabidopsis thaliana; OsCHLG. Oryza sativa; TaCHLG. Triticum aestivum. Homology was highlighted by shading in color: dark bule for 100%, pink for 75%, and light blue for 50%. The asterisks indicate the predicted peptides for chloroplast localization, the conserved motifs were boxed, and the five transmembrane domains (Ⅰ-Ⅴ) were indicated by linesFig.2 Bioinformatic analysis of MtCHLG

圖3 MtCHLG-GFP融合蛋白在煙草中的亞細胞定位Fig.3 Subcellular localization of the MtCHLG-GFP recombinant protein in Nicotiana benthamiana

2.3 MtCHLG的表達模式分析

利用qRT-PCR對蒺藜苜蓿根、莖、葉、花和果莢中MtCHLG的表達量分析顯示，該基因在所檢測的組織中均有表達。其中，幼嫩葉片中表達量最高(圖4，A)。在24 h內(nèi)，MtCHLG的表達呈現(xiàn)出黑暗中下降，光照后逐漸升高的趨勢(圖4，B)。以上結(jié)果表明，MtCHLG主要在幼嫩綠色組織中表達，且表達水平受晝夜節(jié)律的影響。

A. MtCHLG組織表達分析；B. 葉片中MtCHLG的晝夜表達模式；C. MtCHLG 啟動子區(qū)域的順式作用元件預(yù)測；D. 光照/黑暗處理下葉片中MtCHLG的表達分析；E. 脫落酸/聚乙二醇處理下葉片中MtCHLG的表達分析。標準差來自3個生物學(xué)重復(fù)，同一處理間不同小寫字母代表差異顯著(P<0.05)圖4 蒺藜苜蓿MtCHLG的表達分析A. Expression of MtCHLG in the indicated tissues of Medicago truncatula; B. Expression of MtCHLG during 24 h; C. Prediction of the cis-acting elements in the promoter (2 kb) of MtCHLG; D. Expression of MtCHLG in leaves under light or darkness; E. Expression of MtCHLG in leaves by ABA or PEG treatment. Bars represent mean ± SD of the three biological replicates and different letters in lowercase between the same treatment indicate significant difference (P<0.05)Fig.4 The expression profile of MtCHLG

通過PlantCARE對MtCHLG啟動子(2 kb)區(qū)域順式作用元件的預(yù)測分析顯示，該區(qū)域含有光響應(yīng)元件，如GATA、GT1、GTGGC和TCT等，以及ABA響應(yīng)、茉莉酸甲酯(methyl jasmonate, MeJA)響應(yīng)和干旱響應(yīng)等順式作用元件(圖4，C)。對黑暗處理后蒺藜苜蓿中MtCHLG的表達量檢測發(fā)現(xiàn)，處理2 h其相對表達量降低了33%(P<0.05)，隨著黑暗處理的延長，MtCHLG的表達急劇下降，在12 h降為對照的3.4%；處理2 d之內(nèi)其表達量基本維持在該水平(圖4，D)?？梢姡诎堤幚硪种芃tCHLG的表達。相反的，在光照處理下，MtCHLG表達量緩慢增加，8 h時達到頂峰(約為對照的5.23倍，P<0.05)；光照時間延長到12 h時表達量為對照的2.90倍；光處理24～48 h間，表達水平維持在對照的1.66～2.32倍(圖4，D)。因此，MtCHLG的表達受光誘導(dǎo)。另外，ABA(100 μmol·L-1)處理2 h，MtCHLG急速降低為對照的26%(P<0.05)，此后緩慢下降，24 h內(nèi)維持在處理前的13%(圖4，E)。即，ABA處理快速降低MtCHLG的表達水平。在用PEG(5%)處理模擬干旱試驗中，MtCHLG表達量緩慢減少后又稍有回升，處理12 h時約為對照的1.26倍；增加處理時間至24 h，其表達量降低到對照的42%(圖4，E)。由此，PEG處理影響MtCHLG的表達，24 h連續(xù)處理有顯著的抑制作用。

2.4 MtCHLG與葉綠素酸酯a加氧酶基因(MtCAO)的關(guān)系

研究表明植物CHLG能分別催化葉綠素酸酯a和葉綠素酸酯b生成葉綠素a和葉綠素b[11-12]。該反應(yīng)是葉綠素生物合成的最后一步(圖5，A)。對蒺藜苜蓿葉綠素酸酯a加氧酶基因突變體mtcao(NF11809)進行基因型鑒定發(fā)現(xiàn)，Tnt1反向插入Mt1g030480(MtCAO)的第二個外顯子(圖5，B、C)，且為純合突變體。該突變體植株矮小，葉色發(fā)黃(圖5，D)。與野生型相比，突變體在轉(zhuǎn)錄水平上幾乎檢測不到MtCAO的表達(圖5，E)，說明該純合體為MtCAO功能缺失突變體。葉綠素含量測定結(jié)果顯示，突變體葉片中葉綠素a及葉綠素b分別降低43%和97%(圖5，F(xiàn))，導(dǎo)致其葉綠素a/b的比值升為野生型的12倍左右(30.29 vs 2.56)(圖5，G)。定量分析發(fā)現(xiàn)，該突變體中MtCHLG的表達量約為野生型的44.4%(圖5，H)。以上結(jié)果表明，在葉綠素生物合成途徑中MtCHLG位于MtCAO的下游。

A. 葉綠素生物合成途徑簡要示意圖[2]；B. 突變體MtCAO基因結(jié)構(gòu)及Tnt1插入位點示意圖；C. 突變體基因型PCR鑒定；D. 兩月齡野生型蒺藜苜蓿(WT)和突變體(mtcao)植株；E. MtCAO的表達分析；F. 葉片中葉綠素含量比較；G. 野生型蒺藜苜蓿(WT)和突變體(mtcao)葉綠素a/b比值比較；H. 野生型蒺藜苜蓿(WT)和突變體(mtcao)MtCHLG的表達分析。E-H中不同小寫字母代表差異顯著(P<0.05)圖5 蒺藜苜蓿MtCHLG 在葉綠素生物合成途徑中位于MtCAO基因的下游A. Brief schematic diagram of the chlorophyll biosynthesis pathway showing the steps of the three rate-limiting enzymes and CHLG; B. Schematic diagram of MtCAO gene structure and Tnt1 insertion site of mtcao; C. Genotyping of the mtcao mutant; D. Image of two-month-old wild type and mtcao; E. Expression of MtCAO by RT-qPCR; F. Comparison of Chlorophyll content in the two genotypes; G. Comparison of chlorophyll a/b between wild type and mutant; H. Comparison of expression of MtCHLG by RT-qPCR between wild type and mutant. Bars represent the mean ± SD of three biological replicates and different letters in lowercase in E to H indicate significant difference (P<0.05)Fig.5 MtCHLG is downstream of MtCAO in chlorophyll biosynthesis pathway

2.5 紫花苜蓿MsCHLG的表達水平與株高正相關(guān)

先前的研究表明多數(shù)葉綠素合成基因表達水平影響植物地上生物量[13-14]。目前，蒺藜苜蓿是基因組序列已知、基因功能注釋較完整，且與豆科飼草紫花苜蓿親緣關(guān)系最近的模式植物。序列同源性分析表明，紫花苜蓿MsCHLG與MtCHLG的氨基酸序列高度相似(99.2%)。對隨機選取的兩種秋眠級(FD4和FD8)的紫花苜蓿材料(各5份)測定株高，結(jié)果顯示，高秋眠級材料的株高約為低秋眠級材料的2.5～3.5倍。同時，高秋眠級材料的平均產(chǎn)量約為低秋眠級材料的2.1倍(P<0.05，表3)。對紫花苜蓿葉片中MsCHLG的表達量分析發(fā)現(xiàn)，該基因在高秋眠級紫花苜蓿中的轉(zhuǎn)錄水平略高于低秋眠級材料(1.2～1.5倍，表3)。相關(guān)性分析顯示，MsCHLG的表達量與株高和產(chǎn)量的相關(guān)系數(shù)分別為0.68(P<0.05)和0.72(P<0.05)(表4)，表明該基因的轉(zhuǎn)錄水平與株高和產(chǎn)量均成正相關(guān)。以上結(jié)果暗示，葉綠素合成酶基因MsCHLG的表達量或許可以作為苜蓿產(chǎn)量早期預(yù)測的參考指標。

表3 紫花苜蓿兩種秋眠級材料的株高、單株產(chǎn)量和MsCHLG的相對表達量分析

表4 MsCHLG相對表達量與株高和單株產(chǎn)量間的相關(guān)性分析

3 討 論

高等植物葉綠素的合成是由15種酶催化完成的[2]。其中，葉綠素合成酶CHLG負責(zé)葉綠素生物合成的最后一步，即催化葉綠素酸酯a和葉綠素酸酯b分別生成葉綠素a和葉綠素b[15-16]。缺失該基因的植物通常表現(xiàn)為葉色淺綠或黃化[1, 4]。同時，葉綠素含量降低在一定程度上能抑制葉綠體發(fā)育，降低光合效率，導(dǎo)致植株生長遲緩甚至死亡[17]。本研究克隆并初步分析了蒺藜苜蓿葉綠素合成酶基因(MtCHLG)的表達模式、蛋白的亞細胞定位及該基因與MtCAO的上下游關(guān)系，發(fā)現(xiàn)紫花苜蓿同源基因MsCHLG的表達量與株高和產(chǎn)量成正相關(guān)，暗示CHLG可作為培育高產(chǎn)豆科飼草的備選基因。

植物CHLG屬于UbiA超家族[18]，基因結(jié)構(gòu)和蛋白功能域相對保守。就進化關(guān)系來說，低等植物與高等植物的CHLG相對較遠，二者基因的外顯子/內(nèi)含子組成稍有差異。絕大部分的CHLG由單基因編碼，且高等植物CHLG具有更長的內(nèi)含子。推測植物進化過程中CHLG基因數(shù)目稍有增加及其內(nèi)含子明顯加長的現(xiàn)象可能與高等植物逐漸適應(yīng)陸地復(fù)雜多樣的光照條件有關(guān)。

MtCHLG主要在綠色組織中表達且受光照等因素的影響。植物在接收到光照信號后，參與光信號的轉(zhuǎn)錄因子通過結(jié)合葉綠素合成基因啟動子上的光響應(yīng)元件調(diào)控下游靶基因的表達[19]。MtCHLG基因的啟動子區(qū)域含有多個光響應(yīng)元件，且定量分析發(fā)現(xiàn)該基因受光照誘導(dǎo)和黑暗抑制。這種晝增夜降的趨勢與大多數(shù)葉綠素合成基因的晝夜節(jié)律類似，如煙草谷氨酰-tRNA還原酶(Glutamyl-tRNA reductase, GluTR)編碼基因HEMA及擬南芥Mg-螯合酶(Magnesium chelatase, MgCH)I、D、H亞基基因(CHLI，CHLD和CHLH)的表達都具有晝夜節(jié)律[20-21]。延長光照處理MtCHLG表達量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，這與番茄幼苗中葉綠素a和b的含量隨光照時間增加先增多后減少一致，說明適當增加光照時間有助于光合色素的合成，而光照時間過長會使植株產(chǎn)生光抑制的現(xiàn)象[22]。這可能是由于植物的光反應(yīng)中心接收和儲存的光子數(shù)飽和后多余的光子無法進行光合作用[23]。另外，ABA(100 μmol·L-1)對MtCHLG的表達有抑制作用。類似的，荔枝(Litchichinensis)果皮中葉綠素合成基因的表達受外源ABA抑制，該處理同時促進了某些葉綠素降解基因的表達[24]，加速了葉綠素降解。PEG模擬的干旱處理蒺藜苜蓿24 h，MtCHLG表達水平約降低了一半。先前實驗發(fā)現(xiàn)，在干旱脅迫下，白刺(Nitrariatangutorum)葉片中NtCHLG表達量下降，葉綠素a和葉綠素b的合成減少[25]。

MtCHLG是MtCAO的下游基因，且紫花苜蓿中CHLG的表達水平與株高和產(chǎn)量成正相關(guān)關(guān)系。MtCAO是葉綠素生物合成的最后一個限速酶，催化葉綠素酸酯a轉(zhuǎn)化為葉綠素酸酯b[26]。mtcao突變體葉綠素b含量顯著減少，主要是由于葉綠素b合成的前體葉綠素酸酯b生成受阻。該突變體中MtCHLG的表達量顯著降低，表明MtCHLG位于MtCAO下游。MtCHLG既是葉綠素a又是葉綠素b合成的催化酶[15-16]，還同時參與葉綠素生物合成途徑的反饋調(diào)控[1]。生產(chǎn)中，植物葉綠素含量低通常表現(xiàn)為植物生長遲緩，植株矮小，生物量低[17]。豆科飼草紫花苜蓿的MsCHLG與MtCHLG蛋白高度同源(99.2%)。高、低兩種秋眠級(FD4和FD8)的紫花苜蓿材料在株高、單株產(chǎn)量和葉片中MsCHLG的表達水平上都存在顯著差異。而且，株高和單株產(chǎn)量與MsCHLG的表達水平顯著正相關(guān)。本實驗的產(chǎn)量數(shù)據(jù)來自第一茬，后續(xù)有待對不同茬次株高、生物量與MsCHLG表達量的相關(guān)性進行分析。

葉綠素合成酶是葉綠素a和葉綠素b生物合成的催化酶。本文通過對綠色植物中CHLG的進化關(guān)系和基因結(jié)構(gòu)分析證明了CHLG是一類結(jié)構(gòu)和功能域保守的基因。豆科模式植物蒺藜苜蓿中，MtCHLG-GFP融合蛋白主要定位在葉綠體。RNA水平上，MtCHLG在綠色組織中高豐度表達，且表達水平受光照誘導(dǎo)和黑暗抑制。葉綠素酸酯a 加氧酶(MtCAO)的功能缺失導(dǎo)致MtCHLG轉(zhuǎn)錄水平約減少了一半，表明MtCHLG位于MtCAO的下游。另外，紫花苜蓿MsCHLG的表達水平與株高和單株產(chǎn)量顯著正相關(guān)，暗示CHLG可以作為培育高產(chǎn)豆科飼草的備選基因。后期將利用基因編輯技術(shù)創(chuàng)制MtCHLG敲除蒺藜苜蓿突變體，分析其葉綠素含量及植株生物量，確定MtCHLG的生物學(xué)功能。