◎ 馮慧慧，楊亞琴，余明霞，曹 秀，李圓圓，郝學(xué)飛

（河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室（鄭州），河南 鄭州 450002）

隨著人們生活水平的提高，畜禽肉類食品在人們?nèi)粘ｏ嬍辰Y(jié)構(gòu)中所占的比例逐漸增大，隨之而來的畜禽產(chǎn)品中獸藥殘留問題引起了人們高度的重視。由于現(xiàn)在畜禽產(chǎn)品養(yǎng)殖規(guī)模大、密度高，疾病傳播速度快，為有效預(yù)防和控制疾病的發(fā)生和發(fā)展，抗生素類[1]、抗病毒類[2]等藥物的使用在養(yǎng)殖業(yè)中已經(jīng)不可避免。但由于某些養(yǎng)殖場飼養(yǎng)員專業(yè)技能不足，缺少獸藥使用的專業(yè)知識，沒有嚴格按照標準進行投放，或者沒有控制好藥物的使用量和時間，造成獸藥在養(yǎng)殖業(yè)中濫用，導(dǎo)致畜禽產(chǎn)品體內(nèi)的藥物經(jīng)食用后在人體富集，對人體健康構(gòu)成威脅。

目前國內(nèi)關(guān)于畜禽產(chǎn)品中獸藥殘留的檢測標準[3-5]大多是針對單一類別化合物的檢測，完成一個樣品多種獸藥殘留檢測需要進行多次實驗，存在耗時、耗力、污染環(huán)境且效率低等問題；且現(xiàn)在所用的獸藥呈現(xiàn)多樣化特征，結(jié)構(gòu)性質(zhì)差異較大，多種藥物同時檢測成為獸藥殘留檢測技術(shù)的難題。近年來，研究者一直在探索更簡單、更準確的方式進行檢測，多種獸藥殘留同時檢測技術(shù)也取得一定進展[6-17]。

本研究是以雞肉為基質(zhì)，對40種獸藥進行同時分析，在前處理方法中結(jié)合使用津楊公司新型強效除脂型ECS固相萃取柱進行凈化，研制出了前處理簡單易操作、結(jié)果準確可靠的檢測方案，節(jié)約了檢測成本，大幅度提高了檢測效率，為雞肉中多種獸藥快速篩查工作提供技術(shù)支持。

1 材料和方法

1.1 試驗儀器

Shimadzu LC-MS/MS 8050液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（日本島津公司）；色譜柱C18柱（100 mm×2.0 mm，3 μm）（日本資生堂公司）；PGC 4502i電子天平[精確至0.01 g，艾德姆衡器（武漢）有限公司]；AE 240電子天平[精確至0.01 mg，梅特勒-托利多公司]；飛鴿GL-21B高速冷凍離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）；QGC-36T氮氣吹干儀（上海泉島公司）；SKQ-500DE型數(shù)控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；SK-1快速混勻器（金壇市白塔新寶儀器廠）；Milli-Q超純水儀（美國Milliore公司）。

1.2 材料和試劑

乙腈、甲醇：色譜純（德國Merck公司）；甲酸銨：色譜純（德國CNW公司）；甲酸：色譜純（賽默飛世爾科技公司）；固相萃取柱：ECS（200 mg/ 6 mL，吳橋津楊過濾器材廠）；40種獸藥標準品 （德國Dr. Ehrensorfer公司和BE PURE公司）；實驗用水為Milli-Q超純水；雞肉樣品：市售。

1.3 試驗方法

（1）樣品提取。準確稱取事先均質(zhì)好的雞肉樣品2 g（精確到0.01 g）于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈，渦旋混勻1 min，室溫下超聲提取30 min，于高速離心機8 000 r·min-1離心5 min，取上清液待過柱凈化。

（2）樣品凈化。將全部上清液轉(zhuǎn)移至ECS固相萃取柱凈化，保持流速1～2滴/s，收集全部濾液，40 ℃氮氣吹至近干，加入0.5 mL乙腈超聲溶解，補加0.5 mL的0.2%甲酸水溶液，渦旋混勻，過0.22 μm微孔濾膜，待上機測定。

1.4 儀器條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱：資生堂C18柱（100 mm×2.0 mm，3 μm）； 柱溫：40 ℃；進樣體積：2 μL；流動相A路：5 mmol·L-1甲酸-甲酸銨水溶液；流動相B路：甲醇∶乙腈（V∶V=1∶1）；流速：0.2 mL·min-1；梯度洗脫程序見表1。

表1 液相梯度洗脫程序表

1.4.2 質(zhì)譜條件

電離方式：ESI（除地塞米松為負離子模式，其他化合物均為正離子模式）；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；霧化氣：空氣，3.0 L·min-1；干燥氣：氮氣，10.0 L·min-1；加熱氣：空氣，10.0 L·min-1；離子源接口溫度：300 ℃；脫溶劑管溫度：250 ℃；加熱模塊溫度：400 ℃；各化合物質(zhì)譜采集信息詳見表2。

表2 40種化合物多反應(yīng)監(jiān)測參數(shù)表

續(xù)表2

1.5 基質(zhì)匹配標準曲線

取5份空白雞肉經(jīng)前處理氮吹近干后的殘余物，依次配制加入2 ng·mL-1、5 ng·mL-1、10 ng·mL-1、20 ng·mL-1和50 ng·mL-1的40種藥物混合標準溶液1 mL，完全溶解后制得空白雞肉匹配基質(zhì)系列標準工作液總離子流圖見圖1。

圖1 40種藥物總離子流圖

2 結(jié)果與分析

2.1 線性結(jié)果

以質(zhì)量濃度為橫坐標，各個化合物定量離子對峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，40種藥物的相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.99。

2.2 添加回收結(jié)果

將空白雞肉樣品進行2.0 μg·kg-1、5.0 μg·kg-1和10.0 μg·kg-1濃度加標后，按照上述前處理方法處理后上機，平行測定6份樣品，考察回收率和相對標準偏差（RSD），具體結(jié)果見表3。

表3 40種化合物添加回收率和RSD結(jié)果表（單位：%)

續(xù)表3

2.3 靈敏度

采用向空白雞肉樣品中逐級降低添加目標化合物的方法來確定檢出限（LOD）和定量限（LOQ）。以定量離子3倍信噪比（S/N=3）對應(yīng)的目標化合物濃度作為檢出限，以10倍信噪比（S/N=10）對應(yīng)的目標物濃度為定量限。40種藥物的定量限為0.2～1.0 μg·kg-1，均可滿足日常檢測的要求。

2.4 實際樣品檢測

用本文所建立的方法，對超市和農(nóng)貿(mào)市場上購買的15份雞肉樣品進行檢測，有1份樣品檢出恩諾沙星和磺胺二甲嘧啶，含量分別為8.74 μg·kg-1和40.6 μg·kg-1，均未超過食品安全國家標準（GB 31650—2019）對于食品中獸藥殘留最大限量要求，為合格樣品。檢測過程中通過空白添加的方式進行質(zhì)控，其中恩諾沙星和磺胺二甲嘧啶的回收率分別為90.2%和85.4%，符合國家標準對回收率范圍的要求，進一步說明該方法數(shù)據(jù)準確、可靠，適用于雞肉中多種獸藥殘留同時檢測。

3 討論

3.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

根據(jù)40種獸藥的化學(xué)性質(zhì)，通過電噴霧離子源正離子和負離子模式掃描分析得到40種獸藥的前體離子；再對前體離子進行二級質(zhì)譜掃描得到產(chǎn)物離子，選取其中豐度最強、干擾較小的2個離子碎片作為監(jiān)測離子，并對其電壓和碰撞能量進行優(yōu)化。

3.2 提取溶劑的選擇

針對所檢測藥物的性質(zhì)，多種獸藥殘留檢測時多選擇甲醇、乙腈等溶液或不同酸度的甲醇、乙腈作為提取溶劑。本文比較了甲醇和乙腈作為提取劑時的實驗過程和回收率（加標含量為10.0 μg·kg-1），當選用甲醇作為提取劑時，發(fā)生提取液出現(xiàn)白色渾濁、用固相萃取柱凈化時速度偏慢等問題，說明其沉淀蛋白和去除脂肪的能力較弱，且回收率低于用乙腈作為提取液時的回收率。隨后又考察不同酸度的乙腈（乙腈、0.1%甲酸-乙腈、0.2%甲酸-乙腈、0.5%甲酸乙腈）作為提取劑，實驗結(jié)果表明，隨著酸度不斷提高，喹諾酮類化合物的回收率呈小幅度上升趨勢，但磺胺類藥物回收率隨著酸度增加呈下降趨勢，其他種類藥物變化不大。統(tǒng)籌考慮，實驗選用乙腈做為提取劑，提取效果優(yōu)于其他提取試劑的提取效果。

3.3 固相萃取柱的選擇

本實驗中所采用津楊過濾器材廠提供的新型ECS固相萃取柱進行凈化，能夠有效去除雞肉中蛋白、脂肪、磷脂等干擾物，減少對目標化合物的影響。與傳統(tǒng)的固相萃取柱相比，不需要活化、淋洗、洗脫等步驟，節(jié)約人力和大量的有機試劑，減少人體傷害和環(huán)境污染。

4 結(jié)論

本實驗運用新型固相萃取柱凈化，通過對前處理條件和質(zhì)譜條件進行優(yōu)化，最終建立了同時檢測雞肉中磺胺類、喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類、抗病毒類、鎮(zhèn)定劑及糖皮質(zhì)激素等6大類共40種藥物的液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測方法，并對所建方法進行方法學(xué)驗證和實際樣品檢測，進一步驗證該方法適用于大批量雞肉樣本中多種獸藥殘留同時檢測的需要，能夠快速、準確提供檢測數(shù)據(jù)，為有效控制雞肉產(chǎn)品質(zhì)量提供技術(shù)支撐，保障食品安全。