尹凌皓，辛 瑞，郝博宇，覃菲菲，傅曉升，李茹月，孫 娟,2，張秀霞,2，李 婧

(1.中國石油大學(xué)(華東) 環(huán)境與安全工程系，山東 青島 266580；2.石油石化污染物控制與處理國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206)

目前世界發(fā)現(xiàn)的原油資源量為1.4×1012～2.0×1012t，其中，超過2/3為稠油和瀝青，中國稠油資源量超過200×108t，分布于12個沉積盆地的70多個油田，目前投入商業(yè)開發(fā)的動用地質(zhì)儲量約為14×108t[1]。稠油的開采、煉制造成的土壤環(huán)境問題日益突出，單井的落地原油量甚至可達(dá)其產(chǎn)量的2%。因此，如何去除土壤環(huán)境中的稠油污染物成為亟需解決的問題。生物修復(fù)，即利用生物特別是微生物來降解環(huán)境中石油類污染物的受控或自發(fā)過程[2]，具有修復(fù)徹底、無二次污染等優(yōu)點(diǎn)。但是，由于稠油的黏度比較大，以膠質(zhì)、瀝青質(zhì)為代表的重組分含量高，組分分子碳鏈長，生物利用度低，導(dǎo)致微生物對稠油的降解效果較差[3]。

膠質(zhì)和瀝青質(zhì)是稠油中極性強(qiáng)、相對分子質(zhì)量大的組分，也是造成稠油黏度大、難降解的主要原因[4]。國內(nèi)外有關(guān)降解膠質(zhì)、瀝青質(zhì)的特異性菌種研究較少，且以稠油為唯一碳源篩選出的降解菌對稠油膠質(zhì)、瀝青質(zhì)的降解率極低[3]。同時，對稠油降解、降黏的研究通常以單一微生物為研究內(nèi)容[5]，而對多菌種構(gòu)建菌群協(xié)同降解、降黏的研究很少。Lavania等[6]采用Garciaellapetrolearia(TERIG02)對瀝青質(zhì)進(jìn)行降解，TERIG02 可通過分解瀝青質(zhì)，降低原油平均相對分子質(zhì)量來降低其黏度。Yasaman等[7]利用原油樣品中分離到的本源細(xì)菌對原油樣品中的瀝青質(zhì)進(jìn)行生物降解，瀝青質(zhì)生物降解率最高達(dá)41.95%，碳、氫、氮元素的含量明顯降低。Gao等[8]從含油土壤中分離得到的2株銅綠假單胞菌，能有效降解原油中難降解的瀝青質(zhì)，使重質(zhì)組分轉(zhuǎn)化為輕質(zhì)組分，改變了原油的理化性質(zhì)，尤其降低了原油的黏著力和黏度。Pourfakhraei等[9]用Daedaleopsissp.處理稠油后發(fā)現(xiàn)稠油的重組分(C24+)含量減少，輕組分(C24-)含量增加；進(jìn)而利用真菌對瀝青質(zhì)、蒽和二苯并呋喃進(jìn)行降解，其降解率分別為88.7%、93.7%和91.2%。這些研究多以稠油重質(zhì)組分的降解菌篩選為目標(biāo)，很少單獨(dú)篩選降黏菌，更沒有考察二者復(fù)配的協(xié)同增效作用。另外，單一菌株往往只適于降解一種或幾種稠油組分，如：多數(shù)石油烴降解菌對膠質(zhì)、瀝青質(zhì)鮮有降解效果，且代謝產(chǎn)生生物表面活性劑，從而實(shí)現(xiàn)稠油降黏的效果較差[10-11]。因此，篩選不同功能的菌株并進(jìn)行復(fù)配，構(gòu)建稠油降解、降黏效果最優(yōu)的菌群具有重要的意義。

筆者將實(shí)驗(yàn)室前期篩選的2株高效稠油降解菌、2株高效稠油降黏菌、1株膠質(zhì)瀝青質(zhì)降解菌進(jìn)行復(fù)配，以菌群對稠油的降解率及菌液表面張力為指標(biāo)，構(gòu)建高效稠油降解降黏菌群；探究降解溫度、菌液pH值及接種量對菌群降解、降黏稠油效果的影響，確定最佳降解條件；利用元素分析、紅外光譜和GC-MS對菌群降解前后稠油的H/C比、官能團(tuán)及族組成變化進(jìn)行分析，評價(jià)優(yōu)選菌群的降解、降黏性能，以期為稠油污染土壤的生物修復(fù)提供支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

菌種：各菌種菌株提取自原油污染土壤，包括：2株高效稠油降解菌Y4(蒼白桿菌，Ochrobactrumanthropistrain CON21)和Y5(無色桿菌，Achromobacterpulmonisstrain PI3-03)；2株高效稠油降黏菌Y6(不動桿菌，Acinetobactersp.RS206)和Y8(銅綠假單胞菌，Pseudomonasaeruginosastrain DSM 50071)；1株高效膠質(zhì)、瀝青質(zhì)降解菌L4(不動桿菌，Acinetobactersp.strain ZX-15)。

培養(yǎng)基：實(shí)驗(yàn)使用的培養(yǎng)基有LB培養(yǎng)基和無機(jī)鹽培養(yǎng)基，其pH值均為7.5，組成如下：

(1)LB培養(yǎng)基：牛肉膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，氯化鈉5.0 g，蒸餾水1.0 L；

(2)無機(jī)鹽培養(yǎng)基：氯化鈉5.0 g，硫酸銨1.0 g，七水硫酸鎂0.25 g，硝酸鈉2.0 g，磷酸二氫鉀4.0 g，磷酸氫二鉀7.6 g，去離子水1.0 L。

試劑：胰蛋白胨、牛肉浸膏、瓊脂粉、氯化鈉、氫氧化鈉、七水硫酸鎂、無水磷酸氫二鉀、三水合磷酸二氫鈉、硝酸鈉、硫酸銨、石油醚(沸程 60～90 ℃)、石油醚(沸程 30～60 ℃)、無水乙醇，均為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。稠油來自勝利油田稠油廠(20 ℃時，其黏度為2750.6 mPa·s，密度為0.935 g/cm3)。

儀器：紫外可見分光光度計(jì)，UV-6000PC型，上海元析儀器公司產(chǎn)品；元素分析儀，Vario EL Ⅲ型，德國Elementar公司產(chǎn)品；傅里葉變換紅外光譜儀，Antaris型，美國尼高力公司產(chǎn)品；高溫模擬蒸餾儀，456-GC型，美國天美公司產(chǎn)品；全自動表面張力儀，QBZY-1型，上海方瑞儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 稠油降解率的計(jì)算

將菌株于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，按體積分?jǐn)?shù)5%取生長對數(shù)期的菌液5 mL加入到95 mL的降解培養(yǎng)基中，作為實(shí)驗(yàn)組樣品；設(shè)稠油質(zhì)量與實(shí)驗(yàn)組完全相同、不加菌液的樣品為空白對照。35 ℃于恒溫?fù)u床培養(yǎng)10 d(160 r/min)，采用紫外分光光度法[12]在第10 d測定培養(yǎng)基的含油量，并計(jì)算稠油降解率。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置2個平行樣，計(jì)算結(jié)果取平均值。稠油降解率計(jì)算公式：

η=(C0-C)/C0×100%

(1)

式中：η為稠油降解率，%；C0和C為空白樣品和實(shí)驗(yàn)樣品中稠油質(zhì)量濃度，mg/L。

1.3 菌液表面張力測定

降黏菌在生長過程中會分泌生物表面活性劑，可以降低菌液的表面張力，同時也可以降低稠油的黏度。研究表明，稠油降黏率和菌株產(chǎn)表面活性劑的能力呈正相關(guān)，菌液表面張力越小，則菌液對稠油的降黏率越高，因此可以用表面張力值的高低來間接表征菌群的降黏性能[13-20]。

采用表面張力儀鉑金板法測定菌液上清液的表面張力，將鉑金板緩慢浸入菌液中，在浸入狀態(tài)下由感應(yīng)器感測鉑金板受力的平衡值，并將其轉(zhuǎn)換為上清液的表面張力值。每種菌測定3次，計(jì)算平均值。

1.4 菌群復(fù)配方法

按體積比VY4∶VY5=1∶1將Y4和Y5復(fù)配作為復(fù)合高效石油烴降解菌，記為a；按體積比VY6∶VY8=1∶1將Y6和Y8復(fù)配作為復(fù)合高效稠油降黏菌，記為b；將L4作為高效膠質(zhì)、瀝青質(zhì)降解菌，記為c；各菌種的復(fù)配比例如表1所示。其他菌種復(fù)配條件為：降解溫度35 ℃，pH=7.5，稠油質(zhì)量濃度2 g/L，菌群接種體積分?jǐn)?shù)5%，氯化鈉質(zhì)量濃度4 g/L。降解10 d后，測定石油烴降解率及下層菌液的表面張力[21]。

表1 菌群的復(fù)配方法Table 1 The method of compounding consortium

1.5 菌群降解、降黏影響因素考察方法

為探究溫度對菌群降解降黏性能的影響，在pH=7.5，稠油質(zhì)量濃度2 g/L，接種體積分?jǐn)?shù)5%，氯化鈉質(zhì)量濃度4 g/L不變的條件下，調(diào)整溫度分別為20、25、30、35、40 ℃，培養(yǎng)10 d后測菌液表面張力和稠油質(zhì)量濃度，計(jì)算得稠油降解率。

為探究pH值對菌群降解降黏性能的影響，在溫度35 ℃，稠油質(zhì)量濃度2 g/L，接種體積分?jǐn)?shù)5%，氯化鈉質(zhì)量濃度4 g/L不變的條件下，分別調(diào)整培養(yǎng)基pH值為5、6、7、7.5、8、9，培養(yǎng)10 d后測菌液表面張力和稠油質(zhì)量濃度，計(jì)算得稠油降解率。

為探究菌液接種量對菌群降解降黏性能的影響，在溫度35 ℃，pH=7.5，稠油質(zhì)量濃度2 g/L，氯化鈉質(zhì)量濃度4 g/L不變的條件下，調(diào)整菌液接種體積分?jǐn)?shù)為1%、2%、3%、5%、6%、8%、10%，培養(yǎng)10 d后測菌液表面張力和稠油質(zhì)量濃度，計(jì)算得稠油降解率。

1.6 分析方法

使用元素分析儀測定降解前后稠油中C、H、N、S等元素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，計(jì)算氫/碳原子比(H/C)，對比稠油降解前后元素組成變化情況，分析稠油中有機(jī)化合物的定量組成和結(jié)構(gòu)[22-23]。

利用配有DTGS檢測器的傅里葉變換紅外光譜儀對降解前后的稠油組分分子官能團(tuán)進(jìn)行對比分析，研究菌群的降解性能。

用索氏抽提器提取稠油培養(yǎng)基中的油通過GC-MS測定稠油的組成，獲得稠油的高分辨率質(zhì)譜圖。根據(jù)GC-MS結(jié)果做出豐度隨時間變化圖，得到降解前后稠油的族組成圖[24]，并通過族組成圖分析稠油中輕、重組分的降解和轉(zhuǎn)化，以及降解、降黏菌群對不同組分的降解性能[13]。

2 結(jié)果與討論

2.1 稠油降解降黏菌群的構(gòu)建

稠油是由多種烴類化合物以及少量硫化物、氮化物、環(huán)烷酸類化合物等有機(jī)物組成的復(fù)雜混合物，不同種屬的菌株降解稠油的組分和途徑不盡相同，因而構(gòu)建菌群、利用菌株間的協(xié)同作用，往往能比用單個菌株的降解效果更好[14-17]。因此，將Y4、Y5、Y6、Y8、L4進(jìn)行復(fù)配，構(gòu)建了稠油降解、降黏菌群，綜合考察不同復(fù)配比例下菌群對稠油的降解和降黏能力，優(yōu)選降解能力最高、降黏能力較好的菌群復(fù)配比例[18-19]。

不同復(fù)配比例菌群以及相同接種體積分?jǐn)?shù)的Y4、Y5單菌種對稠油的石油烴降解率和菌液表面張力如圖1所示。由圖1可知,降解10 d后，單一菌種(Y4、Y5)對稠油的降解率均僅為23%左右。這說明復(fù)配菌群中各菌種之間存在協(xié)同作用，其對稠油的降解性能明顯好于單一菌種；H復(fù)配菌群對石油烴的降解率最高，可達(dá)到45.78%。同時，H菌群的菌液表面張力為40.7 mN/m，接近表面張力最低的I菌群(38.7 mN/m)。這是因?yàn)閺?fù)配菌群中降黏菌Y6、Y8在稠油降解過程中代謝產(chǎn)生表面活性劑可以降低稠油黏度、提高稠油的生物利用度，并提高稠油降解菌和膠質(zhì)瀝青質(zhì)降解菌的降解速率[25-26]。綜合考慮稠油降解和降黏效果，選擇H復(fù)配菌群，即Va∶Vb∶Vc=2∶1∶2(VY4∶VY5∶VY6∶VY8∶VL4=2∶2∶1∶1∶4)，為稠油降解、降黏的最優(yōu)菌群。

圖1 不同復(fù)配比例的菌群和Y4、Y5單菌種對石油烴的降解率和菌液表面張力Fig.1 The degradation rate of petroleum hydrocarbon and the surface tension of the consortium with different compound ratios and Y4/Y5 strainsDegradation conditions:t=10 d;T=35 ℃;pH=7;φ(Inoculation bacterials)=5%

2.2 稠油降解條件的優(yōu)化

由于菌群是一個內(nèi)部相互影響的復(fù)雜協(xié)作體，不同菌種間在對稠油降解和降黏方面可能相互影響，因此菌群的降解條件和單一菌種可能不完全一致。為了使菌群之間更好的發(fā)揮協(xié)同效應(yīng)，提高其對稠油的降解、降黏性能，進(jìn)一步探究、優(yōu)化了菌群對稠油的降解、降黏條件，如菌種降解稠油的溫度、培養(yǎng)基pH值、菌液接種量等[27-28]，測定了不同條件下稠油的降解率和菌液表面張力變化。

2.2.1 溫度

按照Va∶Vb∶Vc=2∶1∶2的最優(yōu)復(fù)配比例，不同溫度下菌群對稠油的降解率和菌液表面張力見圖2。由圖2可知：菌群在20～40 ℃時的稠油降解率均在30%以上；在30～35 ℃間，菌群最為活躍，降解效果較好；當(dāng)降解溫度為35 ℃、當(dāng)pH=7.5時，稠油降解率高達(dá)44.12%，此時菌液的表面張力最低。這說明35 ℃時菌群的整體活性最高，能迅速降解稠油組分，并產(chǎn)生大量生物表面活性劑。

圖2 不同溫度下的稠油降解率和菌液表面張力Fig.2 Degradation rate of heavy oil and bacterial liquid surface tension of consortium at different temperaturesDegradation conditions:t=10 d;pH=7.5;φ(Inoculation bacterials)=5%

2.2.2 培養(yǎng)基pH值

不同培養(yǎng)基pH值下菌群對稠油的降解率和菌液表面張力的影響如圖3所示。由圖3可知：菌群在pH=5～9時對稠油的降解率均在20%以上；其中，當(dāng)pH=7.5時，菌群對稠油的10 d降解率為為42.14%，菌液表面張力降到44.1 mN/m。另外，菌群在中性和偏堿性的環(huán)境中活性比酸性環(huán)境更高。在實(shí)際應(yīng)用中，由于土壤酸堿度與地理、氣候和土壤歷史利用情況有關(guān)[29]，因此，對于酸性土壤，則需要預(yù)先調(diào)整其pH值才能較好地實(shí)現(xiàn)稠油的降解。

圖3 菌群在不同pH值下的稠油降解率和菌液表面張力Fig.3 Degradation rate of heavy oil and bacterial liquid surface tension of consortium at different pH valuesDegradation conditions:t=10 d;T=35 ℃;φ(Inoculation bacterials)=5%

2.2.3 菌液接種量

探究菌液不同接種量下菌群對稠油的降解率和菌液表面張力變化情況，結(jié)果見圖4。由圖4可知：當(dāng)菌液接種體積分?jǐn)?shù)小于3%時，由于菌量太少，菌群無法在短時間內(nèi)對大量稠油進(jìn)行快速充分的降解，菌群對稠油的降解率較低且菌液表面張力較大；隨著菌液接種量的增大，菌液表面張力逐漸降低，菌群對稠油的降解率呈上升趨勢；但是當(dāng)菌液接種體積分?jǐn)?shù)大于5%時，繼續(xù)增大接種量，稠油降解率的變化不明顯，且菌液表面張力下降幅度減小。這是因?yàn)榫航臃N量過大時，菌種間的競爭作用增強(qiáng)，營養(yǎng)物質(zhì)、氧氣和生長空間受限，菌群大量繁殖導(dǎo)致的代謝物質(zhì)積累又會抑制其自身生長，因此稠油降解率的上升停滯，并推測如果進(jìn)一步增大菌液接種量，稠油降解率可能會下降[30]。所以從經(jīng)濟(jì)和降解效果兩方面考慮，將最佳菌液接種體積分?jǐn)?shù)定為5%，此時菌群對稠油的降解率達(dá)到最大。

圖4 菌群在不同接種量下對稠油的降解率和菌液表面張力Fig.4 The degradation rate of heavy oil and the surface tension of the consortium under different inoculation amountDegradation conditions:t=10 d;T=35 ℃;pH=7.5

2.3 高效稠油降解、降黏菌群的性能分析

2.3.1 稠油氫/碳原子比的變化

稠油的氫/碳原子比(n(H)/n(C))是反映稠油化學(xué)組成的一個重要參數(shù)。H/C原子比是與烴類化合物化學(xué)結(jié)構(gòu)及其相對分子質(zhì)量有關(guān)的參數(shù)，隨著其組分分子中環(huán)狀結(jié)構(gòu)的增多，稠油H/C原子比下降，尤其是隨著稠油組分中芳香環(huán)的增多，其H/C原子比顯著減小[31]。此外，H/C原子比可以反映原油的屬性，一般輕質(zhì)原油或石蠟基原油的n(H)/n(C)高(約1.9)，重質(zhì)原油或環(huán)烷基原油n(H)/n(C)低(約1.5)。菌群降解前后的稠油C、H、N、S元素組成見表2。

由表2可知，復(fù)配菌群作用后，稠油中C質(zhì)量分?jǐn)?shù)減小，H質(zhì)量分?jǐn)?shù)增大，其H/C原子比增大。說明通過菌群的降解作用，稠油的飽和度提高。而菌群中的降黏菌產(chǎn)生表面活性劑，表面活性劑與稠油混合后,首先發(fā)生破乳作用,脫出稠油中含的部分水,然后脫出水與表面活性劑共同與稠油形成低黏度的水包油型乳狀液,從而實(shí)現(xiàn)稠油降黏。這一過程可以分為2個階段：第1階段是破乳降黏，第2階段是乳化降黏[32]，2個階段共同作用使稠油黏度降低，更利于分散，從而易于被降解菌捕獲降解，提高了稠油降解菌對稠油的降解率。

表2 菌群作用前后稠油的元素組成Table 2 Element composition of heavy oil before and after consortium degradation

2.3.2 稠油的官能團(tuán)變化

為了對菌群作用前后稠油組分中官能團(tuán)種類和數(shù)量的變化情況進(jìn)行分析，對稠油進(jìn)行了紅外光譜表征，見圖5。由圖5可以看出，降解前后的稠油在2920 cm-1和2851 cm-1處有最強(qiáng)的—CH2—吸收峰，同時在1460 cm-1和1376 cm-1附近均顯示出明顯的脂肪烴甲基和亞甲基的面內(nèi)伸縮振動吸收峰。與降解前相比，降解后的稠油在2800～3000 cm-1處的吸收峰增強(qiáng)，該峰是由于飽和烴中C—H伸縮振動產(chǎn)生的，表明菌群降解后的稠油飽和度提高。而菌群作用后1606、1508、1459 cm-1處苯環(huán)的C=C伸縮振動吸收峰略微增強(qiáng)，推測是一部分稠環(huán)化合物轉(zhuǎn)化為單環(huán)化合物。研究表明[33]，細(xì)菌降解多環(huán)芳烴的過程十分緩慢且復(fù)雜，會產(chǎn)生部分單環(huán)芳香中間產(chǎn)物，如芳香族的酯類、醚類、醇類物質(zhì)以及苯環(huán)的臨、間、對取代物，如圖5中806、1031、1094、1256 cm-1處的吸收峰增強(qiáng)也可以印證這一點(diǎn)。綜上，經(jīng)過復(fù)配菌群的降解，稠油的組分變得更加輕量化，同時更趨向于飽和，說明復(fù)配菌群具有良好的稠油降解性能。

圖5 菌群作用前后稠油的紅外譜圖Fig.5 Infrared spectra of heavy oil before and after being degraded by consortium

2.3.3 稠油族組成的變化

采用GC-MS分析稠油在菌群作用前后的族組成，見圖6。在GC-MS圖譜中，由于稠油中不同組分的含量不同其絕對豐度值也不同，因此可以采用某一組分絕對豐度與其余組分絕對豐度之和的比值，即該組分的相對豐度，來觀察降解前后稠油中不同碳數(shù)的組分變化，并據(jù)此定性分析菌種的降解性能。

由圖6可以看出：降解前，稠油的主要成分為C6～C30的化合物，C10+化合物占比約88.7%，其中C20占比最高，為19.65%，其次是C19，占比為16.86%，同時也有少量C30～C44化合物分布；降解后，各組分的相對豐度均明顯降低，說明菌群對各個組分均有不同程度的降解；除C28、C30、C36、C44少量殘留外，C23以上的其他重組分完全被降解；與降解前相比，降解后的稠油中C12-組分的相對豐度降低了33.82%～100%，說明菌群對短鏈化合物也有較好的降解效果。綜上，說明復(fù)配后的菌群對稠油各組分都具有較寬的利用性。此外，菌群作用后C13、C14、C18、C22、C36的含量有所增加，推測其可能是長鏈烴化合物，因?yàn)榻到膺^程中菌群難以將長鏈烴直接分解為CO2和H2O，而是先將其分解為短鏈烴，再慢慢進(jìn)行分解，因而一些中間產(chǎn)物的含量略有增加[34]。這與Pourfakhraei等[9]的發(fā)現(xiàn)一致。

圖6 菌群作用前后稠油的族組成Fig.6 Group composition of heavy oil before and after consortium degradation

3 結(jié) 論

(1)采用復(fù)配2株高效稠油降解菌、2株高效稠油降黏菌、1株膠質(zhì)瀝青質(zhì)降解菌，得到一個高效稠油降解降黏菌群，各菌種的最優(yōu)復(fù)配體積比為VY4∶VY5∶VY6∶VY8∶VL4=2∶2∶1∶1∶4。菌群對稠油的最佳降解條件為：溫度35 ℃，pH值7.5，接種體積分?jǐn)?shù)5%，此條件下菌群對稠油的10 d降解率為42%～44%，優(yōu)于單一菌種的 10 d降解率(約23%)。

(2)菌種對稠油降解后，稠油的H/C原子比升高，飽和度提高，重組分變輕。其中，重質(zhì)組分相應(yīng)轉(zhuǎn)化為飽和分及芳香分；中、長鏈烷烴含量大幅度下降；這說明該菌群對稠油各組分的可利用性都具有優(yōu)秀的降解性能，證明了降解、降黏菌對石油烴的降解有協(xié)同增效的作用。