張秀霞，熊 鑫，郭 鵬，劉炳琨，陳 杰，任文海，孫 娟

(1.中國石油大學(xué)(華東) 環(huán)境與安全工程系，山東 青島 266580；2.石油石化污染物控制與處理國家重點實驗室，北京 102206；3.中國石化 江蘇油田分公司 石油工程技術(shù)研究院，江蘇 揚州 225009)

石油工業(yè)的快速發(fā)展為人類社會的進步做出了卓越貢獻[1]。然而，在原油的開采、運輸、加工及使用等過程中，由于操作欠妥、技術(shù)不完善等原因致使大量原油進入土壤，導(dǎo)致土壤生態(tài)環(huán)境惡化，引發(fā)一系列環(huán)境問題，并嚴重危害人類健康[2]，造成不同程度的生態(tài)影響。根據(jù)環(huán)境保護部和國土資源部已公布的《全國土壤污染狀況調(diào)查公報》，中國土壤總超標率高達16.1%[3]，有機類污染物，特別是石油污染物已成為造成土壤安全問題的主要因素之一。

石油污染土壤的修復(fù)技術(shù)眾多，但各有特點。傳統(tǒng)的修復(fù)技術(shù)有物理處理技術(shù)、化學(xué)處理技術(shù)和生物處理技術(shù)[4-5]?？紤]到物理處理技術(shù)成本較高、化學(xué)法易造成二次污染以及生物處理技術(shù)周期較長等問題[6]，在實際操作時，為取長補短，提高修復(fù)效果，避免單一操作方法的局限性，經(jīng)常采用多種方法聯(lián)合的修復(fù)方式[7]。菌糠炭、秸稈與微生物協(xié)同修復(fù)石油污染土壤可以提高修復(fù)效率[8-10]，漆酶活性、腐殖酸等對石油污染土壤特性和生物修復(fù)效果均有促進作用[11-12]，表面活性劑復(fù)配強化微生物修復(fù)水土體系中的菲[13]，表面活性劑具有顯著降低溶液表面張力的特性[14]，對吸附在土壤中的石油烴具有良好的卷縮和增溶作用，常用作化學(xué)淋洗劑?；瘜W(xué)淋洗協(xié)同微生物處理技術(shù)可以有效提高石油污染土壤修復(fù)效率、減少環(huán)境危害[15]，在石油污染土壤處理中具有廣泛的應(yīng)用。雖然表面活性劑溶液可以有效去除土壤中的石油烴，但是部分表面活性劑分子會與土壤產(chǎn)生吸附反應(yīng)，殘留在土壤中，造成二次污染，具有潛在的生態(tài)危害[16-17]，甚至有可能會影響后續(xù)的微生物修復(fù)過程。那么殘留的表面活性劑對生物修復(fù)的影響作用如何？殘留多少可以促進修復(fù)或抑制修復(fù)過程？針對以上問題，筆者通過實驗室模擬修復(fù)方法，研究不同十二烷基苯磺酸鈉(SDBS)濃度下，修復(fù)體系石油烴降解率變化及動力學(xué)行為，為表面活性劑聯(lián)合生物修復(fù)提供了基礎(chǔ)參數(shù)，對推動表面活性劑在環(huán)境修復(fù)領(lǐng)域的發(fā)展以及表面活性劑淋洗協(xié)同微生物修復(fù)技術(shù)在石油污染土壤修復(fù)領(lǐng)域的應(yīng)用具有重要意義。

1 實驗部分

1.1 原料和試劑

實驗試劑：十二烷基苯磺酸鈉、無水硫酸鈉、硫酸、無水乙醇、鹽酸、硫酸亞鐵(七水)、鉬酸銨、牛肉浸膏、胰蛋白胨、瓊脂粉、可溶性淀粉、硫酸鎂(七水)、石油醚(餾程規(guī)格60～90 ℃)，AR，上海泰坦科技股份有限公司產(chǎn)品；百里香酚藍、亞甲基藍、磷酸氫二鉀、鄰啡羅啉、甲基紅、溴甲酚綠，AR，西隴科學(xué)股份有限公司產(chǎn)品。

所用菌種為筆者所在課題組前期篩選并留存的高效石油烴降解菌WH(Ochrobactrumclonep3)。

1.2 供試土樣

取未污染土樣去除雜物后過20目篩，以1 kg土壤中加入50 g原油的比例添加溶解于石油醚的勝利原油，攪拌均勻后置于通風櫥中，定期翻土，自然老化30 d后，作為實驗用土樣。根據(jù)土樣理化性質(zhì)的測定結(jié)果，添加一定量NaNO3和KH2PO4溶液，將土樣含水質(zhì)量分數(shù)調(diào)整為18%左右，C、N、P質(zhì)量分數(shù)比調(diào)整為100∶10∶1[18]。調(diào)理后土壤樣品的理化性質(zhì)見表1。

表1 土樣理化性質(zhì)Table 1 Basic physicochemical properties of the soil sample

1.3 固定化微生物的制備

以滅菌后秸稈材料為載體，以WH為高效降解菌，兩者按照1∶5的體積比均勻混合，并在30 ℃下，以160 r/min轉(zhuǎn)速恒溫培養(yǎng)24 h，使得WH菌得以充分附著在秸稈載體上。隨后倒掉上層培養(yǎng)基，用滅菌處理后的0.9%(質(zhì)量分數(shù))NaCl溶液將附著WH菌的秸稈載體移出。在離心機中以1000 r/min轉(zhuǎn)速低速離心10 min，棄去上清液，繼續(xù)加入0.9%NaCl溶液，以相同條件離心2次，得到附著WH菌的秸稈載體，即為秸稈固定化微生物[19]。

1.4 土壤理化性質(zhì)的測定及調(diào)整

土壤pH值，含水率，石油烴含量，C、N、P質(zhì)量分數(shù)比等是石油污染土壤微生物修復(fù)過程中的關(guān)鍵影響因子。根據(jù)土壤基本理化性質(zhì)測定結(jié)果，將上述關(guān)鍵影響因子調(diào)整到最適合WH菌修復(fù)石油污染土壤狀態(tài)。修復(fù)過程中土壤pH值、含水率、C含量、N含量、P含量、石油烴含量分別采用電位法、重量法、重鉻酸鉀容重法-稀釋熱法、凱氏定氮法和堿熔-鉬銻鈧分光光度法、超聲萃取-紫外分光光度法測定[20]。

1.5 微生物修復(fù)殘留表面活性劑的石油污染土壤方案

設(shè)定13組微生物法修復(fù)表面活性劑殘留石油污染土壤實驗方案，每組模擬修復(fù)實驗用土為500 g。根據(jù)1.3節(jié)的實驗結(jié)果，1 mL WH游離菌菌液所含細菌數(shù)量為9.49×1010CFU(菌落總數(shù)的單位)，1 g秸稈固定化微生物吸附細菌數(shù)量為1.19×1012CFU。進行等生物量換算可知，1 g秸稈固定化微生物吸附的細菌數(shù)量相當于12.56 mL游離菌菌液含有的細菌數(shù)量。依據(jù)上述結(jié)果，設(shè)置模擬修復(fù)實驗方案見表2。每隔7 d測定各模擬修復(fù)組土壤石油烴含量，計算石油烴降解率。

表2 模擬微生物修復(fù)石油污染土壤實驗方案Table 2 Design of simulated microbial remediation of the petroleum-contaminated soil

1.6 石油烴降解率的計算

土壤石油烴降解率按公式(1)計算。

(1)

式中：ηi為第id石油烴降解率，%；w0為土壤初始石油烴質(zhì)量分數(shù)，g/kg土壤；wi為第i天土壤石油烴質(zhì)量分數(shù)，g/kg土壤。

2 結(jié)果與討論

2.1 SDBS對WH菌降解石油烴效果的影響

為了研究SDBS對石油烴降解率的影響，首先在液相石油溶液中加入質(zhì)量分數(shù)為10%的高效降解菌群WH，再分別加入不同濃度SDBS溶液，降解7 d，測定溶液的石油烴含量，考察SDBS對高效石油烴降解菌WH降解石油烴效果影響，結(jié)果見圖1。

由圖1可知，當表面活性劑SDBS質(zhì)量濃度小于10 mg/L時，會抑制液體培養(yǎng)基中WH高效石油烴降解菌降解石油烴的行為，隨著液體培養(yǎng)基中SDBS濃度的增加，WH菌降解石油烴效果逐步得到改善。當液體培養(yǎng)基中SDBS質(zhì)量濃度達到100 mg/L時，WH菌降解石油烴效果最好，超過不添加SDBS的實驗對照組的降解效果，說明SDBS對WH菌產(chǎn)生了明顯的促進作用；繼續(xù)增加SDBS質(zhì)量濃度超過100 mg/L，WH菌降解石油烴的效果反而下降。這可能是因為，在較低濃度時SDBS不僅未能有效分散團聚的石油烴，而且對WH菌產(chǎn)生一定的毒害作用，干擾甚至抑制其生理活動，導(dǎo)致其降解石油烴能力降低；隨著SDBS質(zhì)量濃度的增加，石油烴分散情況得到改善，增加了WH菌與待降解石油烴接觸的可能性，故石油烴降解效果得到改善；繼續(xù)增加SDBS質(zhì)量濃度，雖然可以有效增溶石油烴，但是較高濃度的SDBS對WH菌生理活動的抑制作用占據(jù)主導(dǎo)地位，將不利于石油烴的降解。由液相的實驗結(jié)果可以看出，適當濃度質(zhì)量SDBS的加入有利于石油烴的降解，下文將對SDBS在各種修復(fù)方式下修復(fù)石油污染土壤的影響進行考察。

圖1 SDBS質(zhì)量濃度對WH菌石油烴降解率的影響Fig.1 Effects of SDBS mass concentration on petroleum hydrocarbon degradation rate by WH bacteria w(WH)=10%;t=7 d;There are 0.2 g oil in 100 mL liquid medium.

2.2 模擬修復(fù)過程中土壤石油烴含量變化

供試土樣初始含油質(zhì)量分數(shù)為46.70 g/kg土壤，對供試土樣進行42 d的微生物模擬修復(fù)實驗，每隔7 d測定各修復(fù)組石油烴含量，計算各個修復(fù)周期的石油烴降解率，考察SDBS對各種修復(fù)方式修復(fù)效果的影響。

2.2.1 SDBS添加量對土著菌+秸稈修復(fù)石油污染土壤的影響

在石油污染土壤中，依據(jù)其中的土著菌，添加適量的秸稈作為結(jié)構(gòu)調(diào)理劑，考察SDBS添加量(質(zhì)量分數(shù)，下同)對石油烴降解率的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 SDBS添加量對土著菌+秸稈修復(fù)石油污染土壤過程中石油烴降解率的影響Fig.2 Effects of SDBS dosage on petroleum hydrocarbon degradation rate during microbial remediation (indigenous bacteria with straw) m(Straw)=0.5474 g;m(Soil)=500 g;w0(Oil)=46.70 g/kg Soil

由圖2和表2可知，在模擬修復(fù)的前28 d，4種修復(fù)體系石油烴降解率均隨時間增加而逐漸增大，28 d后微生物降解土壤石油烴效率均明顯放緩，土壤中石油烴含量略有降低并趨于穩(wěn)定。當修復(fù)體系SDBS添加量為225 mg/500 g土壤(TJ1)時，會明顯促進土壤石油烴的降解，42 d的石油烴降解率為22.34%，比對照組(TJCK)的20.15%增加了2.19百分點。然而，當修復(fù)體系SDBS添加量為500 mg/500 g土壤(TJ2)時，反而會抑制土壤石油烴降解，石油烴降解率比對照組降低了2.11百分點，為18.04%。當SDBS添加量為1925 mg/500 g土壤(TJ3)時，會顯著抑制土壤石油烴降解，42 d的石油烴降解率為10.16%，比對照組降低了9.99百分點。因此可以得出，如果前期用SDBS處理石油污染的土壤，且其殘留量較大時，會對土著菌+秸稈調(diào)理的微生物修復(fù)方式產(chǎn)生比較大的抑制作用。

2.2.2 SDBS添加量對土著菌+秸稈固定化微生物修復(fù)石油污染土壤的影響

在石油污染土壤中，添加適量的秸稈固定化微生物，考察SDBS添加量對石油烴降解率的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 SDBS添加量對土著菌+秸稈固定化微生物修復(fù)石油污染土壤過程中石油烴降解率的影響Fig.3 Effects of SDBS dosage on petroleum hydrocarbon degradation rate during the microbial remediation (indigenous bacteria with straw immobilized microorganisms) m(Straw microorganisms)=3.9874 g;m(Soil)=500 g;w0(Oil)=46.70 g/kg Soil

由圖3和表2可知，在模擬修復(fù)過程的前28 d，所考察4種修復(fù)體系的石油烴降解率均隨時間增加而逐漸增大，28 d后微生物降解土壤石油烴效率明顯放緩，土壤中石油烴含量略有降低并趨于穩(wěn)定。在體系中添加秸稈固定化微生物后，當SDBS添加量為225 mg/500 g土壤(TG1)和500 mg/500 g土壤(TG2)時，均會促進土壤石油烴的降解，42 d的石油烴降解率分別52.14%和53.45%，比對照組(TGCK)的50.02%分別增加了2.12和3.43百分點，且后者促進效果略優(yōu)于前者。然而，當修復(fù)體系SDBS添加量為1925 mg/500 g土壤(TG3)時，則會明顯抑制土壤石油烴降解，42 d的石油烴降解率僅為18.01%，比對照組降低了32.01百分點。

2.2.3 SDBS添加量對土著菌+游離菌微生物+秸稈修復(fù)石油污染土壤的影響

在石油污染土壤中，依據(jù)其中的土著菌，并添加適量的秸稈+游離菌微生物，考察SDBS添加量對石油烴降解率的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 SDBS添加量對土著菌+游離菌微生物+秸稈修復(fù)石油污染土壤過程中石油烴降解率的影響Fig.4 Effects of SDBS dosage on petroleum hydrocarbon degradation rate during the microbial remediation (indigenous bacteria with straw as well as free microorganisms) V(WH bacterium)=50 mL;m(Straw)=3.9874 g;m(Soil)=500 g;w0(Oil)=46.70 g/kg Soil

由圖4和表2可知，在模擬修復(fù)過程的前28 d，考察的4種修復(fù)體系石油烴降解率均隨時間增加而逐漸增大，28 d后微生物降解土壤石油烴的效率明顯放緩，土壤石油烴含量略有降低并趨于穩(wěn)定。在體系中添加秸稈后，當SDBS添加量為225 mg/500 g土壤(TYJ1)和500 mg/500 g土壤(TYJ2)時，均會促進土壤石油烴的降解，42 d的石油烴降解率分別為49.87%和51.22%，比對照組(TYJCK)的48.11%增加了1.76和3.11百分點，并且后者促進效果略優(yōu)于前者。然而，當修復(fù)體系SDBS添加量為1925 mg/500 g土壤(TYJ3)時，則會明顯抑制土壤石油烴降解，42 d的石油烴降解率17.88%，比對照組降低了30.23百分點。

綜上可以看出，表面活性劑SDBS對不同修復(fù)體系的作用是不同的，以下將考察相同濃度的SDBS對不同體系的影響。

2.2.4 SDBS質(zhì)量分數(shù)1 mg/g時對不同體系石油污染土壤修復(fù)效果的影響

SDBS的質(zhì)量分數(shù)為1 mg/g(即500 g石油污染土壤中加入500 mg的SDBS)時，考察其對不同體系石油污染土壤修復(fù)效果的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 1 mg/g SDBS對不同修復(fù)體系的石油烴降解率的影響Fig.5 Effects on petroleum hydrocarbon degradation rate in different remediation systems with 1 mg/g SDBS m(SDBS)=500 mg;m(Soil)=500 g;w0(Oil)=46.70 g/kg Soil

由圖5可知，在42 d的模擬修復(fù)過程中，土壤中石油烴的降解率分別為：土著菌+秸稈固定化微生物(TG2)53.45%，土著菌+游離菌WH+秸稈(TYJ2)51.22%，土著菌+秸稈(TJ2)18.04%，土著菌(CK)5.02%。土著菌+秸稈固定化微生物(TG2)的修復(fù)效果最好。圖5結(jié)果說明：在石油污染土壤修復(fù)的過程中既要補充石油烴降解菌還要添加結(jié)構(gòu)調(diào)理劑秸稈，以增加土壤體系的孔隙率和氧的傳遞效率；適當表面活性劑的殘留對石油烴的降解具有一定的促進作用；秸稈固定化微生物的修復(fù)效果優(yōu)于秸稈+游離微生物WH菌的組合，這再一次證明了固定化微生物在土壤修復(fù)中的重要作用[21-22]。

從上述的實驗結(jié)果可以看到，不同的修復(fù)方式，不但修復(fù)的效果不同，修復(fù)速率也不同。不論對哪一種修復(fù)方式，石油烴降解率增長幅度最大的都在21 d，21 d過后，降解率的增長率放緩，另外，土著微生物+秸稈固定化微生物和土著微生物+游離微生物+秸稈2種修復(fù)方式前28 d的石油烴降解率的增長率都比較高，說明修復(fù)的啟動速率快，維持的時間較長，最終的修復(fù)效果也較好。因此，在石油污染土壤修復(fù)過程中，優(yōu)先采用固定化微生物的修復(fù)方式，其次是將游離微生物和固定化的載體材料分別加入，這兩種修復(fù)方式條件下，SDBS少量殘留都可以對生物修復(fù)起到一定促進作用，且修復(fù)啟動快，可達到不錯的修復(fù)效果。

3 結(jié) 論

土壤中殘留低濃度的SDBS對后續(xù)的微生物修復(fù)石油污染土壤具有促進作用，高濃度的SDBS反而有抑制作用，SDBS的殘留質(zhì)量分數(shù)要控制在1 mg/g 土壤以內(nèi)。在有SBDS殘留的石油污染土壤中，土著菌+秸稈固定化微生物的修復(fù)效果要明顯優(yōu)于土著菌+游離WH高效降解菌的修復(fù)效果，稍好于土著菌+游離WH高效降解菌+秸稈修復(fù)方式。當修復(fù)體系中SDBS質(zhì)量分數(shù)為1 mg/g土壤時，土著菌+秸稈固定化微生物的修復(fù)效果最好，42 d的石油烴降解率達到53.45%。

固定化微生物修復(fù)石油污染土壤的方式可以迅速啟動，且在較長的時間內(nèi)都具有較高的石油烴降解率增長率，對土壤的適應(yīng)性和持續(xù)修復(fù)性能較強。在SDBS存在的條件下，固定化微生物促進石油污染土壤的機制有待進一步研究。