楊學(xué)攀，朱明明，余曦，賀穩(wěn)，陳晗，施洪飛

急性心肌梗死（AMI）已成為危害人類生命的重要疾病之一[1-2]。黃麗等[3]研究表明，在我國AMI發(fā)病率為45/10 萬～55/10 萬，而急性期死亡率高達(dá)30%。經(jīng)皮冠狀動脈介入治療（PCI）是治療AMI 主要方法之一[4]，但在有效救助的同時對已受損的心肌細(xì)胞會造成二次損傷，稱為心肌缺血再灌注損傷（MIRI）[5]。因此，如何避免MIRI 是目前亟待解決的問題。

MIRI 的病理機制復(fù)雜，防治方式多樣，但均有一定缺陷[6-7]。MIRI 在中醫(yī)領(lǐng)域內(nèi)屬于“胸痹”的范疇，其病位在心，與肝、脾、腎相關(guān)，屬本虛標(biāo)實、虛實夾雜之證[8]。氣血陰陽的虧虛、痰濁、血瘀等阻滯于心脈是MIRI 的主要發(fā)病機制?，F(xiàn)代人生活節(jié)奏快、工作壓力大、飲食不節(jié)及缺乏鍛煉，頭暈、失眠、五心煩熱成為大多數(shù)人具有的癥狀，是陰液虧虛導(dǎo)致。腎為水臟，主陰，腎陰不足，久則及心，心陰虛損，可引起胸陽失運，心陽不足，進(jìn)而導(dǎo)致心脈痹阻，發(fā)為胸痹。在治療上應(yīng)以養(yǎng)陰為主，兼以活血化淤或通絡(luò)止痛[9]。因此，滋陰是治療MIRI的重要方法。中藥葛根，具有解肌退熱、透疹、生津止渴等功效[10]。研究表明[11]，其有效成分葛根素可保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞，并促進(jìn)血管軟化和降低動脈粥樣硬化，但其潛在機制需進(jìn)一步研究。本課題組在前期已明確缺氧復(fù)氧模型對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞EA.hy926 增殖的顯著抑制作用[12]，本研究旨在探討葛根素對缺氧復(fù)氧后EA.hy926 細(xì)胞凋亡的影響，同時探究磷酯酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號通路在EA.hy926 細(xì)胞凋亡中的調(diào)節(jié)機制，為葛根對MIRI 的臨床治療提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與儀器

CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（日本三洋公司，型號HERAcell）；酶標(biāo)儀（美 國Thermo Scientific，型號Synergy2）；實時熒光定量PCR 儀、垂直電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-rad 公司，型號7500、125-BR、ChemiDocTMRS+）；臺式離心機（德國Eppendorf，型號5415C）；倒置熒光顯微鏡、倒置光學(xué)顯微鏡（日本尼康公司，型號IX-70、CK40）。

1.2 藥物與試劑

葛根素（南京邁博生物科技有限公司）；PI3K抑制劑LY294002（南京迅貝生物科技有限公司）；DMEM 培養(yǎng)基（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司）；Gibco 胎牛血清（南京金益柏生物科技有限公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、擴增試劑盒（南京諾唯贊生物科技有限公司）；Hoechest 染色試劑盒（南京良緯生物科技有限公司）；抗人Bax 抗體（美國Cell Signaling Technology 公司）；活化天冬氨酸蛋白水解酶-9（cleaved caspase-9）、活化天冬氨酸蛋白水解酶-3（cleaved caspase-3）、B 細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）抗體（中國proteintech 公司）；β 肌動蛋白（β-actin）抗體（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；蛋白激酶B（Akt）、磷酸化的蛋白激酶B（p-Akt）抗體（Affinity 公司）；二抗：山羊抗兔（中國proteintech 公司）、山羊抗鼠（中國博奧森公司）。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

EA.hy926 細(xì)胞（購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫）培養(yǎng)在含10%胎牛血清，不完全高糖的DMEM 培養(yǎng)基中，條件設(shè)置為5%CO2，37℃，隔天換液1 次，取對數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行實驗。

缺氧實驗時，將培養(yǎng)液替換為磷酸鹽緩沖液（PBS），放入94%N2、5%CO2、1%O2的缺氧培養(yǎng)箱中，缺氧12 h 后，將PBS 替換為培養(yǎng)液，在5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中復(fù)氧8 h。

在使用葛根素或LY294002 預(yù)處理時，待細(xì)胞生長至80%，加入葛根素、LY294002，24 h 后棄去培養(yǎng)液加入等量PBS 進(jìn)行缺氧12 h 處理，缺氧結(jié)束后將PBS 替換為培養(yǎng)液復(fù)氧8 h。

1.4 噻唑藍(lán)法檢測細(xì)胞活力

將對數(shù)期細(xì)胞種于96 孔板中，治療組使用葛根素預(yù)處理，其預(yù)處理濃度分別為0 mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L、10-4mol/L，24 h 后將模型組及治療組培養(yǎng)液替換為PBS 并放入缺氧培養(yǎng)箱中，對照組換液后維持原條件培養(yǎng)。12 h 后，將模型組PBS 替換為培養(yǎng)基，復(fù)氧8 h，對照組換液后繼續(xù)維持原條件培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后全部組別各加10 μl 噻唑藍(lán)，4 h 后棄去培養(yǎng)液加二甲基亞砜（DMSO）200 μl，于490 nm、10 min、間隔震蕩條件下測量吸光度（A）值。公式為所有組別與對照組平均值的比值×100%。

1.5 Hoechest 實驗

將清洗后的蓋玻片置于培養(yǎng)皿內(nèi)并加入細(xì)胞混懸液，分為對照組、缺氧復(fù)氧組、缺氧復(fù)氧+葛根素組（葛根素組）、缺氧復(fù)氧+葛根素+LY294002處理組（葛根素+抑制劑組），每組均設(shè)3 個復(fù)孔。待培養(yǎng)結(jié)束后吸盡培養(yǎng)液，加入0.5 ml 固定液至蓋玻片上，10 min 后 PBS 清洗2 次，隨后加入0.5 ml Hoechest33258 染料以覆蓋蓋玻片[12]，5 min 后PBS清洗2 次，抗熒光淬滅劑封片，并迅速置于熒光顯微鏡下檢測。

1.6 蛋白免疫印跡法（Western blot）

培養(yǎng)細(xì)胞，分組同上，培養(yǎng)結(jié)束后取出細(xì)胞，提取蛋白，BCA 法測蛋白濃度[13]，上樣，設(shè)置電泳條件為105 V，15 min，結(jié)束后轉(zhuǎn)膜，條件設(shè)置為15 V、10 min。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，牛奶封閉1 h，隨后一抗（1:1 000）封閉過夜，洗滌后二抗（1:10 000）孵育1 h，曝光，保存條帶。

1.7 實時熒光定量PCR

培養(yǎng)細(xì)胞，分組同上，培養(yǎng)結(jié)束后取出細(xì)胞，Trizol 提取RNA，蛋白核酸測定儀檢測RNA 濃度。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系為50℃，15 min；85℃，2 min。按實時熒光定量PCR 試劑盒說明書配置反應(yīng)體系：預(yù)變性過程：95℃，30 s；擴增過程：95℃，10 s；60℃，30 s，共40 個循環(huán)；延伸過程95℃，15 s；60℃，60 s；95℃，15 s。引物Bcl-2：上游5'-GTGGGGTC -ATGTGTGTGGAGAG-3'，下游5'-CAGAGACAGCCAGGAGAAATCAA-3'；caspase-3：上游5'-GTAGAAGTCTAACTGGAAAACCCAA-3'，下游5'-CATGTCATCATCAACACCACTGTCT-3'；以β-actin 為內(nèi)參：上游 5'-CTACCTCATGAAGAT -CCTCACCGA-3'，下游5'-TTCTCCTTAATGTCACGCACGATT-3'。最終結(jié)果采用2-ΔΔCT進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

實驗所得數(shù)據(jù)以GraphPad Prism 6 統(tǒng)計軟件處理分析，數(shù)據(jù)均以表示。兩組數(shù)據(jù)用t檢驗分析，多組數(shù)據(jù)用單因素方差分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度葛根素對EA.hy926 細(xì)胞活力的影響（圖1）

圖1 噻唑藍(lán)法比較不同濃度葛根素對EA.hy926 細(xì)胞活力的影響（n=3,）

噻唑藍(lán)法檢測結(jié)果顯示，與缺氧復(fù)氧組比較，葛根素10-7mol/L 預(yù)處理細(xì)胞可明顯提高缺氧復(fù)氧后EA.hy926 細(xì)胞活力（P＜0.001），其余組別EA.hy926 細(xì)胞活力均降低且差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05）。

2.2 葛根素預(yù)處理對EA.hy926 細(xì)胞缺氧復(fù)氧后細(xì)胞凋亡的影響（圖2A、2B）

圖2 Hoechest 染色檢測葛根素預(yù)處理對EA.hy926 細(xì)胞缺氧復(fù)氧后凋亡的影響（n=3,）

Hoechest 染色中，與缺氧復(fù)氧組比，葛根素組中EA.hy926 細(xì)胞核深染形態(tài)明顯減少，細(xì)胞調(diào)亡率明顯下降（P＜0.001）。

2.3 葛根素預(yù)處理對EA.hy926 細(xì)胞缺氧復(fù)氧后凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響

Western blot 結(jié)果示，與缺氧復(fù)氧組相比，葛根素組促凋亡蛋白Bax、cleaved caspase-9、cleaved caspase-3表達(dá)水平明顯下調(diào)，抗凋亡蛋白Bcl-2 表達(dá)水平明顯上調(diào)（P均＜0.01，圖3A、3B）。實時熒光定量PCR 結(jié)果示，與缺氧復(fù)氧組相比，葛根素組降低了天冬氨酸蛋白水解酶-3（caspase-3）mRNA 表達(dá)（P＜0.01），增加了Bcl-2 mRNA 表達(dá)（P＜0.001），見圖4A、4B。

圖3 蛋白免疫印跡法分析葛根素預(yù)處理對EA.hy926 細(xì)胞缺氧復(fù)氧后凋亡相關(guān)蛋白水平的影響（n=3,）

圖4 實時熒光定量PCR分析葛根素預(yù)處理對EA.hy926 細(xì)胞缺氧復(fù)氧后caspase-3 和Bcl-2 mRNA 表達(dá)的影響（n=3,）

2.4 LY294002 對EA.hy926 細(xì)胞凋亡率的影響

噻唑藍(lán)法檢測結(jié)果顯示與對照組相比，LY294002 濃度為10 μmol/L 時EA.hy926 細(xì)胞活力無明顯變化，LY294002 濃度為15 μmol/L、20 μmol/L時EA.hy926 細(xì)胞活力均明顯下降（P＜0.001），因此10 μmol/L 可作為LY294002 干預(yù)EA.hy926 細(xì)胞的濃度（圖5）。

圖5 噻唑藍(lán)法比較不同濃度LY294002 對EA.hy926 細(xì)胞活力的影響（n=3,）

將細(xì)胞分為四組，分別為對照組、缺氧復(fù)氧組、葛根素組、葛根素+抑制劑組進(jìn)行Hoechest 染色法檢測，結(jié)果顯示，與對照組相比，缺氧復(fù)氧組EA.hy926 細(xì)胞凋亡率明顯上升（P＜0.05）。與缺氧復(fù)氧組相比，葛根素組EA.hy926 細(xì)胞凋亡率下降（P＜0.01）。與葛根素組相比，葛根素+抑制劑組EA.hy926 細(xì)胞凋亡率上升（P＜0.01）。（圖6A、6B）

圖6 Hoechest 染色法檢測LY294002 對EA.hy926 細(xì)胞凋亡的影響（n=3,）

2.5 葛根素對p-Akt、Akt 蛋白水平的影響（圖7A、7B）

圖7 蛋白免疫印跡法分析葛根素預(yù)處理后EA.hy926 細(xì)胞對p-Akt、Akt 蛋白水平的影響（n=3,）

Western blot 檢測結(jié)果顯示，與缺氧復(fù)氧組相比，葛根素組上調(diào)了p-Akt 蛋白的表達(dá)水平（P＜0.001）。

2.6 LY294002 對葛根素激活的p-Akt、Akt 蛋白水平以及凋亡蛋白的影響

Western blot 結(jié)果顯示，與葛根素組相比，葛根素+抑制劑組p-Akt 蛋白表達(dá)水平明顯下降（P＜0.001，圖8A、8B）；抗凋亡蛋白Bcl-2 表達(dá)水平下降（P＜0.001），cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、Bax的表達(dá)水平上升（P＜0.01，P＜0.01，P＜0.001），見圖9A、9B。

圖8 蛋白免疫印跡法分析LY294002 對EA.hy926 細(xì)胞p-Akt、Akt 蛋白水平的影響（n=3,）

圖9 蛋白免疫印跡法分析LY294002 對EA.hy926 細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白水平的影響（n=3,）

3 討論

血管內(nèi)皮細(xì)胞是血液和心肌細(xì)胞間的屏障，具有分泌血管活性物質(zhì)和維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定等作用[14]。心肌缺血時會導(dǎo)致腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的自分泌上調(diào)，并作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，通過各種途徑誘發(fā)細(xì)胞凋亡[15]。而當(dāng)MIRI 發(fā)生時，內(nèi)皮細(xì)胞比心肌細(xì)胞更早受到損傷[16]。因此，如何在MIRI發(fā)病過程中最大限度保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞已成為目前研究的重要問題。原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和EA.hy926 細(xì)胞是研究血管內(nèi)皮功能常用的細(xì)胞株，由于EA.hy926 細(xì)胞具有一定程度的原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的生物特性，且具有較強的增殖能力，在體外實驗研究中適用于復(fù)雜的、創(chuàng)傷較大的細(xì)胞實驗[17]，因此本研究采用EA.hy926 細(xì)胞進(jìn)行實驗。本研究通過噻唑藍(lán)法檢測發(fā)現(xiàn)缺氧復(fù)氧會導(dǎo)致細(xì)胞活力降低，且Hoechest 實驗結(jié)果表明缺氧復(fù)氧組細(xì)胞核深染狀態(tài)明顯增多，使用葛根素預(yù)處理后，細(xì)胞核深染狀態(tài)明顯較少，初步表明缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而葛根素對細(xì)胞凋亡具有抑制作用。

細(xì)胞凋亡是MIRI 發(fā)病的重要機理之一[18]。研究發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注的大鼠中細(xì)胞凋亡顯著[19-20]。caspase 家族蛋白與Bcl-2 家族蛋白跟細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。Bcl-2 是其家族蛋白中最主要的抗凋亡蛋白，Bax 是最早發(fā)現(xiàn)的促凋亡蛋白。正常細(xì)胞中Bax 主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)其受到凋亡刺激后轉(zhuǎn)位到線粒體上，造成細(xì)胞色素C 釋放[21]。當(dāng)細(xì)胞凋亡信號傳遞至線粒體時，第二信使如Bcl-2被激活，使線粒體釋放出細(xì)胞色素C 與凋亡蛋白酶激活因子1（Apaf-1）和caspase-9 形成復(fù)合體，caspases-9 由此激活，并繼續(xù)激活下游效應(yīng)因子caspase-3、caspase-6、caspase-7，使細(xì)胞進(jìn)入凋亡[22]。caspase-3 是最為關(guān)鍵的細(xì)胞凋亡執(zhí)行者，它在細(xì)胞凋亡的過程中具有關(guān)鍵作用[23-25]，它的活化是凋亡進(jìn)入不可逆階段的標(biāo)志。本研究通過Western blot、實時熒光定量PCR 檢測發(fā)現(xiàn)在EA.hy926 細(xì)胞缺氧12 h、復(fù)氧8 h 后，Bax、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9 mRNA 及蛋白表達(dá)水平明顯升高，Bcl-2 mRNA 及蛋白表達(dá)水平明顯降低。而經(jīng)葛根素預(yù)處理后Bax、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9 mRNA 及蛋白表達(dá)水平明顯降低，Bcl-2 mRNA 及蛋白表達(dá)水平明顯升高。這表明葛根素可通過抑制相關(guān)凋亡mRNA 及蛋白表達(dá)從而抑制缺氧復(fù)氧損傷導(dǎo)致的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。

PI3K/Akt信號通路是一條經(jīng)典的凋亡通路，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、代謝、凋亡等多種生物學(xué)作用，是治療冠心病、腫瘤、代謝紊亂等多種疾病的重要靶點[26]。PI3K 是生長因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的重要分子。酪氨酸激酶受體、非酪氨酸激酶受體、胰島素受體等胞外信號可激活PI3K。Akt 在細(xì)胞生長、增殖、與凋亡過程中均發(fā)揮了關(guān)鍵作用，是PI3K信號通路中一個重要的下游靶點，PI3K 的活化促使第二信使磷脂酰-3,4,5-三磷酸的形成從而進(jìn)一步促進(jìn)Akt 的Thr308 和Ser473 位點磷酸化，這導(dǎo)致Akt 部分或完全激活，活化的Akt 通過抑制凋亡信號蛋白的磷酸化或通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的活性來調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡[27]。在本研究中Western blot 結(jié)果顯示，葛根素預(yù)處理細(xì)胞后，p-Akt 表達(dá)水平上調(diào)，且加入PI3K抑制劑LY294002 后，p-Akt 表達(dá)水平下調(diào)，且促凋亡蛋白Bax、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9表達(dá)水平明顯上調(diào)，抗凋亡蛋白Bcl-2 的表達(dá)水平顯著下降，這表明PI3K/Akt 通路介導(dǎo)葛根素抑制缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的EA.hy926 細(xì)胞凋亡。

綜上所述，葛根素預(yù)處理對缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的EA.hy926 凋亡具有明顯的改善作用，且其作用由PI3K/Akt信號通路介導(dǎo)。這為中醫(yī)治療MIRI 找到了新的途徑，葛根素也有望成為中藥治療MIRI 的藥物靶點。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突