高 翔，佘 凡，馬鵬飛△，劉 剛

（1. 陜西省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，陜西 西安 710065； 2. 陜西省楊凌示范區(qū)藥品檢驗(yàn)監(jiān)測評價(jià)中心，陜西 楊凌 712100）

小兒止咳糖漿本身不具有充分的抗菌活性，且為多劑量包裝，使用過程中需反復(fù)開啟，存在被污染的風(fēng)險(xiǎn)，為保證產(chǎn)品的正常儲存和使用，避免微生物生長與繁殖，根據(jù)制劑特性添加了抑菌劑苯甲酸鈉[1－2]。小兒止咳糖漿曾收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·中藥成方制劑（第五冊）》《國家中成藥標(biāo)準(zhǔn)匯編中成藥地方標(biāo)準(zhǔn)上升為國家標(biāo)準(zhǔn)部分口腔腫瘤兒科分冊》，苯甲酸鈉的處方添加量為0.5%。最近3 版《中國藥典（一部）》均收載了該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，其中2020 年版規(guī)定，苯甲酸鈉的處方添加量為0.2%[3]，并將2010 年版首次收載的抑菌劑效力檢查法指導(dǎo)原則上升為抑菌劑效力檢查法，要求更高，定位更準(zhǔn)確[4]。但該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)未制訂苯甲酸鈉具體的質(zhì)量控制指標(biāo)，作為藥品的安全性評估，抑菌劑的添加量、抑菌效力是考察的重點(diǎn)，故本研究中對此進(jìn)行了考察?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料

1.1 儀器

2695 型高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；壓力蒸汽滅菌器（上海華成醫(yī)用核子儀器公司）；HFsafe－760S 型生物安全柜（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；MJ－250－Ⅲ型霉菌培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司）；LRH－250F 型生化培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；PR224ZH 型電子天平(美國奧豪斯公司)。

1.2 試藥

苯甲酸鈉對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為100433－201702，供含量測定用）；小兒止咳糖漿（樣品A1－A3，華潤三九＜郴州＞制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字Z43020385，批號分別為1804033N，1905016N，1905015N，規(guī)格為每瓶120 mL；樣品B，廣西維威制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字Z45021858，批號為180102，規(guī)格為每瓶120 mL；樣品C，江西遠(yuǎn)東藥業(yè)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字Z36020251，批號為B180531，規(guī)格為每瓶120 mL；樣品D，湖北諾得勝制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字Z42020245，批號為181001，規(guī)格為每瓶100 mL），包裝均為口服液體藥用聚乙烯瓶；甲醇、乙酸銨均為色譜純；水為純化水。

1.3 培養(yǎng)基

胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基，批號分別為1802052，190508，1801152，190702，均購于北京三藥科技開發(fā)公司。培養(yǎng)基適用性檢查符合2020 年版《中國藥典》要求。

1.4 菌種

金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]，大腸埃希菌[CMCC（B）44102]，銅綠假單胞菌[CMCC（B）10104]，白色念珠菌[CMCC（F）98001]，黑曲霉[CMCC（F）98003]，魯氏酵母菌[CICC1417]；工作用菌株均為第3 代。魯氏酵母菌來源于上海保藏生物技術(shù)中心，其他菌種來源于中國醫(yī)學(xué)菌種保藏中心。

2 方法與結(jié)果

2.1 苯甲酸鈉含量測定

2.1.1 色譜條件

色譜柱：WoburnStamsilC18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇－0.05 mol／L 乙酸銨（5 ∶95，V／ V）；流速：1 mL／min；檢測波長：230 nm；柱溫：30 ℃。

2.1.2 溶液制備

取苯甲酸鈉對照品適量，精密稱定，加水溶解，制成每1 mL 含苯甲酸鈉0.1 mg 的對照品溶液；精密量取樣品2 mL，置50 mL 容量瓶中，加水約40 mL，超聲（功率為300 W，頻率為40 kHz）處理20 min，取出，放冷，加水定容，搖勻，作為供試品溶液；取缺苯甲酸鈉的陰性樣品，同供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。

2.1.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：取2.1.2 項(xiàng)下3 種溶液，按2.1.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果陰性對照品溶液色譜中，在與苯甲酸鈉對照品溶液色譜相同保留時(shí)間處無干擾峰，表明專屬性良好。詳見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms

線性關(guān)系考察：分別精密吸取苯甲酸鈉對照品溶液（0.106 3 mg／mL）2，4，6，8，10，12 μL，按2.1.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測定峰面積。以峰面積值（Y）為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度（X，μg）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y ＝3 228 068 X－75 910，r ＝0.999 9 （n ＝6）。結(jié)果表明，苯甲酸鈉質(zhì)量濃度在0.212 6 ～1.275 6 μg／mL 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：取2.1.2 項(xiàng)下對照品溶液，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6 次，測定峰面積。結(jié)果的RSD為0.46%（n ＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一樣品（批號為1804033N）供試 品溶液，在室溫下分別于0，2，4，8，12，24 h 時(shí)按2.1.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測定峰面積。結(jié)果的RSD 為0.19%（n ＝6），表明供試品溶液在室溫下24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批(含量為1804033N)樣品，依法制備供試品溶液，平行制備6 份，按2.1.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果平均含量為2.054 mg／mL，RSD 為0.86%（n ＝6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：精密量取已知含量的樣品（批號為1804033N）1.0 mL，共9 份，置50 mL 容量瓶中，分別加入對照品溶液14，18，22 mL，平行加入3 份，依法制備供試品溶液，按2.1.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n ＝9）Tab.1 Results of the recovery test（n ＝9）

2.1.4 樣品含量測定

取不同批次樣品適量，按2.1.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.1.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，并計(jì)算樣品含量。結(jié)果樣品A1，A2，A3，B，C，D 的含量分別為2.05，2.01，1.88，1.90，1.92，1.84 mg／mL，平均1.93 mg／mL。

2.2 抑菌效力測定

2.2.1 菌液制備

取金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌、魯氏酵母菌的新鮮培養(yǎng)物，用無菌0.9%氯化鈉溶液制成適宜濃度的菌懸液。取黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物，加入適量含0.05%（V／ V）聚山梨酯80 的pH7.0 無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液，洗脫孢子。然后，采用適宜方法吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi)，用無菌0.9%氯化鈉溶液制成適宜濃度的孢子懸液。

2.2.2 方法適用性試驗(yàn)

進(jìn)行抑菌效力檢查前，需對供試品的計(jì)數(shù)方法進(jìn)行驗(yàn)證，以確定該方法在抑菌劑效力檢查時(shí)能有效檢測出供試品中所有試驗(yàn)菌。按2020 年版《中國藥典（四部）》存活菌數(shù)測定方法及方法適用性試驗(yàn)，對細(xì)菌數(shù)和真菌數(shù)采用1 ∶10 的平皿法（直徑9 cm）進(jìn)行計(jì)數(shù)。

2.2.3 抑菌效力測定方法

菌液組：無菌條件下，吸取20 mL 無菌0.9%氯化鈉溶液加入無菌玻璃瓶中，平行制備6 份，將與樣品組相同量的目標(biāo)菌懸液加入其中，梯度稀釋，采用平皿計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)，細(xì)菌于30 ～35 ℃培養(yǎng)3 ～5 d，真菌于20 ～25 ℃培養(yǎng)5 ～7 d 后，計(jì)算樣品中試驗(yàn)菌菌數(shù)（即初始接種菌液濃度），并換算對數(shù)（lg）值。詳見表2(表2、表3中“金葡”為金黃色葡萄球菌，“大腸”為大腸埃希菌，“銅綠”為銅綠假單胞菌，“白念”為白色念珠菌，“魯氏”為魯氏酵母菌，“黑曲”為黑曲霉)。

樣品組：小兒止咳糖漿原包裝瓶樣品與菌液充分混勻。無菌條件下留取原包裝瓶中樣品20 mL，按目標(biāo)菌的個(gè)數(shù)平行制備6 份，將2.2.1 項(xiàng)下制備的菌懸液各吸取0.2 mL 加入其中，使1 mL 供試品接菌量為105～106cfu，加菌量不超過容器中樣品量的1%，于渦旋振蕩儀振蕩均勻。將制備好的供試液置23 ℃培養(yǎng)箱避光儲存，分別在14 d 和28 d 對供試液中存活的微生物進(jìn)行計(jì)數(shù)。

存活菌數(shù)測定：分別于第14，28 天將樣品于渦旋振蕩儀振蕩均勻，無菌條件下，量取樣品1 mL，用無菌0.9%氯化鈉溶液梯度稀釋制成1 ∶10，1 ∶102，1 ∶103的系列溶液，測定。培養(yǎng)物置規(guī)定溫度、規(guī)定時(shí)間培養(yǎng)，逐日觀察結(jié)果。根據(jù)菌落測定結(jié)果，計(jì)算1 mL 樣品組各間隔時(shí)間的試驗(yàn)菌數(shù)量，并換算成lg 值。詳見表2。

表2 小兒止咳糖漿接菌量、含菌量及l(fā)g 值Tab.2 Inoculated－pathogen quantity，germ－containing quantity and lg value of Xiaoer Zhike Syrup

口服制劑抑菌效力判斷標(biāo)準(zhǔn)：按種14 d 時(shí)，金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌數(shù)量的lg 值減少不小于3，白色念珠菌、魯氏酵母菌、黑曲霉數(shù)量的lg 值減少不小于1。試驗(yàn)菌增加數(shù)量的lg 值不超過0.5 為未增加。

結(jié)果判斷：供試液中試驗(yàn)菌數(shù)量減少的lg 值為與前一測定時(shí)間點(diǎn)比較（14 d 比初始，28 d 比14 d）。接種試驗(yàn)菌14 d 時(shí)其數(shù)量的lg 值下降情況見表3。結(jié)果與14 d 時(shí)比較，28 d 時(shí)各樣品中各類試驗(yàn)菌數(shù)量的lg 值均未增加。

表3 小兒止咳糖漿中第14 天時(shí)試驗(yàn)菌數(shù)量的lg 值降低情況Tab.3 The lg value of decrease of test bacteria in Xiaoer Zhike Syrup on the 14th day

3 討論

本研究中參考文獻(xiàn)[5－6]，建立了小兒止咳糖漿中苯甲酸鈉含量測定方法。該方法操作簡便、結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可為小兒止咳糖漿中苯甲酸鈉的含量測定提供參考。同時(shí)還對制劑中常用抑菌劑山梨酸鉀、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯進(jìn)行測定，均未檢出。

4 個(gè)廠家、6 批次樣品中的苯甲酸鈉含量由高到低依次為A1＞A2＞C ＞B ＞A3＞D，添加量范圍為1.8 ～2.1 mg／mL，平均1.93 mg／mL，測定結(jié)果均在處方添加量的90% ～110%內(nèi)。表明不同廠家、不同批次的樣品抑菌劑種類、添加量、抑菌效力均符合藥典標(biāo)準(zhǔn)。

糖漿劑系含有原料藥物的濃蔗糖水溶液，蔗糖量應(yīng)不低于45% （g／mL），小兒止咳糖漿蔗糖量為65% 。2020 年版《中國藥典》規(guī)定含高濃度蔗糖的口服制劑抑菌劑效力測定時(shí)還應(yīng)選用魯氏酵母菌為試驗(yàn)菌株。魯氏酵母菌耐高糖高鹽高滲環(huán)境，可耐受60%蔗糖12%氯化鈉，易致藥物腐敗，為糖漿劑常見的污染微生物。若小兒止咳糖漿加入魯氏酵母菌進(jìn)行抑菌效力試驗(yàn)，防腐體系的考察將更加科學(xué)、全面。

評估抑菌效力須先考察抑菌劑種類和添加量，防止企業(yè)因盲目追求抑菌效力，過量添加或聯(lián)合添加的問題。企業(yè)應(yīng)制訂嚴(yán)格的內(nèi)控質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，增加抑菌劑含量的質(zhì)量控制方法。在確定抑菌劑種類和添加量的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步考察抑菌體系控制微生物的能力，全面了解抑菌劑的使用情況，否則單純評估抑菌效力意義不大[7－8]。

本試驗(yàn)中隨著貯存時(shí)間的延長，細(xì)菌和真菌數(shù)量呈下降趨勢；苯甲酸鈉對細(xì)菌的抑制作用十分明顯，但對真菌的抑制作用相對較弱，與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致[9－10]。

抑菌劑添加量“毒性－活性”的平衡，要求最低有效量，避免增加藥品不良反應(yīng)[11]。2010 年版以前的各版藥典處方中抑菌劑的添加多依據(jù)使用經(jīng)驗(yàn)和相關(guān)文獻(xiàn)，缺乏試驗(yàn)數(shù)據(jù)支撐，添加量無驗(yàn)證依據(jù)。小兒止咳糖漿中苯甲酸鈉的處方添加量由0.5%降至0.2%，14 d 時(shí)細(xì)菌、真菌下降的lg 值均符合規(guī)定。

抑菌劑具有一定的毒性，濃度過高會對嬰幼兒產(chǎn)生潛在危害。人體每日的苯甲酸鈉允許攝入量為0 ～5 mg／kg[12]。依據(jù)藥品說明書，5 歲（體質(zhì)量約17 kg）患兒口服小兒止咳糖漿1 次5 ～10 mL，1 d 3 ～4 次，即15 ～40 mL／d，含苯甲酸鈉30 ～80 mg，已接近其允許最大攝入量（85 mg／d）。企業(yè)需進(jìn)一步優(yōu)化處方工藝，在保障抑菌效力的前提下，探討更合理的添加量。

小兒止咳糖漿中含有大量的糖類物質(zhì)，適合真菌生長。空氣中的酵母菌、霉菌可致糖漿發(fā)酵、霉變、酸敗及產(chǎn)生渾濁變質(zhì)。建議企業(yè)開發(fā)單劑量包裝，減少使用過程中的污染風(fēng)險(xiǎn)，進(jìn)而減少抑菌劑的添加量，進(jìn)一步提高藥品的安全性。

處方中甘草流浸膏、桔梗流浸膏、橙皮酊均為乙醇浸出物，有輔助抑菌作用，故抑菌效力和抑菌劑添加量不完全呈正相關(guān)，樣品A1并未顯示比樣品D 更好的抑菌效力。抑菌劑發(fā)揮抑菌效力，還需結(jié)合藥物活性成分、pH、包裝容器（如吸附作用）、輔料等因素進(jìn)一步考察[13]，但本研究中未做進(jìn)一步探討，有待后續(xù)試驗(yàn)開展研究。