周 珊，劉向榮，范秀珍

（邵陽學(xué)院附屬第一醫(yī)院藥劑科，湖南 邵陽 422000）

過敏性鼻炎（AR）是臨床常見耳鼻喉科變應(yīng)性疾病，發(fā)病率較高，臨床表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作的鼻腔瘙癢、流鼻涕、噴嚏陣發(fā)性發(fā)作、鼻塞聲重等癥狀[1－3]，臨床多使用抗組胺藥治療，但會產(chǎn)生中樞抑制作用，長期用藥療效欠佳，且副作用較多。鼻淵軟膠囊可用于AR 及鼻竇炎的治療，現(xiàn)代臨床研究顯示，其可有效改善AR 患者機體的組胺水平，減輕炎性應(yīng)激反應(yīng)。由于中藥的多成分特性[4－6]，目前關(guān)于其作用機制鮮有研究。近年來興起的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)為闡明中藥復(fù)方作用機制提供了思路，其融合了藥理學(xué)、系統(tǒng)生物學(xué)、計算生物學(xué)等多學(xué)科，從多靶點的研究策略出發(fā)將藥物－靶點網(wǎng)絡(luò)與生物系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)相結(jié)合，強調(diào)多個成分對信號通路的多途徑調(diào)節(jié)，這與中藥多成分－多靶點的特點不謀而合[7－9]。本研究中基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討了鼻淵軟膠囊干預(yù)AR 可能的作用機制，為該藥進一步應(yīng)用于臨床提供依據(jù)。現(xiàn)報道如下。

1 研究方法

1.1 有效成分篩選

通過中草藥系統(tǒng)藥理學(xué) 平臺（TCMSP）（http：／ ／tcmspw.com／tcmsp.php）捕捉藥物、靶標與疾病間可能存在的關(guān)系。數(shù)據(jù)庫中包括499 味中草藥與每味中草藥的化合物約29 000 個。以鼻淵軟膠囊各個單味藥為關(guān)鍵詞，在TCMSP 上檢索其化學(xué)成分。鼻淵軟膠囊為口服制劑，服用后需經(jīng)吸收、分布、代謝、排泄（ADME），故可根據(jù)化合物的類藥性（DL）、口服生物利用度（OB）、血腦屏障(BBB)、半衰期（HL）快速篩選出可能的活性成分，借助TCMSP 平臺，將DL≥0.18，OB≥30，BBB≥－0.3，HL≥4h 作為篩選5 味藥有機小分子活性成分的重要指標。

1.2 潛在靶點預(yù)測及化合物－潛在靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將篩選出的潛在活性成分在有機小分子數(shù)據(jù)庫PubChem（https：／ ／pubchem.ncbi.nlm.nih.gov／）中下載其Smile 格式文件，將轉(zhuǎn)化好的格式文件導(dǎo)入Swiss Target Prediction 數(shù) 據(jù) 庫（http：／ ／swisstargetprediction.ch／），選擇限定物種為Homo sapiens。運行后獲得其潛在靶點，通過P 值選取其潛在靶點。將獲得的潛在靶點名稱導(dǎo)入Uniport（https：／ ／www.uniprot.org／）數(shù)據(jù)庫獲得其official name。

1.3 AR 相關(guān)靶標篩選

通 過 檢 索GeneCards（www.genecards.org）／OMIM（http：／ ／www.omim.org／），TTD（http：／ ／bidd.nus.edu.sg／group／cjttd／），CTD（http：／ ／ctdbase.org／）等 數(shù) 據(jù)庫，將“過敏性鼻炎”“allergic rhinitis”作為檢索關(guān)鍵詞，通過P 值和靶點得分篩選高分靶點，作為與AR 相關(guān)的疾病靶點。

1.4 活性成分－潛在靶點網(wǎng)絡(luò)和AR 疾病核心靶點蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI）構(gòu)建

通過構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，有助于從生物化學(xué)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等系統(tǒng)的角度詮釋治療疾病分子調(diào)控機制。將1.3 項下收集的鼻淵軟膠囊活性成分潛在靶點和AR 疾病靶點上傳至韋恩圖在線繪圖軟件Venny 2.1（https：／ ／bioinfogp.cnb.csic.es／tools／venny／index.html），獲 取 其潛在靶點和疾病靶點的交集靶點，將重合的靶點作為鼻淵軟膠囊干預(yù)AR 的核心靶點，將其導(dǎo)入String（https：／ ／string－db.org／），得到交集靶點蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1 軟件，構(gòu)建鼻淵軟膠囊活性成分－潛在靶點網(wǎng)絡(luò)和AR PPI。

1.5 核心靶點基因本體論（GO）及京都基因和基因組百科全書（KEGG）富集

將鼻淵軟膠囊干預(yù)的AR 核心靶點導(dǎo)入DAVID 數(shù)據(jù)庫，限定物種為“Homo sapiens”，DAVID 數(shù)據(jù)庫可將生物信息資源融為一體，綜合闡述蛋白或基因的生物學(xué)功能。對核心靶點進行GO 富集和KEGG 通路分析，其中GO 富集包括分子功能、生物過程、細胞組成三部分，設(shè)定閾值P ＜0.05，保存結(jié)果，并按涉及的靶點數(shù)目多少進行排序，篩選排名靠前的生物過程或通路，選取排名前20的GO 富集結(jié)果及KEGG 通路富集結(jié)果，采用Python 軟件對結(jié)果進行可視化分析，總結(jié)鼻淵軟膠囊調(diào)節(jié)AR 可能的作用機制，并構(gòu)建化合物－核心靶點－通路圖。

2 結(jié)果

2.1 活性成分篩選

共收集到40 個化學(xué)成分，其中蒼耳子6 個、金銀花8 個、野菊花4 個、辛夷12 個、茜草10 個，詳見表1(因篇幅有限，省去Molecule Name)。

表1 鼻淵軟膠囊中活性成分篩選結(jié)果Tab.1 Results of screening active ingredients of Biyuan Soft－Capsules

2.2 潛在靶點預(yù)測及PPI 構(gòu)建

獲得潛在活性成分靶點421 個，去重后得到244 個。構(gòu)建化合物－靶點網(wǎng)絡(luò)，詳見圖1。

圖1 鼻淵軟膠囊潛在靶點預(yù)測及化合物－潛在靶點網(wǎng)絡(luò)Fig.1 Prediction of potential targets and the network of compound－potential targets of Biyuan Soft－Capsules

2.3 活性成分干預(yù)AR 的核心靶點篩選

通過Genecard，OMIM，CTD 等靶點基因數(shù)據(jù)庫篩選AR 相關(guān)靶點，去重后獲得AR 靶點294 個，將2.2 項下預(yù)測的潛在靶點與AR 疾病靶點相互映射，最終獲得鼻淵軟膠囊可能干預(yù)AR 的相關(guān)靶點52 個，導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫，并將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 軟件繪制靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)，節(jié)點的度值和介值中心度為描述網(wǎng)絡(luò)節(jié)點重要性的指標[10]，這2 個指標調(diào)節(jié)顏色深淺和大小，以表示該節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)中的重要程度，詳見圖2。通過Cytoscape 3.7.1 中的NetworkAnalyzer 功能進行網(wǎng)絡(luò)拓撲學(xué)分析，經(jīng)計算該PPI 網(wǎng)絡(luò)共有67 個節(jié)點，1 238 條邊，網(wǎng)絡(luò)介度中心度為0.454。

圖2 鼻淵軟膠囊活性成分干預(yù)過敏性鼻炎核心靶點網(wǎng)絡(luò)Fig.2 PPI network of core targets of active ingredients of Biyuan Soft－Capsules in the intervention of allergic rhinitis

2.4 核心靶點GO 富集和KEGG 通路分析

對獲得的67 個鼻淵軟膠囊干預(yù)AR 作用靶點進行GO 富集和KEGG 通路注釋分析，結(jié)果見圖3。生物學(xué)過程富集到P≤0.01 的生物過程有375 條。主要涉及對多肽反應(yīng)、細胞遷移的正調(diào)控、細胞因子介導(dǎo)的信號通路、循環(huán)系統(tǒng)過程等；分子功能富集結(jié)果中，富集到P≤0.01 的分子功能有92 條，主要涉及激酶結(jié)合、核受體活性、磷酸轉(zhuǎn)移酶活性等；細胞組成富集結(jié)果中，富集到P≤0.01 的細胞組成有18 個，涉及細胞組成受體復(fù)合物、膜筏、質(zhì)膜等。以上結(jié)果分別選取前20 條（其中GO 富集選取18 條），以對數(shù)(－lg P)值排序，繪制柱狀圖。其中，縱坐標為GO 條目名稱，橫坐標為靶點數(shù)目值，其值表示富集在該GO 條目上的靶點數(shù)，柱狀長度代表P 值，以－lg P 表示。67 個核心靶點主要參與調(diào)控炎癥通路、氧化應(yīng)激通路?？梢姡菧Y軟膠囊的活性成分可能通過參與調(diào)控上述信號通路干預(yù)AR。

圖3 鼻淵軟膠囊干預(yù)AR 作用靶點生物學(xué)分析結(jié)果Fig.3 Results of biological analysis of target of Biyuan Soft－Capsules in the intervention of allergic rhinitis

3 討論

AR 屬常見鼻黏膜非感染性炎性疾病，患者接觸變應(yīng)原后由免疫球蛋白E(IgE)介導(dǎo)的炎性應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致組胺釋放增加及多種免疫活性細胞及細胞因子參與的鼻黏膜慢性非感染性炎性疾病[11]，可引發(fā)陣發(fā)性打噴嚏、鼻癢、鼻塞等癥狀，嚴重時誘發(fā)其他疾病，甚至使患者喪失勞動力。其發(fā)病機制復(fù)雜，涉及遺傳、變應(yīng)原暴露、環(huán)境等因素，涉及炎性刺激、細胞凋亡、氧化應(yīng)激等各個方面[12－13]。因此，單一使用化學(xué)藥難以獲得滿意的療效。AR 屬中醫(yī)“鼻鼽”范疇，多見于肺氣、脾氣、腎氣虛衰，導(dǎo)致抵御外邪不足、情志失調(diào)，鼻竅失養(yǎng)，肺氣宣發(fā)肅降受阻[14]。鼻淵軟膠囊，由蒼耳子、金銀花、野菊花、辛夷、茜草制成，有清熱解毒、發(fā)散風(fēng)寒、通鼻竅等功效。臨床常用來治療AR 的鼻塞等癥狀?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，鼻淵軟膠囊具有收縮鼻黏膜血管的作用，并能促進分泌物吸收，從而改善鼻孔的通氣功能。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)以“活性成分－靶點－疾病”多層次的相互作用網(wǎng)絡(luò)為理念，結(jié)合對生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫進行篩選和預(yù)測，運用可視化網(wǎng)絡(luò)分析軟件，綜合觀察藥物對疾病網(wǎng)絡(luò)的干預(yù)和影響，具有整體性、系統(tǒng)性特點[15]。本研究中發(fā)現(xiàn)，鼻淵軟膠囊可能干預(yù)AR 的52 個核心靶點，同時發(fā)現(xiàn)其有效成分為揮發(fā)油類。通過進行“藥效成分－靶標－通路”網(wǎng)絡(luò)拓撲分析發(fā)現(xiàn)，鼻淵軟膠囊的有效成分可作用于不同靶點與同一通路相連，相同靶點也可與不同通路相連，說明該藥可能通過多成分、多靶點及多途徑發(fā)揮藥效。

本研究中，鼻淵軟膠囊中40 個潛在活性成分共涉及40 個成分、128 條通路，52 個核心靶標蛋白和15 條通路與AR 相關(guān)。分析結(jié)果表明，鼻淵軟膠囊可能通過作用于神經(jīng)活性受體配體相互作用通路、HIF－1 通路、鈣信號通路、膽堿能突觸通路等通路相關(guān)的靶標起到通鼻竅的功效。初步揭示了鼻淵軟膠囊的潛在活性成分及其可能的作用機制，為進一步的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制研究提供了理論依據(jù)。本研究雖采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法對鼻淵軟膠囊主要藥效成分的機制作了預(yù)測分析，但還需通過生物學(xué)技術(shù)進一步驗證。