覃開羽，張 蓓，王 瑩，萬永艷，梁學(xué)政，吳 敏

（廣西壯族自治區(qū)柳州市中醫(yī)醫(yī)院，廣西 柳州 545026）

水楊梅為茜草科植物水楊梅Adina rubella Hance的干燥帶花果序[1－2]，一般分布在廣西、湖南、四川、福建、臺(tái)灣、廣東等地，好生于溪邊、河邊、沙灘等濕潤(rùn)處，有清熱利濕、解毒消腫功效，主要用于治療濕熱泄瀉、痢疾、濕疹、瘡癤腫毒、風(fēng)火牙痛、跌打損傷、外傷出血等。水楊梅具有抗腫瘤、抗病毒、抗菌、抗氧化等生物活性，其中抗氧化活性尤其顯著[3]。水楊梅發(fā)揮抗氧化作用的有效成分為酚酸類化合物，此化合物具有酚羥基結(jié)構(gòu)[4]。本課題組擴(kuò)大思路，擬從水楊梅中發(fā)現(xiàn)新的抗氧化活性成分[5－8]。鑒于黃酮類成分同樣具有酚羥基結(jié)構(gòu)，故也應(yīng)具有抗氧化作用。為此，本研究中以水楊梅總黃酮為指標(biāo)性成分，通過比較大孔吸附樹脂法、石灰乳－硫酸法及萃取法考察最佳純化工藝，通過超高效液相色譜－四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC－Q－TOF－MS）法表征純化前后的黃酮類成分，并研究其抗氧化作用，為水楊梅的抗氧化作用研究提供參考[9－12]。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

L5 型紫外分光光度計(jì)（上海儀電分析儀器有限公司）；KR 型80－2 離心沉淀器（常州市康仁醫(yī)療器械有限公司）；PHS－3C 型酸度計(jì)（上海光學(xué)儀器廠）；DKS26 型電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司／太倉(cāng)精宏儀器設(shè)備有限公司）；UPLC QTOF MS6545 型色譜儀，超高效液相色譜－四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國(guó)Agilent 公司）；GWB－1 超純水系統(tǒng)；層析柱（2.5 cm×23 cm／3.5 cm×33 cm）；RE－5299 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；AL204 型電子天平（梅特勒－托利多儀器＜上海＞有限公司）。

1.2 試藥

水楊梅，購(gòu)自廣西貴港綠之源中藥飲片廠，經(jīng)我院吳冰副主任藥師鑒定為草科水楊梅的莖皮；蘆丁對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為100080－201610，含量≥99%）；ABTS（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)為20190711）；DPPH（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)為20190731）；維生素C（天津力生制藥股份有限公司，批號(hào)為2002008）；HPD－100 型大孔吸附樹脂；水飽和正丁醇、甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

取蘆丁對(duì)照品10 mg，精密稱定，加甲醇溶解并定容至50 mL，即得質(zhì)量濃度為0.2 mg／mL 的蘆丁對(duì)照品溶液。稱取水楊梅藥材樣品粉末10 g，置錐形瓶中，加入15 倍量的70%乙醇，溫度80 ℃，回流提取1 h，濾過，濃縮，即得供試品溶液。

2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)確定

取蘆丁對(duì)照品溶液5 mL，置25 mL 容量瓶中，加水至6 mL，加入1 mL 5% 亞硝酸鈉溶液，搖勻，靜置6 min；加入1 mL 10%硝酸鋁溶液，搖勻，靜置6 min；加10 mL 4%氫氧化鈉溶液，用水定容，搖勻，放置15 min。在400 ～600 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，結(jié)果蘆丁對(duì)照品在510 nm 波長(zhǎng)處有最大吸收峰，故以510 nm 作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.3 線性關(guān)系考察

精密量取蘆丁對(duì)照品溶液1，2，3，4，5 mL，按2.2 項(xiàng)下方法操作至“放置15 min”。用紫外分光光度計(jì)在510 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)（Y）、蘆丁對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X，μg／mL）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y ＝0.013 3 X－0.008 5，R2＝0.999 6（n ＝5）。結(jié)果表明，蘆丁質(zhì)量濃度在8 ～40 μg／mL 范圍為與吸光度線性關(guān)系良好。

2.4 大孔樹脂預(yù)處理和裝柱

大孔吸附樹脂用去離子水浸泡10 h，使之充分溶脹，濾去水、浮游物和破碎樹脂后，水洗至澄清。再用2 mol／L 氫氧化鈉浸泡8 ～10 h，并不時(shí)攪拌，除去堿液，水洗至中性，再經(jīng)2 mol／L HCl 浸泡8 ～10 h，并不時(shí)攪拌，以除去新樹脂中的各種雜質(zhì)，除去酸液后水洗至中性，然后用95%乙醇浸泡4 ～6 h，并不時(shí)攪拌，濾去乙醇，繼續(xù)用甲醇洗脫至洗出液滴入水中不呈乳白色混濁為止，再用去離子水洗去甲醇，濕法裝柱[13－14]。裝柱前先在柱中加入一定量的水，將帶水的樹脂漿液倒入柱中，將過量的水從柱底放出，保持水面高于樹脂層面3 cm，并使樹脂分布均勻[15]。

2.5 成分分析

色譜條件：色譜柱為Agilent Eclipse Plus C18柱（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相為甲醇（A）－水（B），梯度洗脫（0 ～5 min 時(shí)15%A，5 ～10 min 時(shí)23%A，10 ～20 min 時(shí)35%A)；流速為0.2 mL ／ min；柱溫為25 ℃；進(jìn)樣量為10 μL。

質(zhì)譜條件：采用電噴式離子源（ESI）、正離子檢測(cè)模式，IDA 掃 描，離子噴霧電壓分別為（ESI＋）55 kV，（ESI－）－4 500 V，去簇電壓（DP）分別為100 V／－100 V；碰撞電壓（CE）為35 eV；霧化氣（gas 1）氣壓為55 psi；輔助加熱器（gas 2）氣壓為55 psi；氣簾氣（CUR）氣壓為35 psi；去溶劑溫度（TEM）為500 ℃；掃描范圍（TOF MASSES）m／ z 100 ～2 000；碰撞活化掃描（CES）為15 eV。

成分分析：供試品溶液按前述色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析純化前后最佳工藝富集部位的主要成分。利用Qualitative Analysis V10.0 分析軟件，分別提取正、負(fù)離子模式下采集的樣品溶液的基峰離子流圖，參考文獻(xiàn)[16－17]，再分別結(jié)合數(shù)據(jù)庫匹配和已有文獻(xiàn)報(bào)道比對(duì)，并對(duì)其m／ z 及化學(xué)式進(jìn)行分析[18]，對(duì)其中的黃酮類成分進(jìn)行歸屬，定性鑒別純化前富集部位中的36 個(gè)黃酮類成分和純化后富集部位的28 個(gè)黃酮類成分。結(jié)果見表1 和表2。

表1 純化前的水楊梅黃酮類成分分析Tab.1 Analysis of flavonoids of Adina rubella before the purification

表2 純化后的水楊梅黃酮類成分分析Tab.2 Analysis of flavonoids of Adina rubella after the purification

2.6 3 種純化方法比較

2.6.1 石灰乳－硫酸法

將水楊梅總黃酮提取液濃縮至30 mL，用石灰乳調(diào)pH 至12，充分反應(yīng)，再用硫酸調(diào)pH 至5 ～6，持續(xù)攪拌，靜置濾過，濾渣水洗3 次，濾液并入洗液，濃縮，再用95%乙醇定容至50 mL，待測(cè)。

2.6.2 萃取法

將水楊梅總黃酮濃縮液30 mL 依次用20 mL 石油醚、乙醚、乙酸乙酯、水飽和正丁醇各萃取3 次，回收溶劑，將萃取液濃縮蒸干，用95%乙醇溶解，并定容至50 mL 容量瓶中，待測(cè)。

2.6.3 大孔樹脂吸附法

樹脂靜態(tài)吸附試驗(yàn)：1)吸附時(shí)間考察。取大孔吸附樹脂3.0 g，置100 mL 具塞錐形瓶中，精密加入已知水楊梅總黃酮質(zhì)量濃度（P0）的提取液20 mL，將錐形瓶置35 ℃振蕩水槽中振蕩（140 次／分），每隔2 h 測(cè)定1 次待測(cè)液質(zhì)量濃度（P1），測(cè)定時(shí)間設(shè)定為2，4，6，8，10 h，測(cè)定至樹脂吸附飽和為止，分別計(jì)算每個(gè)時(shí)間段的吸附率Va[ Va ＝（P0－ P1）／ P0×100% ]，繪制靜態(tài)等溫吸附動(dòng)力曲線。結(jié)果見圖1 A?？芍?，吸附率隨吸附時(shí)間的延長(zhǎng)而上升，當(dāng)吸附時(shí)間為8 h 時(shí)吸附率達(dá)到平衡。2)pH考察。取4 份水楊梅總黃酮提取液待測(cè)液，測(cè)定P0，將待測(cè)液的pH 分別調(diào)至5.44，5.47，5.50，5.52，各取20 mL，與1.5 g 樹脂裝于具塞錐形瓶中，置35 ℃振蕩水槽中振蕩（140 次／分）10 h 后靜置，測(cè)定P1，計(jì)算吸附率。結(jié)果見圖1 B?？芍?，吸附率在pH 達(dá)5.47 前有上升趨勢(shì)，達(dá)5.47 時(shí)最高，之后呈下降趨勢(shì)。3)洗脫劑體積分?jǐn)?shù)考察。移取3 份已充分吸附水楊梅總黃酮的樹脂，置具塞錐形瓶中，分別加入30 mL 體積分?jǐn)?shù)分別為30% ，40%，50%，60%，70%，80%的乙醇，置35 ℃振蕩水槽中振蕩（140 次／分）后靜置，使黃酮從樹脂上解析，分別測(cè)定洗脫液濃度（C），計(jì)算洗脫率(洗脫率＝洗脫液濃度×洗脫液體積／飽和吸附量)。結(jié)果見圖1 C。可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%時(shí)的洗脫率最高，故在進(jìn)行樹脂吸附黃酮的動(dòng)態(tài)洗脫時(shí)，選用50%乙醇作為洗脫劑。

圖1 樹脂靜態(tài)吸附的影響因素Fig.1 Factors affecting static adsorption of resin

樹脂動(dòng)態(tài)吸附試驗(yàn)：1)動(dòng)態(tài)吸附泄漏曲線。以提取液－樹脂體積比為橫坐標(biāo)、吸附率為縱坐標(biāo)考察泄漏曲線，當(dāng)達(dá)到平衡時(shí)，吸附速率與洗脫速率相等。結(jié)果見圖2 A?？芍?dāng)提取液達(dá)到7 倍量的樹脂體積時(shí)，水楊梅總黃酮開始出現(xiàn)明顯泄漏，達(dá)到吸附飽和時(shí)，可處理12 倍量樹脂的提取液，故確定水楊梅總黃酮提取液最大上柱體積為540 mL。2)動(dòng)態(tài)洗脫曲線。以洗脫液體積為橫坐標(biāo)、洗脫液體積分?jǐn)?shù)為縱坐標(biāo)繪制樹脂的動(dòng)態(tài)洗脫曲線，結(jié)果見圖2 B?？芍?dāng)洗脫液體積超過160 mL時(shí)，洗脫液體積分?jǐn)?shù)呈逐漸下降趨勢(shì)，說明水楊梅總黃酮在洗脫液體積為160 mL 時(shí)可洗脫完全，而后逐漸減少。

圖2 樹脂動(dòng)態(tài)吸附試驗(yàn)曲線圖Fig.2 Curve of resin dynamic adsorption test

2.6.4 效果比較

大孔樹脂法中，提取液體積為315 mL 左右時(shí)，水楊梅總黃酮開始出現(xiàn)明顯泄漏，洗脫劑體積約為540 mL時(shí)，樹脂的解析達(dá)到平衡。將上述動(dòng)態(tài)吸附和動(dòng)態(tài)洗脫條件下得到的洗脫液進(jìn)行濃縮、真空干燥、粉碎，得精制后的水楊梅總黃酮提取物，測(cè)定其總黃酮的得率為0.643%，純度為57.33%。

經(jīng)石灰乳－硫酸法所得產(chǎn)物，經(jīng)分光光度計(jì)測(cè)定其吸光度，計(jì)算其中所含總黃酮濃度，再將其烘干稱定質(zhì)量，3 次平行試驗(yàn)后，測(cè)得水楊梅總黃酮得率為0.873%，純度為33.17%。

水楊梅總黃酮粗提物依次經(jīng)石油醚、乙醚、乙酸乙酯、水飽和正丁醇萃取，平行試驗(yàn)3 次，經(jīng)測(cè)定水楊梅總黃酮得率為1.103%，純度為36.35%。

可見，測(cè)定水楊梅總黃酮的純度大小依次為大孔樹脂法＞萃取法＞石灰乳－硫酸法。

2.7 水楊梅總黃酮抗氧化活性

2.7.1 溶液制備

ABTS 溶液：將7 mmol／L ABTS 無水乙醇溶液與2.45 nmol／L 過硫酸鉀溶液等體積混合，室溫避光放置16 h，形成ABTS 貯備液。使用時(shí)用無水乙醇稀釋成734 nm 波長(zhǎng)處吸光度為0.7±0.02 的工作液。

DPPH 溶液：取DPPH 適量，精密稱定，置容量瓶中，加入無水乙醇溶解并定容，得DPPH 溶液。避光操作。

PBS：分別取Na2HPO4和NaH2PO4粉末適量，精密稱定，置容量瓶中，加入去離子水溶解并定容，得相應(yīng)溶液，混合，得pH 6.60 PBS。

2.7.2 抗氧化活性測(cè)定

ABTS 自由基清除率：取ABTS 工作液適量，置試管中，加提取物樣品溶液，混勻，室溫下反應(yīng)，以維生素C為參照進(jìn)行比較，在734 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度。以無水乙醇作陰性對(duì)照，計(jì)算清除率。清除率＝（1－ A1／ A0）×100%。其中，A1為加入供試品后的吸光度，A0為陰性對(duì)照的吸光度。結(jié)果清除率為84.89%。

DPPH 自由基清除率：將0.1 mL 提取物樣品溶液及維生素C 溶液分別加入一定量的DPPH 溶液，迅速混勻，置37 ℃水箱中30 min 后，在517 nm 波長(zhǎng)處進(jìn)樣測(cè)定，以等體積水和無水乙醇混合液空白調(diào)零，以維生素C作陰性對(duì)照。結(jié)果清除率為48.69%。

鐵還原能力：取提取物樣品溶液、PBS 和鐵氰化鉀溶液置試管中，混勻，50 ℃反應(yīng)20 min，加入10%三氯乙酸終止反應(yīng)，3 000 r／min 離心10 min，取上清液，加水和三氯化鐵溶液，混勻，10 min 后，于700 nm 波長(zhǎng)處進(jìn)樣測(cè)定。以維生素C 為陽性對(duì)照，吸光度為0.823 3，提取物樣品溶液吸光度為0.743 3。

3 討論

3.1 3 種分離純化方法比較

黃酮類成分的分離純化方法較多，如聚酰胺柱層析法、液－液萃取法、大孔樹脂吸附法，以及超臨界萃取法、超濾法、溶劑氣浮等新技術(shù)。本研究中從操作性、經(jīng)濟(jì)性、有效性3 個(gè)方面綜合考慮，最終選擇了萃取法、石灰乳－硫酸法、大孔吸附樹脂法3 種分離純化方法。

萃取法是運(yùn)用幾種不同極性的有機(jī)溶劑將水楊梅粗提物除黃酮外的其他成分提取分離。由于相似相溶的原理，極性相似的成分均可被分離出來，但與黃酮極性相似的成分同樣可保留下來。此方法雖然操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)短，但重復(fù)操作萃取步驟易造成有效成分損耗過多，且使用多種極性溶劑成本過高，易造成環(huán)境污染，后期回收難度大，提純率也欠佳，故不是分離純化黃酮類成分的最佳方法。

石灰乳－硫酸法是簡(jiǎn)單的分離方法，利用“堿提酸沉”的方法提取分離黃酮類成分。黃酮類成分含有多個(gè)酚羥基，顯弱酸性，易溶于堿性溶液而遇酸性溶液則沉淀析出。本操作雖然簡(jiǎn)單易行，但對(duì)于溶液的酸堿度要求較嚴(yán)格，若堿濃度過高易破壞黃酮母核，影響有效成分的提取，酸性也不宜過強(qiáng)，以免生成鹽致使析出的沉淀又重新溶解，降低產(chǎn)品得率。結(jié)果證實(shí)，此方法的總黃酮得率略低，故不作最佳提取方法。

大孔吸附樹脂屬有機(jī)高聚物吸附劑，具有選擇性好、吸附量大等特點(diǎn)，且再生處理簡(jiǎn)便，尤其適用于黃酮類成分的分離純化，也利于大規(guī)模生產(chǎn)[19－22]。大孔吸附樹脂法最大的不足在于耗時(shí)長(zhǎng)，成本花費(fèi)主要在時(shí)間上。從樹脂的活化操作開始，直至純化過程中樹脂的吸附、洗脫，均需耗費(fèi)大量時(shí)間。且大孔吸附是由于物理吸附的原理，依靠分子之間的范德華力，通過比表面進(jìn)行物理吸附而工作，不受化學(xué)試劑的影響，損耗較小。此方法最終得到分離純化的黃酮類成分得率遠(yuǎn)高于其他2 種方法，故本研究中選擇其作為最佳分離純化工藝。

3.2 化合物表征

本研究中運(yùn)用UPLC－Q－TOF／MS 技術(shù)，通過比對(duì)數(shù)據(jù)庫匹配度較高的黃酮類成分進(jìn)行了初步分析，有效表征了純化前（36 個(gè)）、純化后（28 個(gè)）水楊梅的黃酮類成分[23－27]，其中有9 種為相同的黃酮類化合物?？赡苁怯捎诩兓に嚨挠绊?，導(dǎo)致某些黃酮類化合物不被富集，純化后檢測(cè)出新的黃酮類化合物則可能是由于富集后有效提高了該類化合物的含量，故能被儀器所識(shí)別。這與純化后檢出的化合物總數(shù)多于純化前的情況相符。本研究中通過初步結(jié)構(gòu)表征結(jié)合抗氧化活性的文獻(xiàn)報(bào)道，對(duì)水楊梅有抗氧化活性的黃酮類成分進(jìn)行初步歸屬，發(fā)現(xiàn)槲皮素類成分發(fā)揮了主要作用。

3.3 抗氧化活性測(cè)定

本研究中抗氧化能力的3 種方法體外測(cè)定機(jī)制不完全一致，其中ABTS 法、DPPH 法以清除自由基為基礎(chǔ)，鐵還原法主要通過測(cè)定待測(cè)物的還原能力。

ABTS 法、DPPH 法均會(huì)生成新的配對(duì)化合物，吸光度也隨之改變，故可通過比色法進(jìn)行定量分析，從而判定抗氧化成分的活性。鐵還原法是當(dāng)試劑與抗氧化成分反應(yīng)后，在酸性條件下與三氯化鐵反應(yīng)生成普魯士藍(lán)，在700 nm 波長(zhǎng)處有吸收，從而判定其抗氧化活性。

3 種方法均利用吸光度原理進(jìn)行抗氧化活性測(cè)定，方法簡(jiǎn)單易行，且重復(fù)性好，3 種反應(yīng)強(qiáng)度均與抗氧化成分的活性呈量效關(guān)系，結(jié)果均證實(shí)水楊梅總黃酮有一定抗氧化活性。但本研究中僅探討了水楊梅是否具有抗氧化活性，并未作進(jìn)一步的活性分析。具體是何種成分發(fā)揮了作用，有待運(yùn)用對(duì)照品結(jié)合一級(jí)質(zhì)譜相對(duì)分子量、二級(jí)質(zhì)譜裂解結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，從而為下一步抗氧化試驗(yàn)打下基礎(chǔ)。