高 鵬，李 愷，張若冰，艾 林△

（1. 中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)第九八六醫(yī)院，陜西 西安 710054； 2. 陜西省藥品監(jiān)督管理局，陜西 西安 710065）

種植體周圍炎為生物膜依賴性疾病，其始動因素通常為生物膜，其中的致病微生物主要包含牙周致病菌（牙齦卟啉單胞菌、中間普氏菌）、糖化細菌（變形鏈球菌、血鏈球菌）和真菌（念珠菌）[1－2]。種植體周圍生物膜中約30%的微生物為念珠菌屬真菌[3]。含有大量致病菌的生物膜會導(dǎo)致種植體脫落，而使手術(shù)失敗。目前，種植體周圍炎的治療主要包括碳纖維牙周器械刮治、超聲波潔治等物理療法，效果均欠佳[4]。使用抗菌漱口水是臨床最普遍的維護方法[5]，其中氯己定漱口液為常規(guī)治療藥物[6]，但長時間使用會產(chǎn)生黏膜損傷、牙齒和黏膜染色、味覺退化、口干等不良反應(yīng)[7]。故尋找具有抗菌能力強、副作用少的生物活性分子和天然產(chǎn)物成為近年來種植體周圍炎預(yù)防的研究熱點。沒食子為中醫(yī)常用藥材[8]，其性寒、味苦，有固澀、收斂、燥濕、止血作用，已被證明具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化和抗菌活性[9]。其有效成分主要為提取物中的沒食子鞣質(zhì)、沒食子酸、沒食子酸烷基酯等。沒食子臨床已用于制備漱口液和義齒清潔劑，治療生物膜依賴性疾病，但沒食子提取物對種植體周圍微生物環(huán)境的影響尚未明確。本研究中評估了沒食子水提物對鈦表面黏附的白色念珠菌生物膜和其與光滑念珠菌共培養(yǎng)生物膜的抑制作用，為沒食子在種植術(shù)后維護的臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與菌株

儀器：Objet30 OrthoDesk 3D 打印機（以色列Stratasys 公司）；752 型紫外－可見分光光度儀、倒置顯微鏡（日本Olympus 公司）；Form Talysurf series 輪廓分析儀（英國Taylor Hobson 公司）。

試藥：沒食子藥材（新疆奇康哈博維藥有限責任公司，批號為20161112）；氯己定漱口液（南粵藥業(yè)有限公司，批號為20210123）；RPMI 1640 培養(yǎng)基、DMEM 培養(yǎng)基、四氮唑鹽(MTT)試劑盒（美國Sigma 公司）；沙氏葡萄糖肉湯培養(yǎng)基（SDB，USP 標準，德國Merck KGaA 公司）。

菌株：白色念珠菌（ATCC 90028）、光滑念珠菌（ATCC 2001），均由空軍軍醫(yī)大學(xué)口腔內(nèi)科學(xué)實驗室提供。

1.2 方法

生物膜培養(yǎng)：復(fù)蘇白色念珠菌和光滑念珠菌，在37 ℃溫度條件下的SDB 培養(yǎng)基上進行有氧培養(yǎng)。再將細胞懸浮液（細胞密度1×106mL－1）在RPMI 1640 培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，5 000 r／min 離心5 min，用無菌0.9%氯化鈉溶液洗滌2 次，轉(zhuǎn)移至RPMI 1640 培養(yǎng)基中。

標本制備與分組：使用3D 打印機制備鈦盤（1.3 cm×0.2 cm），并用研磨膏和陶瓷顆粒拋光12 h。用75%乙醇清洗鈦盤，高溫（121 ℃）、高壓（1.1 bar）滅菌20 min。將樣本分為3 組，各12 例。試驗組為10 μmol／L沒食子水提物，陽性對照組為氯己定漱口液，陰性對照組為無菌0.9%氯化鈉溶液。

標本處理：將沒食子藥材粉碎為粗粉，加水（質(zhì)量比1 ∶5）浸泡4 h，煎煮3 次，并分別濾過，每次1 h，合并煎液后濾過；真空干燥為浸膏后稱定質(zhì)量，分裝，待用。將鈦盤標本浸入人工唾液（含1%羧甲基、0.008 4%氯化鈉、0.12%氯化鉀、0.034 2%磷酸鉀及0.014 6%氯化鈣）中誘導(dǎo)形成唾液膜，置24%氯化鎂溶液中，24 ℃溫度條件下孵育30 min。將RPMI 1640 培養(yǎng)基（細胞密度1×106mL－1）制成的微生物細胞懸浮液分別與RPMI 1640 培養(yǎng)基（10 倍稀釋液）混合培養(yǎng)，在鈦盤面上形成單種白色念珠菌生物膜和白色念珠菌與光滑念珠菌共培養(yǎng)生物膜，37 ℃微需氧環(huán)境（用1 個帶蠟燭的厭氧罐來減少氧氣含量）下孵育培養(yǎng)24 h，后分離細胞懸液，將鈦盤標本用0.9%氯化鈉溶液沖洗2 次。從生物膜形成起24，48，72 h 將鈦盤標本置合成溶液中，培養(yǎng)基每24 h更換1 次。在每個時間節(jié)點末，將樣本浸入3 組受試物質(zhì)中，并保持接觸10 min。然后使用無菌0.9%氯化鈉溶液清洗2 次，更新培養(yǎng)基，然后在37 ℃微氧條件下繼續(xù)孵育培養(yǎng)。96 h 時檢測樣本。

細胞活力分析：將樣本轉(zhuǎn)移到含有1 mL 無菌0.9%氯化鈉溶液的試管中，在攪拌器中攪拌1 min 后對樣本進行連續(xù)稀釋，制成系列稀釋液，并確定活菌的含量（10－1～10－6）。取10 μL 進行等分樣本，并分3 份接種在SDB 培養(yǎng)基上，37 ℃溫度條件下培養(yǎng)48 h，讀取菌落計數(shù)。計數(shù)活細胞數(shù)并乘以連續(xù)稀釋值。數(shù)據(jù)以每1 mL 的菌落數(shù)（cfu／mL）表示。

細胞代謝測定：采用MTT 法。在37 ℃溫度條件下含有10%MTT 的600 μL 培養(yǎng)基中避光孵育培養(yǎng)4 h。去除上清液，并加入600 μL 異丙醇酸后進行樣品均質(zhì)。收集上清液，在570 nm 波長處檢測吸光度。

表面粗糙度分析：使用輪廓分析儀評估鈦盤標本生物膜的表面粗糙度，生物膜的復(fù)雜性和厚度與表面粗糙度呈正相關(guān)。將生物膜置2.5%戊二醛水溶液中24 h，并通過增加乙醇循環(huán)（50% ～100%）在室溫下脫水。20 倍放大倍率下分別對鈦盤標本的上面、側(cè)面進行表面粗糙度測量（3 倍速度）。以表面無生物膜作基線對照。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 22.00 統(tǒng)計學(xué)軟件分析。對細胞計數(shù)進行對數(shù)變換，以便于統(tǒng)計。統(tǒng)計分析采用單因素方差分析和Tukey 檢驗。P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 生物學(xué)活性檢測

生物膜細胞活力檢測結(jié)果見圖1。氯己定和沒食子水提物對單菌種及共培養(yǎng)生物膜均有抑制作用（P ＜0.05），對于共培養(yǎng)生物膜，氯己定的抑制作用更強（P ＜0.05）。生物膜代謝活性檢測結(jié)果見圖2?？梢姡燃憾ê蜎]食子水提物均可顯著降低單菌種及共培養(yǎng)生物膜的代謝，但兩者無顯著差異（P ＞0.05）。

圖1 生物膜細胞活力Fig.1 Cell viability of biofilm

圖2 生物膜細胞代謝活性Fig.2 Metabolic activity of biofilm

2.2 表面粗糙度檢測

結(jié)果見圖3?？梢?，在白色念珠菌的單種生物膜中，陽性對照組與試驗組樣本的表面粗糙度與基線比較無顯著差異（P ＞0.05），但與陰性對照組比較有顯著差異（P ＜0.05）。對于共培養(yǎng)生物膜，陽性對照組標本與基線比較無顯著差異（P ＞0.05），但與陰性對照組和試驗組比較有顯著差異（P ＜0.05）。

圖3 生物膜表面粗糙度Fig.3 Surface roughness of biofilm

3 討論

近年來，隨著口腔種植手術(shù)的廣泛推廣，種植體得到了大規(guī)模應(yīng)用，術(shù)后并發(fā)種植體周圍炎的數(shù)量逐年增長，目前的治療方案主要包括化學(xué)和機械干預(yù)[10]，以及天然產(chǎn)物的應(yīng)用。

局部使用抗菌藥物是防止生物膜發(fā)生、發(fā)展的有效方法，特別是對于難清潔的口內(nèi)區(qū)域（如種植體周圍部位）。氯己定溶液雖已被廣泛用于口腔生物膜控制，但其對黏膜的毒性作用影響了其長期使用[11]。合理的口內(nèi)抗菌藥物在實施抗菌治療時不能影響細胞增殖，并在控制感染的同時不能對深層組織造成嚴重損害。沒食子水提物是本課題組長期研究的中藥物質(zhì)，其具有固澀、收斂、燥濕、止血作用，以及抗炎、抗腫瘤、抗氧化和抗菌活性。其有效成分中的鞣質(zhì)具有抗炎活性，是制作漱口水的必要條件[11]。本研究中使用了自制的沒食子水提物，并充分考慮了稀釋的濃度及吞咽后口腔中可能的稀釋度。

研究顯示，沒食子對葡萄球菌、內(nèi)氏放線菌、部分革蘭陰性菌等微生物均有抑制作用[12]。本研究結(jié)果表明，沒食子水提物可顯著抑制白色念珠菌單種生物膜中的細胞活力，且明顯強于共培養(yǎng)生物膜的抑制效果，說明沒食子對不太復(fù)雜的生物膜的潛在抑制效果更好，這可能是因為成分簡單的生物膜具有較低的細胞黏附和增殖能力，因此抗菌物質(zhì)可更好地抵達生物膜細胞中。本研究結(jié)果表明，沒食子與氯己定的抑菌效果相似，但何種天然植物化學(xué)物質(zhì)與抗菌活性有關(guān)，以及沒食子對不同細胞系和組織共培養(yǎng)的影響均需進一步研究。

生物膜表面粗糙度檢測結(jié)果表明，沒食子水提物和氯己定降低生物膜細胞活力和代謝活性的效果均較好。本研究結(jié)果顯示，化學(xué)清洗液并不能完全有效地對鈦盤標本表面消毒，即使在連續(xù)的抗菌溶液清洗后，仍存在部分殘留的生物膜，但清洗過程有助于減少微生物負荷。在本研究條件下，沒食子水提物降低了生物膜負荷和活性，可降低體內(nèi)生物膜失衡的風險。

本研究中通過細菌黏附到鈦盤表面的體外模型來模擬種植體周圍的單種白色念珠菌和白色念珠菌及光滑念珠菌的共培養(yǎng)生物膜，評估控制種植體周圍生物膜的天然中藥制劑的潛力。復(fù)雜的混合生物膜可能會對抗菌溶液的效果產(chǎn)生影響，因此復(fù)雜生物膜的組成必須考慮微生物間不存在拮抗關(guān)系，故設(shè)計使用了具有協(xié)同行為的共培養(yǎng)生物膜[13]。本研究結(jié)果顯示，沒食子水提物具有沿著細胞外基質(zhì)的擴散能力，并具有抗真菌作用，具有治療種植體周圍炎的潛力。

綜上所述，沒食子水提物具有抗生物膜活性，表明其具有治療植入物周圍炎的潛力。該研究結(jié)果可對中草藥的進一步探索提供方向，未來的研究需在更復(fù)雜的生物膜和體內(nèi)環(huán)境下分析沒食子的抗生物膜作用。