成天瓊，陳學農(nóng)

(1.遵義醫(yī)科大學 研究生院，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 針灸科，貴州 遵義 563099)

結(jié)腸癌(Colon cancer,CC)是世界上常見的侵襲性消化道腫瘤，隨著中國經(jīng)濟和生活方式的改善，中國的結(jié)腸癌發(fā)病率近年來總體呈上升趨勢[1-2]。盡管對治療方案的改進如靶向治療等已大大改善了結(jié)腸癌患者的臨床結(jié)局，但大多數(shù)患者由于局部復發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移而使治療失敗。因此，預測遠處轉(zhuǎn)移和不良預后的風險對結(jié)腸癌的治療至關重要。最近，越來越多的證據(jù)表明癌細胞的代謝與其來源的正常細胞有很大不同[3]。癌細胞中的葡萄糖代謝主要特征是葡萄糖攝取增加和有氧糖酵解增強[4]。糖酵解增強和谷氨酰胺分解是癌癥代謝重編程的主要標志，代謝重編程和低氧導致多種癌癥對傳統(tǒng)化療藥物的抵抗，這使癌細胞能夠維持較高的增殖速率并抵抗某些細胞死亡信號[5-6]，這種現(xiàn)象是發(fā)現(xiàn)新的治療靶標和新的抗癌藥物的焦點。除了提供細胞能量外，糖酵解的代謝中間體在大分子生物合成中也起著關鍵作用，因此在營養(yǎng)供應減少的情況下賦予了癌細胞更多的優(yōu)勢[4]。糖酵解的致癌調(diào)控和糖酵解成分的多方面作用表明了腫瘤糖酵解的生物學意義，有必要闡明結(jié)腸癌糖酵解的潛在機制?；诖吮尘埃狙芯坑脕碜訲CGA的結(jié)腸癌mRNA表達數(shù)據(jù)鑒定出與糖酵解顯著相關的231個mRNA，并開發(fā)了一個4糖酵解基因風險譜來有效地預測CC患者的預后，為CC的診斷和治療提供了新的靶標，可促進人類對CC發(fā)病機理的認識并提高診斷和治療水平。

1 材料與方法

1.1 臨床信息和mRNA表達數(shù)據(jù)收集 從TCGA(https://cancergenome.nih.gov/)中下載結(jié)腸癌患者的臨床數(shù)據(jù)和mRNA表達譜。一共包括473個CC樣本和41個相鄰的正常組織樣本。提取具有完整臨床信息的444例結(jié)腸癌患者資料，包括性別、年齡、TNM分期、生存時間和生存狀態(tài)等。

1.2 數(shù)據(jù)處理和風險參數(shù)計算進行基因富集分析 確定CC和正常組之間所鑒定的糖酵解相關基因集是否存在顯著差異。接下來，分析CC樣品和鄰近的非癌性組織中mRNA的表達水平，借助R語言limma包,以|log2|>1且P<0.05為篩選標準,提取差異表達的糖酵解基因。使用單變量Cox回歸分析確定與總體生存率(Overall survival,OS)相關的糖酵解相關基因，然后對其進行多變量Cox回歸以篩選與預后有關的糖酵解基因并獲得風險比(Hazard ratio,HR)。然后將篩選的糖酵解基因分為危險型(HR> 1)和保護型(0

1.3 統(tǒng)計學分析 使用Kaplan-Meier生存曲線和對數(shù)秩方法(Log-rank)估計風險參數(shù)的準確性。然后進行多變量Cox分析以檢測風險參數(shù)是否獨立于其它臨床特征，以上所有統(tǒng)計分析均使用R 3.6.1(www.r-project.org)進行，P<0.05具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 篩選預后相關糖酵解基因 首先，我們獲得了473例CC患者的臨床數(shù)據(jù)和mRNA的表達數(shù)據(jù)集。GSEA確定glycolytic process、hallmark glycolysis、reactome glycolysis三個糖酵解相關基因集在CC中上調(diào)(見圖1)。使用Wilcoxon秩和檢驗分析了473個CC和41個正常癌旁樣品中326個糖酵解相關基因的表達，并鑒定了231個差異表達的糖酵解相關基因(FDR<0.05，|log2FC|>1)。

A:glycolytic process;B:hallmark glycolysis;C:reactome glycolysis。圖1 正常組織和結(jié)腸癌組織3個糖酵解基因集的GSEA富集

對CC中326個差異表達的糖酵解相關基因的表達進行單變量Cox回歸分析，以鑒定預后相關的糖酵解差異表達基因。數(shù)據(jù)顯示，6個差異表達的糖酵解相關基因的表達與CC患者的OS相關(P<0.05)。接下來，進行多變量Cox回歸分析進一步確定STC2、ANKZF1、GPC1、PPARGC1A四個糖酵解相關基因為CC的獨立預后標志物。STC2,ANKZF1 和 GPC1是高風險基因，HR> 1是危險因素，患者生存率較低；PPARGC1A是保護性基因，HR <1是保護因素，患者生存率較高(見表1)。

表1 結(jié)腸癌中4個OS相關糖酵解基因

我們通過分析cBioPortal數(shù)據(jù)庫(http://cbioportal.org)中的526個CC樣品，評估了4個風險基因的改變。結(jié)果顯示，共42例(8%)的樣品查詢的風險基因發(fā)生突變。STC2基因、ANKZF1基因各在1.3%的病例發(fā)生錯義突變；GPC1基因在2.3%的病例中發(fā)生改變，表現(xiàn)為截斷突變、錯義突變和深度刪除；PPARGC1A基因在4%的病例中發(fā)生了改變(見圖2A)。相鄰的正常組織和CC組織之間的4個基因的表達差異的比較發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸癌組織中4個糖酵解基因中STC2(見圖2B)、ANKZF1(見圖2C)、GPC1(見圖2D)顯著上調(diào)；PPARGC1A(見圖2E)顯著下調(diào)。

A：526個結(jié)腸癌臨床樣本中選定糖酵解基因的改變；B-E：4種選定糖酵解基因的表達。圖2 鑒定與患者生存有關的mRNA

2.2 基于糖酵解基因標簽的預后風險評分模型的建立與驗證 通過線性組合所選基因的表達值，這些基因的權重由多變量Cox回歸分析的系數(shù)加權而來，我們建立了以下預后風險參數(shù)公式。風險參數(shù)= 0.0511×SCT2的表達+0.0806×ANKZF1的表達+ 0.0328×GPC1的表達+ (-0.2469)×PPARGC1A的表達。計算每個患者的風險參數(shù)，并使用中位數(shù)將患者分為高風險組和低風險組?；颊叩娘L險評分分布(見圖3A)和生存狀況(見圖3B)如圖所示。Kaplan -Meier曲線顯示，高風險分組的患者預后較差，而低風險參數(shù)組的患者死亡率較低(對數(shù)秩檢驗：P<0.001，見圖3C)。此外，熱圖顯示了4種mRNA的表達譜(見圖3D)，與低風險組相比，高風險組中風險型mRNA(STC2,ANKZF1和 GPC1)的表達水平更高。相反，高風險組中保護型mRNA(PPARGC1A)的表達水平低于低風險組。使用ROC曲線測量了5年OS的預后風險模型的預測性能，AUC值為0.704(見圖3E)。

A：患者的mRNA風險參數(shù)分布；B：結(jié)腸癌患者的生存狀況(紅點表示死亡的患者，藍點表示存活的患者；C：高風險分(紅線)和低風險分(藍線)患者的 OS 的 Kaplan-Meier 生存曲線；D：四個糖酵解基因表達譜的熱圖；E：ROC 曲線顯示結(jié)腸癌患者在5年 OS 時的 AUC 值，AUC=0.704。圖3 與風險參數(shù)相關的4糖酵解基因可預測結(jié)腸癌患者的OS

通過單因素和多因素分析將風險參數(shù)的預后價值與臨床病理參數(shù)進行比較。選擇具有完整臨床數(shù)據(jù)的樣品(見表2)，444名CC患者的中位年齡為69歲。在441例患者中，有76例(17.2%)患有Ⅰ期腫瘤，有178例(40.3%)患有Ⅱ期腫瘤，125例(28.3%)患有Ⅲ期腫瘤， 62例(14.0%)患有Ⅳ期腫瘤。我們將風險評分、TNM分期、年齡作為獨立的預后指標，因為這些因素在單變量(見圖4A)和多變量(見圖4B)分析中均有差異。值得注意的是，風險參數(shù)顯示出顯著的預后價值(P<0.001)。

表2 結(jié)腸癌患者臨床病理資料

Kaplan-Meier生存曲線和對數(shù)秩檢驗顯示高危組的患者預后較差，OS的單變量Cox回歸分析顯示了一些可預測CC生存的臨床病理參數(shù)，包括年齡，TNM分期和風險評分。然后，我們使用Kaplan-Meier生存曲線來驗證上述結(jié)論，該結(jié)論顯示出一致的結(jié)果，年齡大于65歲(見圖4C)，T3-4期(見圖4D)，M1期(見圖4E)，N1-2期(見圖4F)與預后不良相關。這些結(jié)果進一步證實了分析的可靠性。經(jīng)過進一步的數(shù)據(jù)挖掘和分層分析后，生存曲線未受年齡(≤65或者>65歲)的影響，可認為4個糖酵解基因是CC患者的可靠預后指標，其中高危組的患者預后較差(見圖5A)。在男女兩個亞組高風險評分組患者預后較差，基于糖酵解基因標簽的風險參數(shù)可用于預測CC患者的預后(見圖5B)。但是，當我們根據(jù)TNM將CC患者分為不同亞組時，風險參數(shù)不再可以單獨用作T1-2、N0和M1亞組的預后指標(見圖5C)，表明該風險參數(shù)受CC患者TNM分期的影響，這一點需要進一步探索。

A：單因素Cox；B：多因素Cox；C-F：風險評分分布與臨床參數(shù)之間的關系。圖4 CC患者OS的Cox回歸分析

A：年齡；B：性別；C：TNM分期。圖5 Kaplan-Meier曲線評估臨床特征分組患者的風險參數(shù)的預后價值

3 討論

最近的研究表明，年齡和轉(zhuǎn)移、分期等臨床病理特征不足以精確地預測癌癥患者的預后，于是越來越多的mRNA被鑒定為腫瘤進展或預后的生物標志物。例如Deepankar Chakroborty等[7]的研究表明L1TD1是結(jié)腸癌的預后標志；Piero Dalerba等[8]認為CDX2可作為II期和III期結(jié)腸癌的預后生物標志物；鄭紅等[9]的研究表明USP6不僅可作為結(jié)腸癌獨立預后因素，還促進結(jié)腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。然而，這些生物標記物，特別是單個基因表達水平可能受到多種因素的影響，不足以準確獨立地預測患者的預后，從而阻止了這些標記物被用作可靠和獨立的預后指標。因此，本研究使用由多個預后相關標志物組成的統(tǒng)計模型，結(jié)合每個組成糖酵解基因的預測效果以改善預測能力。在評估腫瘤患者的預后方面，該類模型比使用單一生物標志物準確[10- 11]，故這種模型得以廣泛應用。

高通量基因測序技術的飛速發(fā)展為大型生物數(shù)據(jù)研究奠定了基礎[12-13]，從單個標本中提取大量的基因組數(shù)據(jù)，可以鑒定新的診斷、預后或藥理生物標志物[14]。在最近的研究中，常常通過使用微陣列和RNA測序數(shù)據(jù)構建基因表達水平或突變新的預后標志，然后使用Cox比例風險回歸模型進行識別和驗證[15-16]。在當前的研究中，我們確定了3個在GSEA中顯示出顯著差異的糖酵解基因集。進行單因素和多因素Cox回歸分析最終確定出4種糖酵解基因組合對CC患者有預后預測價值。我們使用TCGA中的CC數(shù)據(jù)集收集糖酵解相關基因并比較正常和CC組織的數(shù)據(jù)。Kaplan-Meier生存估計顯示低風險參數(shù)的患者預后較好。但是，由于TCGA數(shù)據(jù)庫中缺乏患者的轉(zhuǎn)移和復發(fā)信息，我們只能使用OS評估患者的預后，這是我們研究的局限性之一。此外，在分層分析中，當我們根據(jù)TNM將CC患者分為不同亞組時，風險參數(shù)不再可以單獨用作T1-2、N0和M1亞組的預后指標，表明該風險參數(shù)受CC患者TNM分期的影響，這一點需要進一步探索。在這項研究中，用生物信息學方法探索mRNA危險因素的特征及其臨床意義，并探索了一種新的挖掘潛在預后標志物的方法。

腫瘤的特征在于不受控制的細胞增殖，這不僅消除了對細胞周期的控制，而且還促進了細胞能量代謝，最終導致腫瘤細胞的生長和分化[17]。早在1920年，德國生物學家奧托·沃伯格(Otto Warburg)發(fā)現(xiàn)了癌細胞中能量代謝的異常[18]。細胞能量主要來自糖代謝，大部分能量由ATP提供，盡管有氧氣，但腫瘤細胞主要依靠糖酵解來進行代謝，并消耗大量葡萄糖且伴有乳酸的產(chǎn)生。葡萄糖代謝異常的這種現(xiàn)象被稱為有氧糖酵解或Warburg效應[19]。很多惡性腫瘤中糖酵解增強,包括CC,其促進合成代謝,與腫瘤的發(fā)生發(fā)展息息相關[20]。研究表明，腫瘤細胞能量異常，可以通過調(diào)節(jié)底物的攝取和與糖酵解相關的酶來精確調(diào)節(jié)ATP的合成，使其適應營養(yǎng)微環(huán)境，滿足惡性增殖所需的能量和營養(yǎng)，并迅速增殖[21]。Sun等[22]的研究表明二氯乙酸逆轉(zhuǎn)糖酵解表型可在體內(nèi)外抑制轉(zhuǎn)移性乳腺癌細胞的生長。Xu等[23]報道了抑制癌細胞中糖酵解作用是克服與線粒體呼吸缺陷和缺氧有關耐藥性的新策略。最近的研究表明，有氧糖酵解在CC中起重要作用，白介素22通過靶向調(diào)控己糖激酶-2促進人結(jié)腸癌細胞有氧糖酵解和CC的進展[24]。NDRG2通過抑制糖酵解和谷氨酰胺分解抑制大腸癌細胞的生長和增殖[25]。有研究表明，酪蛋白激酶1δ(CK1δ)和酪蛋白激酶1ε(CK1ε)參與DNA復制、分化和凋亡，從而參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的調(diào)節(jié)。CK1δ/ε的特異性抑制劑IC261可以抑制結(jié)腸癌細胞的生長，并增加有氧糖酵解的水平，這是由p53依賴性方式調(diào)節(jié)的，表明靶向調(diào)控CK1δ/ε和糖酵解可能是結(jié)腸癌的另一治療方向[26]。但是，尚未建立基于糖酵解相關基因標簽的結(jié)腸癌預后評分系統(tǒng)。故我們使用生物信息學方法，確定了與細胞有氧糖酵解相關的基因(STC2、ANKZF1、GPC1和PPARGC1A)，并證明了其在CC中的預后價值。該風險評分模型還需要在多中心臨床試驗和前瞻性研究中進一步驗證。

STC2是一種分泌型糖蛋白激素，可調(diào)節(jié)許多生物學過程，包括細胞增殖、凋亡、腫瘤發(fā)生和動脈粥樣硬化[27]。最近的研究表明，STC2表達在多種腫瘤中上調(diào)，包括結(jié)腸癌， STC2過表達與晚期腫瘤分級、腫瘤浸潤、轉(zhuǎn)移和不良預后相關[28]。沉默STC2后，大腸癌細胞的生存能力、遷移和侵襲顯著降低[29]。ANKZF1促進結(jié)腸癌的血管生成，這可能解釋為什么ANKZF1上調(diào)與結(jié)腸癌的不良OS相關，ANKZF1可能是特異性的結(jié)腸癌的標志物，將來可能會用于個性化藥物[30]。GPC1外泌體及其調(diào)控性miRNA是檢測和靶向治療結(jié)直腸癌的特異性標志物[31]。PPARGC1A調(diào)節(jié)線粒體的生物發(fā)生，減少血管平滑肌細胞的衰老，通過協(xié)調(diào)參與葡萄糖和脂肪酸代謝的多種基因的表達,在代謝重編程中起著至關重要的作用[32],葡萄糖代謝和缺氧可以促進腫瘤進展。使用Kaplan-Meier分析和Cox回歸分析，我們發(fā)現(xiàn)高STC2、ANKZF1、GPC1表達結(jié)腸癌患者的OS較差。STC2、ANKZF1、GPC1、PPARGC1A可能是診斷和評估結(jié)腸癌患者預后的潛在腫瘤生物標志物。

總之，本研究基于4個糖酵解相關基因的表達水平構建了新的結(jié)腸癌預測風險評分模型，可預測CC患者的預后，較高的風險參數(shù)表明CC預后較差。這些結(jié)果為開發(fā)結(jié)腸癌細胞能量代謝為靶點的藥物及為結(jié)腸癌的臨床治療提供了新的思路和方法。