龍 丹，王 凱，郭丹丹，楊 梅，徐 麗，張陽(yáng)春，張春林

(1.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 耳鼻咽喉頭頸外科，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 病理科，貴州 遵義 563099)

全球范圍內(nèi)，頭頸鱗癌發(fā)病率在惡性腫瘤中居第6位[1]，吸煙飲酒是已被證實(shí)的致癌因素之一。近年研究證實(shí)感染高危型人乳頭瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)與頭頸鱗癌的發(fā)生密切相關(guān)，且頭頸鱗癌中HPV的感染率有逐年上升的趨勢(shì)[2-3]。因此，開展HPV陽(yáng)性頭頸鱗癌的基礎(chǔ)研究，對(duì)于頭頸鱗癌的防治十分必要。HPV陽(yáng)性頭頸鱗癌是一個(gè)獨(dú)特的腫瘤亞組，與HPV陰性頭頸鱗癌相比，具有明顯的臨床特征，如對(duì)放化療反應(yīng)敏感，預(yù)后較好等[4]。HPV陽(yáng)性頭頸鱗癌的生物學(xué)特性與HPV病毒直接或間接相關(guān)，眾多的癌基因及抑癌基因可能參與其中[5]，但是具體的調(diào)控機(jī)制并不明確。

生殖器形成抑制基因-1(Suppressor of morphogenesis in genitalia-1,SMG-1)是新近發(fā)現(xiàn)的一個(gè)重要的抑癌基因，屬于PIKKs家族，主要調(diào)控p53在G1期信號(hào)傳導(dǎo)通路，阻滯細(xì)胞周期，在DNA損傷修復(fù)中發(fā)揮作用，其異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[6]。有研究證實(shí)在喉鱗癌組織內(nèi)SMG-1的表達(dá)與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，SMG-1是預(yù)測(cè)喉癌預(yù)后的重要生物學(xué)指標(biāo)。抑癌基因啟動(dòng)子的異常甲基化可引起目的基因轉(zhuǎn)錄失活，參與調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展[7]。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNA methyltransferase1，DNMT1)可催化腫瘤的啟動(dòng)子甲基化反應(yīng)，DNMT1已發(fā)現(xiàn)在多種惡性腫瘤中均有異常表達(dá)[8]，但在HPV陽(yáng)性頭頸鱗癌中的意義仍未明確。不同于HPV陰性頭頸鱗癌，HPV陽(yáng)性頭頸鱗癌中抑癌基因的甲基化水平高于HPV陰性頭頸鱗癌[9-11]，HPV感染可能與腫瘤的甲基化相關(guān)。我們的前期研究也發(fā)現(xiàn)，HPV病毒可通過影響甲基化水平調(diào)節(jié)HPV陽(yáng)性頭頸鱗癌的生物學(xué)特性[12]。本研究通過對(duì)比HPV陽(yáng)性頭頸鱗癌及HPV陰性頭頸鱗癌中SMG-1和DNMT1的表達(dá)差異，探討HPV陽(yáng)性頭頸鱗癌中SMG-1和DNMT1的表達(dá)及臨床意義，篩選頭頸鱗癌預(yù)后的標(biāo)記物，并為進(jìn)一步的機(jī)制研究提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源收集 2014年6月至2017年12月就診于我院的頭頸鱗癌患者的石蠟組織標(biāo)本105例。所有石蠟標(biāo)本均經(jīng)10%的中性福爾馬林液固定，后由專業(yè)病理醫(yī)師以2014年WHO診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行HE染色切片診斷[13]。納入標(biāo)準(zhǔn)：原發(fā)灶病理確診為頭頸鱗癌；有完整的臨床資料及標(biāo)本；標(biāo)本質(zhì)量達(dá)到HPV-DNA的PCR檢測(cè)和免疫組化的檢測(cè)要求。排除標(biāo)準(zhǔn)：原發(fā)灶非頭頸部腫瘤；合并其他腫瘤；臨床資料缺失。

1.2 研究方法

1.2.1 HPV陽(yáng)性頭頸鱗癌的檢測(cè) 首先提取石蠟組織標(biāo)本切片5～10片，厚5 μm，面積100～250 mm2，將處理好的樣品裝于1.5 mL無(wú)菌離心管中，使用TaKaRa MiniBEST FFPE DNA Extraction Kit試劑盒提取樣本DNA，使用微量核酸測(cè)定儀進(jìn)行DNA濃度測(cè)定和DNA質(zhì)量評(píng)估，使用AmpliTaq GoldTMDNA Polymerase Kit試劑盒，PCR擴(kuò)增管家基因β-globin進(jìn)行DNA質(zhì)控檢驗(yàn)，檢驗(yàn)合格者則進(jìn)行HPV-DNA的檢測(cè)，使用GP5+/GP6+引物巢式PCR擴(kuò)增HPV-DNA(見表1)，再取10 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下對(duì)條帶拍照分析結(jié)果。所有石蠟組織標(biāo)本進(jìn)行免疫組化法p16蛋白檢測(cè)。HPV-DNA和p16均陽(yáng)性的頭頸鱗癌標(biāo)本確定為HPV陽(yáng)性頭頸鱗癌[14]。

表1 PCR擴(kuò)增β-globin 和 HPV-DNA所用的引物

1.2.2 SMG-1，DNMT1蛋白檢測(cè) 按照免疫組化Envision法將石蠟組織標(biāo)本烤片30 min，二甲苯10 min(2次)，按照酒精濃度梯度(100%，95%，80%，70%)進(jìn)行脫蠟水化，3%雙氧水室溫封閉8 min，純水沖洗干凈，采用0.01 mol/L檸檬酸高溫高壓法抗原修復(fù)2～3 min，冷卻至室溫，一抗(兔抗-p16，1∶400稀釋，Proteintech公司；兔抗-SMG-1，1∶1 000稀釋，Abcam公司；兔抗-DNMT1，1∶2 000稀釋，Abcam公司)4 ℃過夜孵育14～18 h，二抗(通用型羊抗兔鼠，福州邁新生物公司)室溫孵育15 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，干燥，封片，顯微鏡下觀察。

1.2.3 SMG-1，DNMT1蛋白表達(dá)結(jié)果判定 顯微鏡400倍光鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，每個(gè)視野至少含100個(gè)腫瘤細(xì)胞，計(jì)算陽(yáng)性率：即5個(gè)視野中陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞數(shù)的均值。SMG-1蛋白表達(dá)主要在細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)，DNMT1蛋白表達(dá)主要在細(xì)胞核，以細(xì)胞核/細(xì)胞質(zhì)染成黃棕色或黃褐色為陽(yáng)性細(xì)胞。DNMT1[15]和SMG-1[16]的表達(dá)均以半定量法將蛋白表達(dá)分為4個(gè)水平。DNMT1：陰性(-)，無(wú)染色或染色細(xì)胞低于5%，計(jì)0分；弱陽(yáng)性(+)，染色細(xì)胞為6%～25%，計(jì)1分；中強(qiáng)陽(yáng)性(++)，染色細(xì)胞為26%～75%，計(jì)2分；強(qiáng)陽(yáng)性(+++)，染色細(xì)胞大于75%，計(jì)3分。SMG-1：陰性(-)，細(xì)胞核/細(xì)胞質(zhì)無(wú)染色，計(jì)0分；弱陽(yáng)性(+)，細(xì)胞核/細(xì)胞質(zhì)淡黃色，染色細(xì)胞小于50%，計(jì)1分；中強(qiáng)性(++)，細(xì)胞核/細(xì)胞質(zhì)呈黃色/棕黃色，染色細(xì)胞小于40%，計(jì)2分；強(qiáng)陽(yáng)性(+++)，細(xì)胞核/細(xì)胞質(zhì)呈褐色/棕褐色，染色細(xì)胞大于40%，計(jì)3分。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 本實(shí)驗(yàn)采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，兩組間二分類資料比較使用χ2檢驗(yàn)，有序多分類資料比較使用R×C列聯(lián)表χ2檢驗(yàn)，對(duì)T<5超過1/5的分類資料比較使用Fisher精確概率法。兩組有序多分類資料的相關(guān)性分析使用Spearman秩相關(guān)系數(shù)。使用Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析，取α= 0.05，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 頭頸鱗癌中HPV的感染率 在頭頸鱗癌中HPV的總感染率為21.9%(23/105)，下咽癌中HPV的感染率為27.3%(3/11)，喉癌中HPV的感染率為21.0%(17/81)，口咽癌中HPV的感染率為33.3%(2/6)(見表2)。

表2 HPV在頭頸鱗癌中的感染情況

2.2 頭頸鱗癌中SMG-1和DNMT1的表達(dá) 與HPV感染的相關(guān)性頭頸鱗癌中SMG-1和DNMT1中的總陽(yáng)性率為(40.00%，67.62%)， HPV陽(yáng)性頭頸鱗癌中SMG-1陽(yáng)性率(21.74%)低于HPV陰性組(45.12%)，DNMT1陽(yáng)性率(86.96%)高于HPV陰性組(62.20%)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見圖1，表3)。

A: SMG-1,陰性；B: SMG-1,弱陽(yáng)性; C: SMG-1,中強(qiáng)陽(yáng)性；D:SMG-1,強(qiáng)陽(yáng)性；E：DNMT1,陰性；F: DNMT1,弱陽(yáng)性；G: DNMT1，中強(qiáng)陽(yáng)性；H: DNMT1,強(qiáng)陽(yáng)性。圖1 SMG-1,DNMT1在頭頸鱗癌中的表達(dá)(×400)

表3 SMG-1和DNMT1在頭頸鱗癌中的表達(dá)

2.3 SMG-1、DNMT1與頭頸鱗癌臨床特征的關(guān)系 所有納入的頭頸鱗癌患者均無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，經(jīng)R×2列聯(lián)表χ2檢驗(yàn)，SMG-1和DNMT1在N分期和腫瘤分期的差異性表達(dá)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，在性別，年齡，T分期和治療方式上表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見表4)。SMG-1與DNMT1表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(rs=-0.486，P<0.001，見表5)。

表4 納入的頭頸鱗癌患者臨床特征與SMG-1、DNMT1表達(dá)情況

表5 SMG-1與DNMT1表達(dá)的相關(guān)性

2.4 頭頸鱗癌中HPV感染、SMG-1和DNMT1表達(dá)水平與患者預(yù)后的關(guān)系 Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析的結(jié)果顯示，HPV陽(yáng)性頭頸鱗癌的5年生存率(87.0%)明顯優(yōu)于HPV陰性組的5年生存率(54.9%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.028)。頭頸鱗癌中SMG-1陰性組5年生存率(77.8%)明顯優(yōu)于SMG-1陽(yáng)性組的5年生存率(38.1%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.002)，且SMG-1陰/弱陽(yáng)性組的5年生存率(73.2%)優(yōu)于SMG-1中強(qiáng)陽(yáng)/強(qiáng)陽(yáng)性組的5年生存率(38.2%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.013)。頭頸鱗癌中DNMT1陽(yáng)性組5年生存率(71.8%)優(yōu)于陰性組5年生存率(41.2%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.030)，且DNMT1強(qiáng)陽(yáng)性組5年生存率(82.5%)明顯優(yōu)于陰/弱陽(yáng)/中強(qiáng)陽(yáng)性組5年生存率(49.2%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.007，見圖2)。

圖2 頭頸鱗癌中HPV感染、SMG-1和DNMT1表達(dá)與生存率關(guān)系

3 討論

頭頸鱗癌是常見的惡性腫瘤之一，占所有癌癥的3%～5%[1]，感染高危型HPV是其主要危險(xiǎn)因素之一[2]。HPV病毒通過感染人類黏膜上皮細(xì)胞，其癌蛋白E6和E7可分別導(dǎo)致p53和視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(Rb)腫瘤抑制蛋白失活，從而激發(fā)HPV相關(guān)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[17]。近年來(lái)，頭頸鱗癌中HPV感染率有升高的趨勢(shì)，進(jìn)行頭頸鱗癌中HPV感染的檢測(cè)也越來(lái)越被重視。目前，頭頸鱗癌中HPV的檢測(cè)方法尚未統(tǒng)一，不同的研究目的采用不同檢測(cè)方法，其中包括定量逆轉(zhuǎn)錄PCR，免疫組化，原位雜交，免疫印跡等，可分別用于檢測(cè)HPV的DNA，RNA及相關(guān)蛋白，聯(lián)合多種檢測(cè)方法可提高檢測(cè)效率。不同于宮頸癌，HPV相關(guān)頭頸鱗癌中HPV DNA病毒載量及mRNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)量均較低，往往需要輔以組織標(biāo)本才能完成HPV檢測(cè)。本研究使用PCR檢測(cè)HPV-DNA聯(lián)合p16免疫組化法檢測(cè)頭頸鱗癌患者的HPV感染情況，與HPV金標(biāo)準(zhǔn)E6/E7 mRNA的分析結(jié)果有一致性[14]，在頭頸鱗癌中測(cè)得HPV的總感染率為21.9%(23/105)，在口咽癌中HPV的感染率為33.3%(2/6)，在下咽癌中HPV的感染率為27.3%(3/11)，在喉癌中HPV的感染率為21.0%(17/81)，與Ni[14]和Gama[18]研究結(jié)果類似，其中口咽癌中HPV的感染率略低于我們前期研究[3]的結(jié)果，可能原因?yàn)楸狙芯拷M使用PCR檢測(cè)HPV-DNA聯(lián)合免疫組化檢測(cè)p16的方法，剔除了單純檢測(cè)HPV-DNA陽(yáng)性而p16陰性的假陽(yáng)性標(biāo)本及HPV一過性感染的樣本，增加了檢查特異性。HPV陽(yáng)性頭頸鱗癌相較于HPV陰性頭頸鱗癌具有對(duì)放化療反應(yīng)敏感，預(yù)后較好等的獨(dú)特的臨床特征[4]。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)[19]，HPV陽(yáng)性頭頸細(xì)胞株(UPCI-SCC-090，UM-SCC-47)相較于HPV陰性頭頸細(xì)胞株(FaDu，UM-SCC-4)對(duì)放化療更敏感。本研究組HPV的生存分析顯示HPV陽(yáng)性頭頸鱗癌的5年生存率(87.0%)明顯優(yōu)于HPV陰性組(54.9%)。因此，對(duì)HPV陽(yáng)性頭頸鱗癌的生物學(xué)機(jī)制研究是十分必要的。介于HPV的存在是頭頸鱗癌患者最重要的預(yù)后因素之一，眾多的癌基因及抑癌基因可能參與其中[5]，本研究組對(duì)SMG-1和DNMT1在HPV陽(yáng)性頭頸鱗癌中的表達(dá)進(jìn)行研究。

SMG-1是人體中重要的抑癌基因之一，屬于PIKKs家族的成員，參與生物學(xué)中多種機(jī)制調(diào)控，包括參與缺氧反應(yīng)，參與腫瘤壞死因子-α誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，修復(fù)DNA損傷反應(yīng)等，其異常表達(dá)與多種惡性腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[6,16]。Zhang等[20]報(bào)道在胃癌中miR-192和miR-215可下調(diào)SMG-1的表達(dá)而提高癌細(xì)胞的增殖和侵襲特性。周學(xué)軍等[21]報(bào)道在喉鱗癌中SMG-1發(fā)揮抑癌基因作用且SMG-1表達(dá)缺失的喉鱗癌患者預(yù)后良好。HPV陽(yáng)性頭頸鱗癌中SMG-1的報(bào)道較少，HPV病毒的癌蛋白E6可導(dǎo)致p53突變，造成DNA損傷及基因組不穩(wěn)定[17]，而p53受到其上游基因SMG-1的調(diào)控，提示SMG-1可能參與HPV相關(guān)頭頸鱗癌的發(fā)生發(fā)展。本研究中HPV陽(yáng)性頭頸鱗癌SMG-1陽(yáng)性率(21.74%)低于HPV陰性組(45.12%)，提示在HPV陽(yáng)性頭頸鱗癌中SMG-1表達(dá)下調(diào)。本研究納入的頭頸鱗癌患者中SMG-1表達(dá)隨著腫瘤N分期及腫瘤分期的等級(jí)提高呈下降趨勢(shì)，與周學(xué)軍[21]和Gubanova等[16]中頭頸鱗癌的研究結(jié)果相似，提示在HPV陽(yáng)性頭頸鱗癌中SMG-1表達(dá)可能與淋巴結(jié)浸潤(rùn)及腫瘤分期相關(guān)。SMG-1的生存分析顯示，頭頸鱗癌中SMG-1陰性組5年生存率(77.8%)明顯優(yōu)于SMG-1陽(yáng)性組(38.1%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.002)，與Gubanova[16]和Zhang等[19]的頭頸鱗癌結(jié)果相似，提示HPV陽(yáng)性頭頸鱗癌中SMG-1高表達(dá)者預(yù)后不良，SMG-1可能成為頭頸鱗癌患者預(yù)后的標(biāo)記物之一。

DNMT1是一種將甲基轉(zhuǎn)移至基因組DNA胞嘧啶核苷酸的酶，DNA的甲基化在表觀遺傳基因調(diào)控中起重要作用，異常的甲基化與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[8]。有研究證實(shí)HPV陽(yáng)性頭頸鱗癌中抑癌基因的甲基化水平高于HPV陰性頭頸鱗癌[9-11]，HPV感染可能與腫瘤的甲基化相關(guān)。本研究中HPV陽(yáng)性頭頸鱗癌DNMT1陽(yáng)性率(86.96%)高于HPV陰性組(62.20%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示在HPV陽(yáng)性頭頸鱗癌中DNMT1表達(dá)上調(diào)。相關(guān)研究報(bào)道在HPV陽(yáng)性頭頸鱗癌中存在RXRG[9]，EREG[10]，p16[11]等多種抑癌基因的異常甲基化及其沉默，與DNMTs密切相關(guān)。本研究組中SMG-1和DNMT1表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，提示SMG-1和DNMT1可能參與HPV陽(yáng)性頭頸鱗癌中抑癌基因的異常甲基化，調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展。頭頸鱗癌中DNMT1表達(dá)隨著N分期及腫瘤分期等級(jí)提高呈上升趨勢(shì)，提示HPV陽(yáng)性頭頸鱗癌中DNMT1表達(dá)可能與淋巴結(jié)浸潤(rùn)及腫瘤分期相關(guān)。DNMT1的生存分析顯示，頭頸鱗癌中DNMT1陽(yáng)性組5年生存率(71.8%)明顯優(yōu)于DNMT1陰性組(41.2%)，與Xue等[22]的頭頸鱗癌結(jié)果相似，提示HPV陽(yáng)性頭頸鱗癌中DNMT1低表達(dá)者預(yù)后不良，DNMT1可能成為頭頸鱗癌患者預(yù)后的標(biāo)記物之一。

在HPV陽(yáng)性頭頸鱗癌中，SMG-1與DNMT1表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，SMG-1和DNMT1均與頭頸鱗癌的預(yù)后相關(guān)，SMG-1高表達(dá)者預(yù)后不良，DNMT1低表達(dá)者預(yù)后不良，我們前期研究顯示[19]HPV陽(yáng)性頭頸細(xì)胞株對(duì)放化療敏感性強(qiáng)于HPV陰性細(xì)胞株。因此，本研究為進(jìn)一步的研究提供參考，在HPV陽(yáng)性頭頸鱗癌中，DNMT1可能通過調(diào)控SMG-1的表達(dá)，提高腫瘤對(duì)放化療敏感性，從而影響其預(yù)后，為后續(xù)研究探討DNMT1和SMG-1在HPV陽(yáng)性頭頸鱗癌中的作用機(jī)制提供依據(jù)。